中药缓控释给药系统的质量综合评价.doc

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1、6 中药缓控释给药系统的质量综合评价中药缓控释给药系统的质量评价体系包括制剂体外质量评价、体内评价及体内外释药的相关性考查。体外质量评价包括制剂学常规项目的检查，如片剂的外观、片重差异等，小丸的水分、圆整度、重量差异等，微球的外观特性、粒度分布、流动性等；定性检查，包括化学特征反应检识、薄层色谱检识等；指标成分的定量测定；体外释放度的测定。体内评价包括药代动力学、药效动力学、生物利用度。体外质量评价除体外释放度的测定外，其余检测项目与普通制剂相同，在此不再累述。6.1体外释放度的测定 释放度（releasing rate）是缓控释制剂中药物在规定介质中释放的速度和程度。释放度与溶出度（diss

2、olution rate）本质上是相同的，但在具体测定方法与条件方面两者有一定的差别。缓控释制剂的体外释放度测定是模仿缓、控释制剂在胃肠道内的运转状态及胃肠道环境制定的，是筛选缓、控释制剂处方和控制其质量的重要手段。 6.1.1体外释放度测定方法及判断标准转篮法（stirring basket method）与浆法(stirring paddle method)是两种最基本和最常用的释放度测定方法，对于大多数中药缓控释制剂，由于其有效成分含量低，宜采用小杯法测定。各种方法的仪器装置、测定方法及结果判断可参考中国药典（二部）附录溶解度测定法。中国药典和美国药典2000年版释放度测定方法及判断标准

3、对比见表6-1。美、日、德对缓控释制剂释放度测定的具体规定对比见表6-2表6-1 中美两国2000版药典中口服固体缓释制剂释放度测定对照表中国（CP2000）美国（USP24）装置1 转篮法2 浆法3 小杯法（相当于USP24中的方法7，既可用于缓控释制剂也可用于透皮给药系统）1 转篮法（stirring basket method） 2 浆法(stirring paddle method)3 往复筒法（reciprocating cylinder）4 流通池法（flow through cell、用于缓释制剂）5、6 用于透皮给药系统7 往复夹法（reciprocating holder两者

4、均适用）释放介质介质：首选脱气的新鲜蒸馏水温度：37体积：250、500、750、900、1000mL离子及离子强度：PH：表面活性剂：温度：37取样时间点及各时间点释药量释放全过程的时间不应低于给药的间隔时间，且累积释放率要求达到90%至少三个取样点：第一点开始0.5-2小时，用于考察药物是否有突释（累积释放量约30%）；第二点为中间取样时间t（累积释放约50%），用于确定药物的释药特性；最后取样点t（累积释放约75%），考察药量是否基本释放完全。至少三个时间点：最初时间点（early time point）,证明药物没有完全释放，保证用药安全性;中间时间点（middle time poin

5、t），应能较好地反映释药特性；最终时间点（final time point），应显示满意的释放量；判断标准除另有规定外，应符合下列有关规定：6片（个）各时间测得的释放量按标示量计算均应符合规定。如各时间测定值有1片（个）不符合规定范围但其平均释药量均符合规定范围，仍符合规定。如最后时间释药量有1片（个）低于规定值10%者，则另取6片（个）复试。初复试12片（个），其平均释药量均符合各时间规定范围，且最后释药量低于规定值10%者不超过2片（个），亦符合规定。6片（个）中每片（个）各时间测得的释放量按标示量计算均应符合规定；若有不符合规定者，另取6片（个）测定，两次测试的12片（个）平均释放量均符

6、合各时间规定范围，其中没有超出规定范围10%和低于最终释放量规定值10%的片（个），可判为符合规定；12片（个）测试仍不符合者，再取12片（个）测定，三次测定的24片（个）平均释放量均符合各时间规定范围，其中超出规定范围10%的片（个）2，且没有超出规定范围20%或低于最终释放量规定值20%的片（个），仍可判为符合规定。表6-2 美、日、德对缓控释制剂释放度测定的具体规定对照表美国日本德国在极端的生理条件下进行溶出实验在尽可能多的不同条件下测定3种PH条件下测定溶剂PH值1.0-4.0-6.0-7.4溶剂PH值1.2-4.0-6.8溶剂PH值1.2-4.0-6.8或7.4遇到难溶药物不用有机溶

