生殖医学研究锦囊 (21).pdf

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1、第四代试管婴儿-线粒体置换术线粒体是供能细胞器 线粒体通过三羧酸循环、氧化磷酸化为细胞提供ATP 包含少量DNA，即mtDNA双链闭合环状线粒体病影响多个器官Johns DR,N Engl J Med,1995mtDNA突变可导致200多种线粒体病10,000个人中至少有1个线粒体病患者已知致病mtDNA突变举例mtDNA突变疾病具体表现m.1778 GA,m.14484 TC,m.3460 GALeigh综合征（亚急性坏死性脑脊髓病）共济失调、惊厥、视力和听力损伤、发育迟缓亦能造成肌肉无力，病情进展快，多在发病几年内死亡m.3243 AG,m.3271 TC,m.13513 GA,MELAS

2、综合征线粒体脑肌病伴高乳酸血症和卒中样发作m.1555 AG,m.7445 AG耳聋感音神经性耳聋线粒体病无有效治疗手段 药物 Riboflavin Coenzyme Q Vitamin C Vitamin K Carnitine 物理疗法 饮食仅能对症治疗无有效手段父亲为线粒体病患者子代不患病母亲为线粒体病患者（所有线粒体均突变）每个子代均患病母亲为线粒体病患者（部分线粒体突变）子代可能患病，也可能不患病。子代患病严重程度不一，与线粒体突变比例相关。mtDNA为母系遗传Alan Diot et al.Biochm.Soc.Trans.2016线粒体病女性妊娠/助孕方式自然妊娠供卵PGDMRT

3、 胚胎植入前遗传学检测（PGT）：因存在异质性，所以并不能很好的筛选不携带异常mtDNA的胚胎 第四代试管婴儿Mitochondria Replacement Therapy(MRT)：线粒体置换技术，将母亲突变mtDNA进行置换，阻断线粒体病遗传MRT的总体技术路线GVT-生发泡移植MST-纺锤体移植PB1T-第一极体移植PNT-原核移植PB2T-第二极体移植MRT技术的分类基于减数分裂的进程1.纺锤体移植(MST)患者卵母细胞，携带突变线粒体供者卵母细胞，携带健康线粒体去核取出细胞核，注射到去核的供者卵母细胞中MST猴生长发育正常且mtDNA异质性稳定Tachibana et al,Nat

4、ure,2009 分离纺锤体时需要使用细胞骨架抑制剂，其对人类胚胎的安全性尚需评估 机械操作可导致纺锤体和胞浆提前激活，导致减数第二次分裂异常，重构后异常受精率高 需要借助于特殊的纺锤体观察系统纺锤体移植技术的局限性2.原核移植(PNT)患者卵母细胞，携带突变线粒体供者卵母细胞，携带健康线粒体双原核去除双原核取出双原核，注射到去核的供者受精卵中受精后PNT优势：核物质完整、有膜包被易于分离2.原核移植(PNT)囊胚形成率与对照组相当囊胚整倍体率与对照组相当PNT胚胎与对照组基因表达模式相似Lyndsey Craven,Nature,2010Louise A.Hyslop et al,Natur

5、e,2016PNT技术的局限性 分离纺锤体时需要使用细胞骨架抑制剂，其对人类胚胎的安全性尚需评估 双原核周围线粒体大量聚集，且双原核体积大，导致随原核一并移植的线粒体多 可能影响中心粒Tian Wang et al,Cell,20143.第一极体移植(PB1T)（基于纺锤体移植MST）PB1T小鼠生长发育正常且mtDNA异质性稳定Tian Wang et al,Cell,2014 人卵行PB1T PB1T重构胚胎的囊胚形成(42%)低于对照组(75%)重构胚胎诱导形成的ESC遗传学、表观遗传学与对照无明显差异Hong Ma et al,Cell Stem Cell,2017PB1T的特点 线粒

