DNA实验设计方案-玉米基因组DNA的提取与转基因成分分析.doc

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1、生化实验技术实验设计方案实验项目：玉米基因组DNA的提取与转基因成分分析专业：生物工程 班级：101 日期：11月5日一、 实验目的：1、掌握提取植物组织基因组DNA的基本方法。2、掌握二苯胺法和紫外分光光度法测定DNA含量的原理和方法。3、学会转基因植物转基因成分的分析4、学习DNA的水平式琼脂糖凝胶电泳并学会操作。 5、掌握高速冷冻离心机、微量移液枪、水平电泳仪等仪器设备的使用。二、 实验原理：核酸是生物有机物体重的重要组成成分，在生物体中核酸常与蛋白质结合在一起。核酸分为DNA和RNA两大类，前者主要存在于细胞核内，后者主要存在于细胞质及核仁里。在制备核酸时，通过研磨破坏细胞壁和细胞膜，

2、使核蛋白被释放出来。苯酚可使蛋白质变性，蛋白质溶于酚相，DNA则溶于上层水相。将氯仿与苯酚混合使用，可减少酚相中因水的存在而造成DNA的少量溶解。95%乙醇可使核酸从水相中沉淀出来，用70%的乙醇洗涤可以除一些盐分，经Rnase降解RNA，可得较纯的DNA。DNA含量与纯度测定，目前常用紫外吸收法，利用核酸在260nm有吸收峰，根据公式DNA(g/mL)=A260*50*稀释倍数可计算出核酸DNA的浓度。由于蛋白质在280nm有吸收峰，可根据比值判断DNA纯度：A260A2801.8时，表明蛋白质含量偏高；1.8A260A2801.9时，表明样品较纯；A260A2802.0时，表明RNA或DN

3、A碎片较多。二苯胺法定量测定DNA的原理为：在强酸、加热条件下，可以使DNA中的嘌呤碱基与脱氧核糖间的糖苷键断裂，产生嘌呤碱基、脱氧核糖与嘧啶核苷酸。其中，2-脱氧核糖在酸性环境中成为w-羟基-r-酮基戊醛，此物与二苯胺反应生成蓝色化合物，在595nm处有最大吸收。DNA在40-400ug范围内光吸收值与DNA含量成正比。在转基因技术中，外源基因导入到植物体中时，通常使用花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子启动下游编码基因的转录。在染色体中，一个转录单位由启动子序列，编码序列和终止序列组成，常用终止序列是胭脂碱合酶（NOS）的编码序列的终止序列。这部分序列相对于被导入植物而言，属于外来基因序列，

4、所以非转基因植株不含该段核苷酸序列。针对CaMV35S启动子或NOS终止子序列进行分析，即可定性分析植株体是否为转基因品种。电泳（electrophoresis）是荷电溶质或粒子在电场作用下发生定向泳动的现象。核酸的分离和鉴定通常采用琼脂糖凝胶电泳。 不同大小、不同形状和不同构象的DNA 分子在相同的电泳条件下（如凝胶浓度、电流、电压、缓冲液等），有不同的迁移率，所以可通过电泳使其分离。琼脂糖凝胶电泳分离后的DNA可用溴化乙啶（EB）染色，在254nm波长紫外光照射下，呈现橙黄色的荧光。三、 实验仪器：离心机、冰箱、恒温水浴箱、紫外分光光度计、水平电泳槽、电泳仪电源、凝胶成像系统、量筒、移液管

5、、烧杯、玻璃棒、试管、离心管、容量瓶等四、材料与试剂（请写明具体配制方法及使用的量）：1、材料：玉米片2、试剂：（一）基因组DNA的提取和纯化 1.淀粉酶（可选），1500单位/mg-3000单位/mg蛋白质2.三氯甲烷（CHCl3）3.98%乙醇（C2H5OH）4.乙二胺四乙酸二钠盐 Na2EDTA（C10H14N2O8Na2）5.CTAB（C19H42BrN）6.37%盐酸（HCl）7.异丙醇（CH3CHOHCH3）8.蛋白酶K（可选），冷冻状态下约50单位/mg9.RNA酶（可选），不含DNA酶，冷冻状态下约50单位/mg10.氯化钠（NaCl）11.氢氧化钠（NaOH）12.TRIS（

6、C4H11NO3）13.淀粉酶溶液（可选）淀粉酶10mg/ML，不要灭菌。-20摄氏度保存，避免反复冻融14.CTAB-1提取缓冲液（PH8.0） 称取4.00gCTAB，16.38g氯化钠，2.42gTRIS，1.50gNa2EDTA，4.00gPVP-40，用适量水溶解后，调节PH，定容至200ml，高压灭菌。临用前按使用量加入巯基乙醇，使其终浓度为2%。15.CTAB-2提取缓冲液（PH8.0） 称取4.00gCTAB，16.38g氯化钠，2.42gTRIS，1.50gNa2EDTA，用适量水溶解后，调节PH，定容至200ml，高压灭菌。16.CTAB沉淀液（PH8.0） 称取1.00g