7、剂而是加入表面活性刑(SDS)至少2种搅拌强度(50100200rmin)至少2种搅拌强度至少3次取样1h，t(50)，t(80)考察药品润湿性和离子强度的影响换用另种溶出方法测定(桨法、篮法互换)考察溶剂中加入表面活性剂或油性成分(如脂肪)的影响考察其它成分如酒、酶等的影响换用另种溶出方法测试6.1.2影响释放度的因素及其控制影响释放度的主要因素除药物制剂本身固有的性质外还可由溶出仪、溶出介质及取样引起，这些影响因素可分为流体动力学因素、溶出介质物理化学性质及固液介面动力学因素，详见表6-2。表6-2 影响释放度的因素影响因素流体动力学溶出介质理化性质固液介面动力学制剂性质药物与溶出介质的反

8、应样品位置、制剂形状、药物的溶解及崩解、颗粒大小及比重、处方辅料仪器系统搅拌装置的位置、搅拌速率、系统的振动和扭动、密合度、偏心率溶出介质多余介质的返回、介质的换用及介质的补充、介质中的气体表面张力、温度、PH值、体积介质中气体取样取样管位置6.1.2.1制剂性质的影响 制剂的固有性质主要是由制剂处方、工艺决定的，其中辅料的种类和用量是影响释放度的主要因素。可根据缓控释制剂的释药要求选用不同的辅料（阻滞剂、致孔剂、崩解剂等）来控制药物的释放，达到缓控释的目的。6.1.2.2仪器系统的影响6.1.2.2.1仪器系统的振动系统振动是释放度测定中的常见影响因素，分为系统振动和偶然振动。系统振动是由系

9、统中交流电源产生的振动，系统振动难以消除，对于同一制剂，最好采用同一型号的仪器，以减少系统误差。偶然振动是由于外界振动源通过水浴或溶出仪框架传递给溶出杯，从而影响制剂释放度的振动，如环境中的空调设备、风扇，同一工作台上的离心机、UV分光光度计、泵等。偶然振动会引起测定数据的不规则变化，应尽量避免，不容忽视。6.1.2.2.2偏心率偏心率是系统中影响制剂释放度的又一因素，偏心率是搅拌轴的旋转轴线与溶出杯的轴线之间偏离的程度，USP规定不得大于2mm，中国药典规定不得大于1mm。一般情况下，偏心率越大，释放越快，为避免偏心率引起的试验结果重现性差、稳定性低，测定之前必须对每个溶出杯进行定位，校准搅

10、拌器。6.1.2.2.3转动速度转动速度对制剂的释放度也有较大的影响，研究表明，转速的变化与释放速率基本上呈线性关系，搅拌速度一般在50-100r/min，浆法50r/min相当于转篮法100r/min。转速的选择要根据制剂的剂型特性及所选用的方法来确定。6.1.2.3溶出介质的影响6.1.2.3.1溶出介质的种类 新鲜蒸馏水应作为首选溶出介质，在USP中近500个品种的溶出度试验以水为溶出介质，其中只有一个出现了生物不等效性。其次，在水中加入盐酸或醋酸使其与人体胃酸环境相似的介质，与生物利用度也有较好的相关性。另一种是在水中加入缓冲剂，PH值一般为3.0-8.0，多采用PH7.4的缓冲液，F

11、DA规定以PH6.8代替PH7.4，此PH值与人体肠液相似，更符合药物经口服后的体内环境。对于水溶性较差的药物，可在介质中加入表面活性剂，如十二烷基磺酸钠(0.5%以下)，也可选择适宜的有机溶媒(如异丙醇、乙醇（浓度10%以下，不得超过30%）)与水的复合介质，最好不用氢醇类的溶出介质。选用表面活性剂或有机溶媒作介质，可能存在体内外不相关，并不能客观地反映制剂的体内生物利用度，要慎重选择这类介质的种类及其浓度范围。6.1.2.3.2溶出介质中的气体 在测定释放度时，溶出介质必须经脱气处理，以减少其中所溶解的气体对药物释放产生物理和化学的干扰。1 物理干扰影响筛网的孔隙率 当介质中的气体受热逸出

