蛋白质检测(Lowry)--方法学验证.pdf

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1、LowryLowry 法检测蛋白质含量法检测蛋白质含量本法用于微量蛋白质的含量测定。蛋白质在碱性溶液中可形成铜-蛋白质复合物，此复合物加入酚试剂后，产生蓝色化合物，该化合物在波长 650nm 处的吸光度与蛋白质含量成正比，根据供试品的吸光度，计算供试品的蛋白质含量。1实验目的1.1 确保 Lowry 法的准确、可重复并耐用，为建立检验操作程序提供依据。2材料与仪器2.1 待测样品：蛋白纯化后样品2.2 实验试剂100g/ml 蛋白质标准液的制备：取 20.5mg BSA 蛋白标准品（中检所），加入注射水 2.05ml 溶解，即为 10mg/ml 的蛋白标储备液；在精密量取储备液液0.50ml

2、置 50ml 容量瓶中，用纯化水定容至刻度线，摇匀，即为100g/ml 的标准蛋白工作液。4%碳酸钠溶液：准确称取碳酸钠 4.00g，在容量瓶中定容至 100ml。0.8%氢氧化钠溶液：准确称取氢氧化钠 0.80g，在容量瓶中定容至 100ml。0.1mol/L酒石酸钾溶液：准确称取酒石酸钾 2.36g，在容量瓶中定容至 100ml。0.04mol/L 硫酸铜溶液：准确称取硫酸铜 1.00g，在容量瓶中定容至 100ml。酚试剂：取自质检部2.3 仪器：紫外分光光度计、移液器2.4 器具：移液管、试管架、一次性吸头、卷纸3实验步骤3.1 按照下表平行配置两份蛋白质标准品溶液：蛋白质浓度 g/m

3、l标准蛋白质加量 ml加水量 ml0001.01200.20.82400.40.63600.60.44800.80.251001.003.2 碱性铜溶液配制：按 4%碳酸钠溶液：0.8%氢氧化钠溶液：0.1mol/L 酒石酸钾溶液：0.04mol/L 硫酸铜溶液=50:50:1:1 的体积比进行配液（现用现配）；3.3 酚试剂：使用前，用纯水按体积比 1:1 稀释。3.4 取待测样品稀释至蛋白浓度在 50ug/ml 左右，取两支试管中，每管加入 1ml待测样品；3.5 在向每支试管中加入 5.0ml 的碱性铜溶液，混匀，静置 10min；3.6 向每支试管中快速加 0.5ml 的酚试剂，混匀，

4、室温静置 30min；3.7 使用紫外分光光度计测量每管溶液在波长 650nm 处的吸光度。4方法学验证4.1精密度实验：将样品按照需要稀释到线性范围内（约 50g/ml）后取 0.5ml再加入等体积 60g/ml 的蛋白标准品（0.5ml）。平行制备 7 份，按上述“3”方法操作，再分别检测其 OD650 吸光度，计算蛋白质浓度。序号加样后测定值原样测定值标准品浓度加样回收率1234567加样回收率平均值加样回收率 RSD%判断标准：测得的加样回收率的平均值要在 80%-120%之间，RSD3%。4.2稳定性实验：4.2.1 不同浓度的样品的回收率（40g/ml、60g/ml、80g/ml）

5、：将样品按照需要稀释到线性范围内（约50g/ml）后取0.5ml，再依次分别加入等体积的60g/ml、80g/ml、100g/ml 3 个浓度的蛋白标准品（0.5ml）。按上述“3”方法操作，再分别检测其 OD650 吸光度，计算蛋白质浓度。注：平行复孔加入标准品浓度加样后测定值原样测定值加样回收率40 g/ml60 g/ml80 g/ml判断标准：测得的加样回收率的要在 80%-120%之间。4.2.2 不同的供试样品浓度的回收率（样品稀释倍数 0、2、4）：将已知蛋白质浓度的样品按照需要分别稀释 0、2、4 倍后取 0.5ml，再依次分别加入等体积的60g/ml 浓度的蛋白标准品（0.5m

6、l）。按上述“3”方法操作，再分别检测其 OD650吸光度，计算蛋白质浓度。注：平行复孔样品浓度 g/ml标准品浓度加样后测定值加样回收率0 倍稀释60.00 g/ml2 倍稀释4 倍稀释判断标准：测得的加样回收率的平均值要在 80%-120%之间。4.3方法的重复性研究4.3.1 3 批不同样品的回收率：将样品按照需要稀释到线性范围内（约 50g/ml）后取 0.5ml，再依次分别加入等体积的 60g/ml 浓度的蛋白标准品（0.5ml）。按上述“3”方法操作，再分别检测其 OD650 吸光度，计算蛋白质浓度。注：平行复孔样品批次样品浓度 g/ml标准品浓度加样后测定值加样回收率160.00

7、g/ml23判断标准：测得的加样回收率的平均值要在 80%-120%之间。4.3.2三个人同一批次的样品的回收率：三个人分别同时操作，将样品按照需要稀释到线性范围内（约50g/ml）后取0.5ml，再依次分别加入等体积的60g/ml浓度的蛋白标准品（0.5ml）。按上述“3”方法操作，再分别检测其OD650 吸光度，计算蛋白质浓度。注：平行复孔姓 名样品浓度 g/ml标准品浓度加样后测定值加样回收率60.00g/ml判断标准：测得的加样回收率的平均值要在 80%-120%之间。5实验结果标准曲线的建立：以 0g/ml、20g/ml、40g/ml、60g/ml、80g/ml、100g/ml标准品的 OD650 吸光度的平均值作标准曲线回归方程：y=ax+b，标准曲线在20-100g/ml 浓度范围内均成线性相关，相关系数 R20.99。加样回收率的计算公式为：加样后测定值2-原样测定值加样回收率=100%标准品浓度