反相高效液相色谱法优秀课件.ppt

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1、第1页，本讲稿共12页预备知识与气相色谱法的比较：流动相：由气相液相与经典的液相色谱法的比较：在经典的液相色谱法的基础上，引入了气相色谱法的理论，采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，实现了分析速度快，分离效率高和操作自动化，这种色谱技术称作高效液相色谱法。分类分配色谱（partition chromatography）吸附色谱(adsorption )离子交换色谱(ion exchange)尺寸排阻色谱(size exclusion)又称凝胶色谱 气相色谱只适合分析较易挥发、且化学性质稳定的有机化合物，而气相色谱只适合分析较易挥发、且化学性质稳定的有机化合物，而HPLCHPLC则适合则适

2、合于分析那些用气相色谱难以分析的物质，如挥发性差、极性强、具有生物活性、热稳于分析那些用气相色谱难以分析的物质，如挥发性差、极性强、具有生物活性、热稳定性差的物质。定性差的物质。第2页，本讲稿共12页实验目的实验目的1.学习高效液相色谱仪的操作2.了解反相液相色谱法分离非极性化合物的基本原理3.掌握用反相液相色谱法分离芳香烃类化合物方法原理方法原理选用颗粒很细的高效固定相，采用高压泵输送流动相，分离、定性及定量全部分析过程都通过仪器来完成。除了有快速、高效的特点外，它能分离沸点高、分子量大、热稳定性差的试样。根据使用的固定相及分离原理不同，一般将高效液相色谱法分为分配色谱、吸附色谱、离子交换色

3、谱和空间排斥色谱等。在分配色谱中，组分在色谱柱上的保留程度取决于它们在固定相和流动相之间的分配系数K：第3页，本讲稿共12页本实验：固定相：ODS-C18，流动相：甲醇水混合溶液分离组分：苯和甲苯的混合溶液流动相为非极性而固定相为极性物质的色谱称正相液相色谱法，以流动相为极性而固定相为非极性的色谱称反相液相色谱法。将固定液键合到硅胶表面上，即所谓的键合固定相。若将正构烷烃等非极性物质（如n-C18烷）键合到硅胶基质上，以极性溶剂（如甲醇和水）为流动相，则可分离非极性或弱极性的化合物。据此，采用反相液相色谱法可分离烷基苯类化合物。第4页，本讲稿共12页高效液相色谱仪高效液相色谱仪第5页，本讲稿共

4、12页DSC000017 HPLC第6页，本讲稿共12页液相色谱流程图液相色谱流程图PUMPDetectorWData station(Recorder)or Collection第7页，本讲稿共12页高压输液系统高压输液系统要求：流量稳定 精度在12%之间 压力平稳无脉动 往复泵压力有波动，所以柱前设缓冲装置（压力脉 动阻力器）流速可调 一般分析仪器：12mL/min 制备仪器：1020mL/min储液瓶高压泵（核心）过滤器压力脉动阻力器恒压泵：输出压力恒定，但流速随系统阻力变化恒流泵：流速恒定，压力随阻力变化第8页，本讲稿共12页1.注射器进样（隔膜进样）带压进样 停流进样 2.高压定量进

5、样阀（常用）图图 六通进样阀六通进样阀 泵柱进样排放泵排放进样柱进样系统第9页，本讲稿共12页色谱柱色谱柱发展趋势：填料粒度小 柱径小标准柱型：4.6mm或 3.9mm L:15-30cm填料粒度：5-10m装柱技术：干法：填料粒度大于20m时可用。湿法（匀浆法）：配成悬浮液。高压泵压入 色谱柱，洗净备用第10页，本讲稿共12页要求：要求：灵敏度高 噪音低 线性范围宽 响应快 死体积小，对温度和流速变化不敏感检测系统检测系统分类分类溶质型总体型紫外荧光电化学示差折光介电常数激光散射对组分的物理或物理化学特性有响应对试样和洗脱液总的物理或物理化学特性有响应通用型本实验采用紫外光度检测器第11页，本讲稿共12页1、用甲醇配成浓度分别为 30ug/mL和10 ug/mL 的混合标准 溶液。2、按下述色谱条件设定色谱仪：柱温：室温；流动相流速：A泵：甲醇，0.9 mL/minB泵：蒸馏水，0.1 mL/min泵最大压力：15 MPa检测波长：254 nm时间：6 min3、根据仪器操作条件，待基线稳定后，分别进标准样品和未知样品各10uL，获得标准样品和未知样品的谱图。4、以标准样品谱图为基准，作单点标准曲线，然后求出未知溶液中苯和萘的浓度。实验步骤第12页，本讲稿共12页