12、时，常常吸附于转篮、转轴或旋浆等表面，从而在转篮上形成一层气体屏障，减少转篮孔隙率，阻碍药物或小颗粒从转篮向杯中扩散。吸附在转轴或旋浆上的气体对药物的释放影响较小。影响介质流型 当温度升高时，气体在介质中的溶解度降低，气体以小气泡的形式释放，从下向上逸出，改变了介质的流型。吸附在容器壁上的气泡也能引起杯壁介质流型的改变。2 化学干扰 改变介质PH值 当以蒸馏水为介质时，溶解在其中的CO2引起介质PH的改变，尤其对PH溶解曲线变化大的药物，更不能忽视。在缓冲液中，溶入的气体对PH的影响较小。氧化 一些易氧化的物质在释放度的测定过程中，溶解在介质中的O2会明显影响测定结果。对易氧化的药物，必须进行

13、脱气操作，必要时可先通入惰性气体排除O2，再脱气处理。6.1.2.3.3溶出介质的温度 温度对释放度的影响大小取决于药物和制剂辅料的温度-溶解度曲线。人体温表正常温度为37，为了能更准确地反映体内的情况，各国药典均规定溶出介质的温度为37，中国药典规定溶出介质温度为370.5，6个溶出杯中的溶出介质温度误差在0.5范围之内，以保证数据的重现性。6.1.2.3.4溶出介质的体积 选择释放介质体积的一个重要标准是漏槽状态（sink condition），即药物所处释放介质的浓度远小于其饱和浓度，实际应用中，USP24中规定为小于饱和浓度的1/3。目前各国药典采用的释放度测定方法（流通池法除外），溶

14、出介质体积一般为500-1000ml，大多为900或1000ml，对于一些剂量小，有效成分含量低的药物，中国药典增加了小杯法，介质体积减少至100-250ml。6.1.2.4取样的影响 取样的位置对释放度的测定也有一定影响，溶出杯内的药物浓度可能不相同，中国药典规定的取样位置是在转篮或浆叶上端距液面中间，离溶出杯壁10mm处。小杯法取样点应在浆叶上端距液面中间，离杯壁6mm处。USP对取样点的要求与中国药典不相同，USP仅规定取样点在转篮顶部到溶出介质液面之间，距离杯壁不得低于1cm，但各次取样必须在同一位置。USP还规定取样时间必须控制在2%误差之内。 6.2 药代动力学研究中药药代动力学（

15、Pharmaxokinetics, PK）是利用动力学原理及数学方法，定量地描述中药有效成分、有效部位、单味中药或中药复方通过各种给药途径进入机体后的吸收、分布、代谢和排泄等过程的动态变化规律。通过中药缓释剂体内动力学研究，探讨制剂中有效物质在体内的释放规律、作用机理及药动力参数，有利于指导中药缓释剂处方的设计、制备工艺的优化和辅料的筛选，有利于拟定临床给药方案，确定给药剂量、给药间隔时间及疗程，从而提高中药制剂的质量和疗效，对实现中药的现代化有着重要的作用。对于中药缓释制剂的药代动力学研究，原则上应考虑：与普通制剂比较，中药缓释制剂除在体外溶出试验中具有缓释特性外，在体内也应有缓释特性。中药

16、缓释制剂可选用药代动力学方法或药效动力学方法证明其在体内的缓释特性。建议首选药代动力学的定量测定方法。对于确实无法建立符合生物样品分析要求的体内药物测定方法的，可采用药效动力学方法进行研究，但必须充分说明理由。用药效动力学方法进行研究时，必须严格遵循药理学试验设计的要求。对于动物实验，建议采用交叉设计。药效指标应客观，能定量，有明确的量效关系，能反映临床的主要适应证，并能确切地证实体内的缓释特性。药代动力学研究时，可选择缓释制剂和对应的普通参比制剂中至少一个相同的有效成分，该成分能够反映药物的主要药效。该成分的含量稳定，制剂中成分可控。并能够建立符合生物样品分析要求的体内药物测定方法。以中药有

17、效成分制备的中药缓释制剂的体内药代动力学研究，应参照化学药缓释制剂的要求进行。以中药有效部位制成的中药缓释制剂或以有效成分（或部位）组成的复方制备的中药缓释制剂的体内药代动力学研究，应选择至少一种能够反映主要药效的有效成分进行药代动力学研究，体内外试验应证明与普通参比制剂比较，具有缓释特性。6.2.1中药缓释剂药代动力学的研究方法及评价中药缓释剂药代动力学的研究方法与化学药品的药代动力学研究没有本质的区别，其方法分为有效成分的药代动力学方法和生物效应法（药理效应法、药物累积法、效量半衰期法）。6.2.1.1有效成分的药代动力学法（体内药物浓度法）本法适于化学成分比较明确的制剂，与化学药物的药代