7、CTAB，0.50g氯化钠，用适量水溶解后，调节PH，定容至200ml，高压灭菌。17.氯化钠溶液（NaCl），1.2mol/L18.70%乙醇（C2H5OH）19.蛋白酶K溶液（可选）蛋白酶K约20mg/ml，无菌水溶解，不要灭菌，-20摄氏度保存，避免反复冻融20.RNA酶溶液（可选），RNaseA 10mg/ml，分装后-20摄氏度保存。21.TE缓冲液（PH8.0），TRIS0.01mol/L，Na2EDTA0.001 mol/L，用HCl或NaOH调节PH。设备和器材1 摇床2 离心机3 涡旋振荡器4 真空干燥器（二）紫外分光光度计法检测DNA纯度与含量 DNA标准液：100g/mL

8、 （三）二苯胺法测DNA含量DNA标准溶液：取标准DNA以0.01mol/L氢氧化钠溶液配成200g/mL。DNA样品液：（自己提取）控制其DNA含量在50100微克/毫升左右。二苯胺试剂：称取0.8克二苯胺试剂，溶于180毫升分析纯的冰醋酸中，再加入8毫升过氯酸（A.R，60%以上），混匀备用。临用前加入0.8毫升1.6%乙醛溶液（乙醛溶液应保存于冰箱，一周内可使用）。所配得的溶液应为无色。（四）DNA琼脂糖凝胶电泳Tris-硼酸-EDTA缓冲液（TBE缓冲液），pH8.3：称取10.78gTris，5.50g硼酸，0.93g EDTA-Na2溶于去离子水，定容至1000mL。琼脂糖：1g溶

9、于TBE缓冲液中加热配成100mL。0.05%溴酚蓝-50%甘油溶液（5Loading Buffer ）：取一定量的0.1%溴酚蓝水溶液，与等体积甘油混合而成。0.5g/mL溴化乙啶染色液：称取5mg溴化乙啶，用去离子水溶解，定容至100mL。从中取1mL，用无离子水稀释至100mL。（有毒，戴手套，通风柜内进行。）DNA Marker(五)PCR扩增CaMV35S启动子，基因Lectin序列1. 水2. 10XPCR缓冲液（不含氯化镁）3. 氯化镁溶液：25 mmol/L4. dNTP溶液:2.5 mmol/L5. 引物6. 正向引物：CaMV35S启动子（Genebank 编号：V0014

10、1）5-GCT CCT ACA AAT GCC ATC A-3反向引物：CaMV35S启动子（Genebank 编号：V00141）5-GAT AGT GGG ATT GTG CGT CA-37. 正向引物：玉米IVR基因（Genebank 编号：U16123）5-CCG CTG TAT CAC AAG GGC TGG TAC T-3反向引物：玉米IVR基因（Genebank 编号：U16123）5-GGA GCC CGT GTA GAG CAT GAC GAT C-3五、实验流程（技术路线）：破碎细胞CTAB-2法提取DNA氯仿异戊醇抽提去除蛋白质等杂质乙醇沉淀法收获DNARNase处理去除

11、RNA获得纯净的DNADNA检测和鉴定紫外法检测DNA纯度二苯胺法测DNA含量PCR扩增目标序列DNA琼脂糖凝胶电泳六、实验步骤：（一）基因组DNA的提取和纯化CTAB-1法A） 称取100mg样品至2ml Eppendorf离心管中，加入700LCTAB-1缓冲液，涡旋振荡混匀后于65温育30min，期间颠倒混匀离心管2次3次。B） 加入700L的三氯甲烷-异戊醇，涡旋振荡混匀后放置10min。期间颠倒混匀离心管2次3次；12000g离心5min。C） 转移上清液至1.5mL Eppendorf离心管中，加入0.6倍体积经4预冷的异丙醇，于-20下静置5min，12000g离心5min，小心

12、弃上清液。D） 加入70%乙醇1000L，倾斜离心管，轻轻转动数圈后，4下8000g离心1min，小心弃去上清液；加20L RNase A酶（10g/mL），37温育30min。E） 加入600L氯化钠溶液，65温浴10min。加入600L的三氯甲烷-Tris饱和酚，颠倒混匀后，12000g离心5min，转移上层水相至1.5mL Eppendorf离心管中。F） 加入0.6倍体积经4预冷的70%异丙醇，颠倒混匀后，于4下静置30min；4下12000g离心10min，小心弃去上清液。G） 加入1000L经4预冷的70%乙醇，倾斜离心管，轻轻转动数圈后，4下12000g离心10min，小心弃去上

13、清液；用经4预冷的70%乙醇按相同方法重复洗一次。室温下或核酸真空干燥系统中挥干液体。H） 加50L TE缓冲液溶解DNA，4保存备用。注：转移上清液时注意不要吸到沉淀、漂浮物和液面分界层。（二）紫外分光光度计法检测DNA含量与纯度将纯化的DNA溶液用TE（pH8.0）稀释至每毫升含5-50g DNA浓度范围，用TE（pH8.0）作空白对照，于紫外分光光度计上测定260nm、280nm吸收值，计算A260/A280的比值分析DNA的纯度，并换算出核酸的含量。（三）二苯胺法测DNA含量1、DNA标准曲线的制作取8支试管，编号，按下表加入试剂 管号 试剂ml01234567DNA标准液00.20.