6、体含量低 易于分离 人卵的第一极体有比较高比例的退化或碎裂，利用率相对较低 基于MST的PB1T仍需使用细胞骨架抑制剂Tian Wang et al,Cell,2014 Hong Ma et al,Cell Stem Cell,2017优点缺点4.第二极体移植(PB2T)（基于原核移植PNT）Tian Wang et al,Cell,2014 PB2T小鼠生长发育正常且mtDNA异质性稳定PB2T的特点 线粒体含量低 易于分离 基于PNT的PB2T仍需使用细胞骨架抑制剂 极体与原核的染色体状态不同步 去除雌原核时使得与之紧密相连的中心粒也同时去除，导致重构受精卵只含有一个中心粒。用PB2替换雌

7、原核，一定程度上难区分雌、雄原核优点缺点5.Pre-pronucleus(PPN)PPN:受精后3.5-4小时（减数第二次分裂末期），尚未与第二极体完全分离的母核部分（时间窗提前）因其后形成雌原核，故称其为前原核(PPN)5.前原核移植(PPNT)要点：在减数第二次分裂末期将PPN与PB2一并取出，在体外等待其完全分离，可避免使用细胞骨架抑制剂6.基于PPNT的第二极体移植(new-PB2T)要点：在减数第二次分裂末期将PPN与PB2一并取出，用PB2置换PPN，无需区分雌、雄原核PPNT、new-PB2T 不影响胚胎的发育潜能PPNTNew-PB2TControlCollected MI o

8、ocytes13289147MII oocytes after IVM10266109Reconstructed zygotes39 51-2PN374983Good quality blastocysts10(27.03%)14(28.57%)24(28.91%)本课题组,Cell Res,27(6),2017人体外成熟的卵母细胞中行PPNTNoArray-CGHMtDNAcarryover1Euploid0.53%2Euploid0.19%3Euploid0.10%4Euploid0.49%5Euploid0.58%6Euploid0.28%7-X(p22.33-q28)1.83%8dup

9、(10)(q22.1pter),del(10)(q22.2qter),+14(q13.1qter)4.67%9del(1)(q23.3qter)0.69%Avg1.04%本课题组,Cell Res,27(6),2017胚胎发育潜能与对照组相比无差异平均0.36%人体外成熟的卵母细胞中行new-PB2T本课题组,Cell Res,27(8),2017第二极体置换后，胚胎发育潜能良好，线粒体残留量0.5%New-PB2T胚胎诱导ESC 核型正常 基因表达、甲基化水平与对照ESC相当本课题组,Cell Res,27(8),2017mtDNA异质性在ESC增殖和分化过程中保持稳定本课题组,Cell R

10、es,27(8),2017PPNT和new-PB2T的优势 胚胎发育潜能高，囊胚形成率高 无需使用细胞骨架抑制剂，保证胚胎安全性 不需要区分雌原核和雄原核且胚胎中心粒不受影响 细胞核与细胞质状态同步 同时应用PPNT和PB2可节约珍贵遗传物质第四代试管婴儿需要关注的问题第四代试管婴儿临床应用存在伦理争议 改变生殖细胞的遗传物质，属于germline therapy“三亲婴儿”挑战传统观念第四代试管婴儿应用于线粒体病 英国是世界上唯一法律明确允许MRT（MST、PNT）应用于临床（仅用于线粒体病）的国家 2015年法案通过，2017年HFEA通过第一例MRT申请 2016年4月于墨西哥诞生第一个MST婴儿，据报道婴儿健康，但FDA已警示，墨西哥随即禁止第四代试管婴儿的其它应用 异体卵母细胞线粒体置换，用于卵子质量差所致的不孕症（目前在多数国家不允许，2017年1月第一例婴儿在乌克兰诞生；希腊已开展临床试验并于2019年4月诞生该试验的第一例婴儿）自体干细胞线粒体移植（已有临床应用）第四代试管婴儿的适用条件：阻断线粒体病传递、基因缺陷所致受精障碍及早期胚胎发育潜能差 或 高龄所致卵母细胞质量下降（潜在应用）第四代试管婴儿的技术方法：MST、PNT、PBT、PPNT 第四代试管婴儿的伦理争议与合理应用小结感 谢 您 的 观 看Thanks for watching