18、动力学研究原理类似，常采用分光光度法、色谱法等测定中药已知成分在血、尿或其它组织的浓度，研究其在体内的吸收、分布、代谢、排泄。随着近年来分离分析检测方法的发展，血药浓度法具有简单、快速的特点,被广泛使用。但如果认为某种有效成分的动力学特点即可反映整个中药制剂的动力学特征，显然是过于简单化了。中药成分复杂，特别是复方中药，不同于结构明确、成分单一的化学药品，即使是单味中药也是由多种成分组成的小复方，有效成分难以确定。同一种有效成分在不同中药中所处环境不同，其药代动力学参数各异，庞志功等证明牡丹皮和徐长卿中丹皮酚的药动学参数有显著性差异。同种中药中的不同种有效成分，由于结构不同，其药代动力学参数也

19、不同。单一成分与其在药材或复方中的药动学参数不同，有人证明黄连素单体与黄连药材中黄连素的药代动力学参数有显著性差异。所检测成分并非是该制剂的唯一有效成分，并不能代表整个制剂的药动学。故在中药缓释剂的药动学研究中，观测指标的选择应以该制剂的功能主治为指导，尽量多地选用与功能主治直接相关的成分进行测定，以便更客观地反映制剂的整体药动学过程。6.2.1.2生物效应法生物效应法主要包括药理效应法、药物累积法(动物急性死亡率法)和微生物法，对于有效成分不明，缺乏微量、定量检测方法的制剂可采用此法。在中药缓释剂动力学研究中，应用最多的是药理效应法，由于缓释剂释药缓慢，其本身的毒性较普通制剂小，再加上中药的

20、毒性相对较低，在多数情况下难以测得动物的急性死亡率，用药物累积法测定中药缓释剂的动力学参数存在一定的难度；对于具有抗菌作用的中药，一般不要求制成缓释剂，故微生物法应用也较少。药理效应法符合中医药理论，体现了整体观念。虽然药理效应法从整体上反映该制剂的动力学特征，但也存在着缺点：生物个体差异大，测定方法准确度和精密度差，测定的参数具有一定的表观性。由于中药具有多作用的特点，实际上以某种药理效应强度为指标也并非能反映该制剂的动力学特征，指标不同，所得药动学参数可有较大差异，所以观察指标应是药物的主要作用，尽可能与临床用药目的一致。6.2.2中药缓释剂药动学研究存在的难点 中药缓释剂药动学研究在不断

21、向广度和深度发展，但在整个研究过程中存在着普遍的问题：血样的处理 药物成分从血样中的提取（分离、纯化、富集）是药动学（特别是用血药浓度法研究）的首要步骤，血样处理方法的选择直接关系到测定结果的准确性。中药是多成分的复杂体系，各成分的化学性质有较大的差异，如何将性质不同的化学成分同时分离、富集是首先要解决的问题。作者认为对于中药缓释剂，在不同的时间，其释放的药物的量和质不一定完全相同，同一种处理方法并非完全适于不同时间点的血清样品，这种观点有待商榷。中药有效成分含量低，服用后在体内经过一系列的变化（肝脏代谢、酶、细菌的分解、与血红蛋白结合等），使有效成分浓度进一步降低，由于缓释剂的释放是限速过程

22、，有效成分一旦释放，就很快在机体内发生各种变化，有时即使用灵敏度高的仪器也难以检测出来。中药成分复杂，各成分间相互影响，指标的选择存在一定的难点。6.2.3中药缓释剂药代动力学研究的发展趋势 中药缓释剂动力学的研究，应借鉴西药动力学原理和方法，吸取现代科学知识，在中医药理论指导下，不断进行理论和技术创新，采用多学科相互交差、相互渗透、集药理学、天然药物化学、分析化学各科所长，构建中药缓释剂动力学研究的理论与技术体系。随着现代科学技术的发展，中药缓释剂的药代动力学研究也取得了一些经验。由于有效成分药代动力学法与药理效应法各自存在着优缺点，目前，中药缓释剂的动力学研究正在向着药代动力学（Pharm