14、40.81.01.21.62.0蒸馏水21.81.61.21.00.80.40二苯胺试剂44444444加毕，摇匀，于60恒温水浴中保温1小时，（或于沸水中煮沸15分钟，冷却测0D595nm值。）以光密度为纵坐标，DNA含量（g/mL）为横坐标，绘制标准曲线。2、样品的测定取2支试管，各加0.20.5毫升的待测液（内含DNA应在标准曲线可测范围之内）加蒸馏水稀释至2毫升，再加4毫升二苯胺试剂，摇匀，其操作步骤与标准曲线的制作相同。根据测得的光密度值，从标准曲线上查出相当该光密度DNA的含量，按下式计算出样品中DNA的百分含量。（四）DNA琼脂糖凝胶电泳1、琼脂糖凝胶液的制备称1g琼脂糖，置于三

15、角烧瓶中，加入100mL TBE缓冲液，瓶口扣上一小烧杯，加热至微沸，琼脂全部融化。取出摇匀，即为1%琼脂糖。2、凝胶板的制备置水平板于工作台面上，将样品槽模板（梳子）插进水平板上凹槽内，距一端约0.5cm。梳子底边与水平板表面保持0.5-1mm的间隙。待琼脂糖冷至65左右，小心地倒入托盘内，使凝胶缓慢地展开在水平板表面形成一层约3mm厚均匀胶层。静置0.5小时。待凝固完全后，用滴管在梳齿附近加人少量缓冲液润湿凝胶，双手均匀用力轻轻拔出样品槽模板，则在胶板上形成相互隔开的样品槽。将凝胶连同水平板放入电泳槽平台上。倒入PBS缓冲液直至浸没过凝胶面2-3mm。3、加样将待测DNA样品液与5Load

16、ing Buffer以4：1的体积比混合，用移液枪分别加人到凝胶板的加样槽内。每个糟加10L左右。加样时，使样品集中沉于槽底部。DNA Marker取5L直接进行加样。4、电泳加样完毕，将靠近样品槽一端连接负极，另一端连接正极，接通电源，开始电泳。样品进胶后，应控制电压降不高于5V/cm(电压值V/电泳板两极之间距离比)。当溴酚蓝条带移动到距离凝胶前沿约lcm时，停止电泳。5、染色将电泳后的胶取出，小心推至溴乙锭染色液中，室温下浸泡染色30min。6、观察与拍照小心地取出凝胶置托盘上，并用水轻轻冲洗胶表面的溴化乙锭溶液，再将胶板推至凝胶成像系统的样品板上，在紫外灯下进行观察。DNA存在的位置呈

17、现橘红色荧光，肉眼可观察到清晰的条带，拍照记录下电泳图谱。（五）PCR扩增PCR反应的总体积为25ul，反应体系见表。可以在不改变试剂浓度的情况下，适当扩大反应体系。试剂终浓度加样体积/ul样品DNA10-50ng1水15.910xPCR缓冲液（不含镁离子）1x2.5氯化镁溶液（25）1.5 mmol/L1.5dNTP溶液（10mmol/L）0.8 mmol/L2正向引物（5ummol/L）0.2 umol/L1反向引物（5ummol/L）0.2 umol/L1Taq酶（5IU/uL）0.5 IU0.1注：如PCR缓冲液中已经含有氯化镁，则氯化镁在反应混合液的终浓度应调整为1.5 mmol/L

18、。PCR对照使用具有溯源性的阳性标准物质作为对照。其他对照见GB/T 19495.1-2004。PCR反应参数PCR反应参数见下表，使用不同的PCR仪，可对参数做适当的调整。PCR参数表预变性10min，95扩增20s，9540s，54 for CaMV35S启动子 64 for 玉米IVR基因 40s，72循环数40最终延伸3min，72七、结果预测（查阅文献报告可能出现的结果）：研磨的样品不充分，使DNA不能释放完全出来，影响提取率。氯仿异戊醇抽提后离心时吸取上清液时，如果不小心吸入中间一层蛋白质，会使提取物杂质增加。搅拌时太用力使DNA细丝断。如果CPR扩增成功，产生226bp的PCR产物。七、参考文献1 2生物化学试验方法和技术主编：陈毓荃 科学出版社3生物化学实验技术教程主编：赵亚华 华南理工大学出版社4 国家标准，GB/T 19495.3-2004 转基因产品检测核酸提取纯化方法进行提取基因组，CTAB-1法提取玉米片基因组。5 国家标准，GB/T 19495.4-2004 转基因产品检测核酸定性PCR检测方法转基因植物DNA（CaMV 35S启动子)筛选检测方法6 国家标准，GB/T 19495.4-2004 转基因产品检测核酸定性PCR检测方法玉米物种特异性检测方法