23、axokinetics, PK）-药效动力学（Pharmacodynamics, PD）即PK-PD相结合的模型方向发展。从整体动物、组织器官、细胞亚细胞和分子生物学四个水平进行药动学研究，阐明中药多成分、多靶点、多途径、多环节整合调节的特色。某些药中含有毒性成分，应分别针对有效成分和毒性成分进行动力学研究，有效成分呈现的疗效与毒性成分呈现的毒效，二者相伴存在，在中药缓释剂的研究中应引起重视。药代动力学-药效动力学相结合、有效成分-毒性成分动力学相结合的研究，将进一步解决中药制剂的有效性、安全性、可控性问题,对推动中药缓释剂的现代化、国际化起着举足轻重的作用。6.3 药效动力学中药复方成分复杂

24、, 不同于结构明确、单一成分的西药,各成分之间相互影响,同一种有效成分在不同中药中因所处环境不同,药代动力学参数各异,不同种有效成分在同种中药中由于结构不同,药动学参数也不同。因此不能以单一成分的血药浓度来表示该药的体内过程。药代动力学（Pharmaxokinetics,PK）-药效动力学（Pharmacodynamics,PD）（PKPD）相结合是较理想的模型,更能有效地解释中药多成分、多作用、多靶点发挥综合疗效的特征,体现药物在机体的作用规律及药物的动态变化规律。药效动力学（Pharmacodynamics,PD）6.4生物利用度与生物等效性（缓控释制剂人体生物利用度及其申报要点）生物利用

25、度（bioavailability, BA）是指药物吸收进入血液循环的速度与程度。生物利用度包括生物利用速度（extent of bioavailability, EBA）与生物利用程度（rate of bioavailability, RBA）两方面的内容。生物利用速度是指药物吸收进入体循环的快慢，可用吸收速率常数（Ka）或平均吸收时间（MAT）表示，常用达峰时间（tmax）比较制剂间吸收的快慢；生物利用程度指药物吸收进入体循环的多少，可用血药浓度-时间曲线下的面积（AUC）表示。生物利用度是衡量制剂疗效差异的重要指标，不同制剂 、不同药厂生产的同一制剂、同一药厂生产的同一制剂的不同批号间的

26、临床疗效都有可能不一样，大量研究表明，制剂的处方、制备工艺、给药途径等是影响制剂生物利用度的主要因素。生物利用度分为绝对生物利用度（F）和相对生物利用度（Fr），前者指同一药物经静脉注射与血管外给药进行比较，假定静脉注射的生物利用度为100%，后者指同种药物的不同制剂，在同一给药途径下进行比较。6.4.1缓控释制剂生物利用度研究实验设计缓控释制剂生物利用度研究是证明研究的缓控释制剂是否与普通制剂生物利用程度相等。考察缓控释特点，检查药物有无突释现象。缓控释制剂的生物利用度研究需进行单剂量试验与多剂量试验。6.4.1.1单剂量试验 单剂量试验考察缓控释制剂体内药物释放行为，评价与参比制剂吸收速率

27、与吸收程度的差异，考察体内吸收与体外释放的相关性。一般采用二处理（two treatment）、二周期(two period)、二顺序随机交叉试验。二处理也称处方间，即指受试制剂与参比制剂，二周期又称二阶段，二周期间称为洗净期（washout period），应大于药物的7-10个半衰期，通常为一周。二顺序指一组先服用受试制剂，后服用参比制剂，另一组先服用参比制剂而后服用受试制剂。6.4.1.2多剂量试验多剂量稳态研究用于考察在连续给药的条件下，受试制剂药物吸收速率、吸收程度及血药浓度波动情况，并与参比制剂进行比较，试验采用二处理、二周期、二顺序随机交叉试验，缓控释制剂按设计要求给药（如每天1

28、次或2次），若参比制剂为普通速释制剂、则按临床常规方法给药（如每天2次或3次），但两种制剂一天服药总剂量应相等，一般连服一定时间（不得少于待测药物7个半衰期）后，开始测定谷浓度，至少测3次，以确证达到稳态。连续3次谷浓度的采样时间应固定在每天同一时间，一般为每天早上给药前，6.4.1.3高脂饮食的影响试验高脂饮食影响试验是考察食用高脂饮食后服用受试制剂与参比制剂，比较其吸收速度与程度是否等效，评价食物对制剂生物利用度的影响。采用三处理、三周期、三顺序随机交叉试验，将受试者随机分为3组，第一、二组在食用高脂饮食后服用受试制剂与参比制剂，第三组空腹服用受试制剂。给药时，受试者至少禁食10小时，再食

29、用高脂早餐，立即用250ml水送服受试制剂或参比制剂，空腹组一般禁食10小时以上后，早上服药，4小时后统一进标准餐。6.4.2生物利用度的研究方法6.4.2.1血药浓度法6.4.2.2尿药数据法6.4.2.3药理效应法6.4.3影响生物利用度的因素 生物利用度不仅受剂型因素的影响，也受生物因素的影响，6.5实例肝苏缓释胶囊是由单味药赶黄草研制而成的，具有降酶、保肝、抗病毒的作用，其所含有效物质为有机酸类和黄酮类，没食子酸及槲皮素分别为其代表成分，动物试验表明没食子酸及槲皮素均有明显的药理活性，下面以肝苏缓释胶囊为例来探讨中药缓释剂的质量评价方法。6.5.1肝苏缓释胶囊的体外质量评价6.5.1.

30、1体外释放度的测定溶出介质的选择 赶黄草中的有机酸类、黄酮类在蒸馏水和酸性介质中的溶解度较小，达不到漏槽条件（投入药量不得超过溶解度的10%-20%）,而在PH=7.4磷酸盐缓冲液中能达到漏槽条件，故选择了PH=7.4磷酸盐缓冲液作为溶出介质。释放度测定方法的选择 在实验中曾对转篮法和浆法进行比较，用转篮法测定释放度的重现性较浆法好，又因样品较粘，用浆法样品易于粘杯底，搅拌效果不好，故选用转篮法测定其释放度。溶出条件： 转速：100rpm 温度：370.5 释放介质：经脱气处理的PH=7.4磷酸盐缓冲液900ml体外释放度中没食酸、槲皮素的含量测定方法测定波长的选择：将没食子酸、槲皮素的标准品

31、甲醇液在TU1001紫外分光光度仪上扫描测定其最大吸收波长，见图6-1、6-2：图6-1没食子酸紫外吸收光谱图 图6-2 槲皮素紫外吸收光谱图方法：将肝苏缓释胶囊投入转篮中，分别于1、2、4、6、8、10、12小时取样5ml(同时补加等量的溶出介质)，加乙酸乙酯萃取三次，每次10ml，合并萃取液，水浴蒸干，残渣加甲醇溶解成10ml，在分光光度仪上于275nm、370nm处分别测定其吸光度，计算其累积释放量。没食子酸标准曲线的绘制 精密称取没食子酸对照品0.0021 g，加甲醇溶解成25ml，分别精密吸取0.5、1.5、2.5、3.5、4.5ml于5个10ml的量瓶中，加甲醇稀释至刻度，分别于2

32、75nm处测定其吸光度，以浓度X为横坐标，吸光度Y为纵坐标绘制标准曲线。表6-4 没食子酸对照品的标准曲线数据试验号12345浓度（mg/ml）0.0042 0.01260.0210 0.02940.0378吸光度0.0580.151 0.246 0.3610.448直线回归方程为：Y=-0.00516+12.0958X r=0.9998，表明没食子酸对照品浓度在0.00420.0378mg/ml中线性关系较好。没食子酸稳定性的考查将浓度为0.0378mg/ml的对照品溶液于不同时间测定其吸光度,计算RSD，结果见表6-5：表6-5 没食子酸稳定性考查结果时间(h)06122448RSD(%)

33、吸光度0.4480.4500.4530.4510.4500.4没食子酸标准品溶液在48小时内吸光度RSD为0.4%,表明没食子酸标准品在48小时内较稳定。精密度考查将浓度为0.0378mg/ml的没食子酸标准品溶液在7530G分光光度计上连续测5次,计算吸光度的RSD。表6-6 没食子酸精密度考查结果试验号123 45RSD（%）吸光度0.4510.4490.4490.4500.4480.25从上表可知，RSD为0.25%，表明该仪器有较好的精密度。重现性考查没食子酸回收率试验:取溶出介质5ml，分别加入3个不同浓度的没食子酸对照品溶液1ml，加乙酸乙酯萃取3次，每次10ml，合并乙酸乙酯，水

34、浴蒸干，残渣加甲醇溶解成5ml，于275nm处测定其吸光度，计算回收率，结果如下：表6-7 没食子酸回收率试验结果试验号加入量(mg)测得量(mg)回收率(%)平均回收率(%)RSD(%)1 0.080.0803100.42 0.080.079499.230.160.159099.499.760.740.160.1613100.850.320.316599.860.320.319799.9从上表可知，RSD为0.7%，表明本法可行。槲皮素标准曲线的绘制 精密称取槲皮素对照品0.0024g，加甲醇溶解成25ml，分别吸取1、2、3、4、5ml于5个10ml的量瓶中，加甲醇稀释至刻度，于370nm

35、处测定其吸光度，以浓度X为横坐标，吸光度Y为纵坐标绘制标准曲线。表6-8 槲皮素对照品的标准曲线数据试验号 1 2345浓度（mg/ml）0.00960.01920.02880.03840.0480吸光度0.1470.282 0.4170.5490.681直线回归方程为：Y=0.0147+13.90625X r=0.99998，表明槲皮素浓度在0.00960.048mg/ml范围内线性关系良好。槲皮素稳定性的考查 将浓度为0.0384mg/ml的标准品溶液于不同时间测定其吸光度,计算RSD，结果见表6-9：表6-9 槲皮素稳定性的考查结果时间(h)06122448RSD(%)吸光度0.5480

36、.5500.5510.5490.5450.42槲皮素标准品溶液在48小时内吸光度RSD为0.42%,表明槲皮素标准品在48小时内较稳定。精密度考查 将浓度为0.0384mg/ml的槲皮素标准品溶液在7530G分光光度计上连续测5次,计算吸光度的RSD。结果见表6-10：表6-10 槲皮素的精密度考查结果试验号1234 5RSD（%）吸光度0.5490.5480.551 0.5520.5470.38从上表可知，RSD为0.38%，表明该仪器有较好的精密度。回收率试验 取溶出介质5ml,分别加入3个不同浓度的槲皮素标准品溶液1ml，加醋酸乙酯萃取3次，每次10ml，合并醋酸乙酯，水浴蒸干，残渣加甲

37、醇溶解成5ml，于370nm处测定其吸光度，计算回收率，结果见表6-11：表6-11 槲皮素回收率试验结果试验号加入量(mg)测得量(mg)回收率(%)平均回收率(%)RSD(%)10.050.049097.920.050.049398.630.100.098298.298.60.840.100.097797.750.150.149799.860.150.148699.1从上表可知，RSD为0.8%，表明本法可行。三批样品体外释放度测定结果表6-12 肝苏缓释胶囊体外释放度测定结果6.5.1.2鉴别、检查、含量测定方法同普通制剂相同。6.5.2肝苏缓释胶囊的体内评价6.5.2.1 肝苏缓释胶囊

38、在狗体内的药代动力学研究通过比较了肝苏缓释胶囊与肝苏颗粒的体外释放度后，表明肝苏缓释胶囊的释放明显慢于肝苏颗粒，由于没食子酸是肝苏缓释胶囊中的有效成分之一，为了考查体外释放度的变化是否导致肝苏缓释胶囊体内药代动力学的变化，故以没食子酸作为其中的一个特征成分，从而建立了狗服用肝苏缓释胶囊后血样的处理、没食子酸的含量测定方法，并比较了肝苏缓释胶囊与肝苏颗粒在狗体内的药动学过程。6.5.2.1.1 HPLC方法学考查仪器与试药 Agilent 1100型HPLC系统（惠普公司）；LD4-2低速离心机（北京医用离心机厂）；TGL-16G台式高速离心机（上海医用分析仪器厂）；XK96-A快速混匀器（江苏

39、姜堰市新康仪器厂）；肝苏缓释胶囊（自制，批号：，规格：0.28g/粒）；肝苏胶囊(自制,批号：,规格:0.26g/粒)；没食子酸对照品(中国生物制品检定所，批号：0831-9501供含测用)血清中没食子酸的含量测定方法 HPLC色谱分析法色谱条件：色谱柱：ODS-3柱（2504.6mm，5m）；流动相：乙腈：0.05%H3PO4(3：97)；流速：1ml/min；检测波长：275nm；柱温：40血清样品处理方法的考查 分别取空白狗血清0.5ml于3个离心试管中,各加入0.2mol/L的HCl 0.25ml,快速混匀,再分别加甲醇、乙酸乙酯、丙酮至5ml，快速混匀5min，低速离心（3500r/

40、min）10min，取上清液，供HPLC用。 图6-7 甲醇处理的空白狗血清色谱图 图6 -8丙酮处理的空白狗血清色谱图 图6-9 乙酸乙酯处理的空白狗血清色谱图由上图可知，用甲醇处理的血清样品杂质干扰最少，故选择用甲醇沉淀血清样品中的蛋白为最佳。血清样品的处理及测定空白血清样品的制备 精密吸取空白狗血清0.5ml,加2mol/L的HCl 0.25ml,快速混匀,再加甲醇至5ml,于快速混匀器上快速混匀5min,于低速离心机(3500r/min)中离心10min,取上清液,水浴蒸干，残渣加0.5ml甲醇溶解,高速离心(10000r/min)10min,取上清液,供HPLC用。含没食子酸标准品血

41、清样品的制备 精密吸取空白狗血清0.5ml,加没食子酸标准品适量,再加2mol/L的HCl 0.25ml,快速混匀,按空白血清样品的处理方法制得含有没食子酸的血清样品,供HPLC用。 图6-10 血清样品色谱图 图6-11含没食子酸的血清样品色谱图 图6-12 没食子酸对照品色谱图没食子酸在狗血清中的线性关系考查 精密吸取空白狗血清0.5ml于5个玻璃离心试管中, 加2mol/L的HCl溶液0.25ml,快速混匀,再分别加入浓度为0.1、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/ml的没食子酸(没食子酸)标准品溶液10l,再加甲醇至5ml,于快速混匀器上混匀5min，低速离心(3500r/min)

42、10分钟,取上清液,沉淀再加甲醇5ml,混匀、离心，合并上清液，水浴蒸干，残渣加1ml甲醇使溶解，高速离心（10000r/min），取上清液，分别精密吸取20l注入色谱仪,测定峰面积,以峰面积积分值Y为纵坐标,浓度X为横坐标,绘制标准曲线,计算回归方程。表6-13 没食子酸在血清样品中的标准曲线浓度（ug/ml）1.05.010.020.040.0峰面积12.27681105.14036234.17118470.64050950.57912计算得回归方程Y=-11.3310+24.07188X r=0.9999 ，表明没食子酸的血清样品浓度在1-40g/ml范围内线性关系良好。没食子酸在血清样

43、品中的精密度考查 分别精密吸取含没食子酸（20g/ml）的血清样品20l，连续进样5次，测定峰面积，计算RSD。表6-14 没食子酸在血清样品的精密度考查试验号1 23 4 5RSD（%）峰面积470.640474.231466.231475.265468.2350.86从上表可知，RSD为0.86%,表明该仪器的精密度较好。没食子酸在血清样品中的稳定性考查 将浓度为10g/ml的含没食子酸的血清样品于不同时间测定其峰面积，计算RSD：表6-15 没食子酸在血清样品中的稳定性考查时间（h）06 122448RSD（%）峰面积234.171228.142230.324232.315235.762

44、1.9结果表明没食子酸血清样品在48小时内较稳定，RSD2%。没食子酸在血清样品中的回收率 分别于0.5ml的空白血清中加入浓度为1、2、4mg/ml的没食子酸的标准品溶液10l，再加2mol/L的HCl 0.25ml，快速混匀，再加甲醇至5ml，于快速混匀器上快速混匀5min，于低速离心机(3500r/min)中离心10min，沉淀再加5ml甲醇，混匀、离心，合并上清液，水浴蒸干，残渣加1ml甲醇溶解，高速离心（10000r/min）10min，分别精密吸取上清液20l注入高效液相色谱仪，按上述条件测定峰面积，计算含量，得回收率。表6-16 没食子酸在血清样品中的回收率试验号加入量（ug）

45、测得量（ug）回收率（%）平均回收率（%）RSD（%）110.0 9.832 98.32210.0 9.79197.91320.019.85299.2699.541.77420.019.69898.49540.040.908102.27640.040.216100.546.5.2.1.2体内实验与结果方法 采用随机实验设计方法，将4只狗随机分为两组，禁食12小时，取空白血清，再分别灌胃肝苏缓释胶囊0.211g/kg、肝苏普通胶囊0.185g/kg(相当于16.67g生药,临床成人日用剂量20倍),灌胃后在规定的时间内取血5ml,室温放置30min,于低速离心机中离心10min,取血清样品2ml,再加2mol/L的HCl 1ml,快速混匀,加甲醇5ml,于快速离心器上快速混匀5min,低速离心,取上清液,再将沉淀加甲醇5ml,快速混匀5min,低速离心,将上清液合并,水浴蒸干,残渣加1ml甲醇使溶解,高速离心10min,取上清液,按上述色谱条件测定不同时间血清样品中没食子酸的含量。表6-17 单剂量口服肝苏缓释及普通胶囊后血清样品中没食子酸的平均经时血药浓度（mg/ml）时间