现代分析测试技术光学显微技术精品文稿.ppt

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1、现代分析测试技术光学显微技术第1页，本讲稿共34页l12世纪初，阿尔海真磨制透镜。l1590年，詹森父子就制造出第一台放大倍数约为20倍的显微镜。l1610年意大利物理学家伽利略制造了具有物镜、目镜及镜筒的复式显微镜。l1611年开普勒阐明了显微镜的基本原理。l1625年，法布尔首先提出“显微镜”一词。l1628年前后舒纳在开普勒设计的基础上制造出近代显微镜。2.1 光学显微镜的发展历程光学显微镜的发展历程2第2页，本讲稿共34页l1665年，罗伯特胡克制造复式显微镜，140倍，观察细胞。l1684年，荷兰物理学家惠更斯设计并制造出结构简单的双透镜目镜-惠更斯目镜，是现代多种目镜的原型。已初具

2、现代显微镜的基本结构。3第3页，本讲稿共34页l19世纪70年代，德国的物理学家、数学家恩恩斯斯特特 阿阿贝贝提出了完善的显微镜理论，阐明了成像原理、数值孔径等问题，对显微镜发展的贡献最为卓著。*l20世纪中叶，人们采用短波长的光线作光源制造出荧光显微镜和紫外光显微镜，由于光源波长的缩短而提高了显微镜的分辨本领。4第4页，本讲稿共34页2.2 光学显微镜的成像原理光学显微镜的成像原理2.2.1 衍射的形成-光波相互之间的干涉作用 如如果果照照明明光光线线为为平平行行光光，在在狭狭缝缝中中间间连连线线上上的的每每一一点点可可以以看看作作是是一一个个光光源源，发发射射子子波波，由由于于这这些些子子

3、波波相相互互之之间间的的干干涉涉作作用用，光光的的能能量量分分布变得不再均匀。布变得不再均匀。5第5页，本讲稿共34页 屏幕上的P1点到狭缝上边缘的距离和它到狭缝下边缘的距离之差为一个波长。连线b上发出其他任意两列光波到达点的波程差均小于一个波长。狭缝上缘处发出的一个子波，和狭缝中央下方且紧邻着的点发出的第二个子波，二者波程差为半个波长，此时发生相干抵消。造成P1 点位于光强的谷底。6叠加效果叠加效果 第6页，本讲稿共34页 屏幕上的P2 点到狭缝上边缘的距离和它到狭 缝下边缘的距离之差为3/2波长。此点位于相干增强中心，为第一级衍射放大值。第二、第三和更高级的衍射极大值发生在波程差为半波长的

4、奇数倍处，而相干极小值发生在波程差为半波长的偶数倍处。7第7页，本讲稿共34页 由于衍衍射射效效应应，一个点光源在像平面上将形成一个具具有有一一定定尺尺寸寸的中央亮斑及其周围明暗相间的圆环的中央亮斑及其周围明暗相间的圆环所组成的所谓埃利斑埃利斑。通常以埃利斑第第一一暗暗环环的的半半径径来来衡衡量量其其大大小小。埃利斑约84%的强度集中在中央亮斑，其余则分散在第一亮环、第二亮环。由于周围亮环光强度比较低，一般情况肉眼不易分辨，只能看到中央亮斑。8第8页，本讲稿共34页点光源通过透镜产生的埃利斑第一暗环半径埃利斑第一暗环半径R R0 0为埃利斑半径与照明光源波长成正比，与透镜 nsin值（数值孔径

5、）成反比。9n：透镜物方介质折射率；：为照明光波长；：为透射孔径半角；M：为透镜放大倍数第9页，本讲稿共34页2.2.2 阿贝衍射成像原理阿贝衍射成像原理 l当物质小至可与光波的波长相比较时，不能把光线看当物质小至可与光波的波长相比较时，不能把光线看成是直线传播，而要考虑衍射效应；成是直线传播，而要考虑衍射效应；l显微镜中的光线总是部分相干的，因此显微镜的成像过程是显微镜中的光线总是部分相干的，因此显微镜的成像过程是个衍射相干过程。个衍射相干过程。10第10页，本讲稿共34页 德国物理学家阿贝最先用光的衍射相干涉理论解释了透射光显微镜的成像过程，与点光源衍射的区别在于成像的过程包括很多点光源的

6、干涉效应。衍射（散射）光干涉条件：衍射（散射）光干涉条件：11第11页，本讲稿共34页 平行衍射光束经透镜后会在物镜后焦面上会聚，产生衍射花样-夫夫琅琅和和费费衍衍射射花样花样。k=0，光程差为0，为直射光，聚焦在主轴上，为0级衍射斑-焦点。衍衍射射斑斑点点是由不不同同物物点点的的散散射射光光相相干干加加强强形形成成的的；从同一物点发出的散射光，在产生相应的衍射斑点后继续传播，在像平面上又相互干涉，形成图像，这个图像就是物像。12样品样品 物镜物镜 后焦面后焦面 像平面像平面 埃利斑埃利斑 第12页，本讲稿共34页阿贝成像原理分为两次干涉过程：阿贝成像原理分为两次干涉过程：1、平行光束遭到物的

7、散射作用而分裂成为各级衍射谱-由物变换到衍射谱的过程；2、各级衍射谱经过干涉重新在像平面上会聚成像点-由衍射重新变换到像(像是放大了的物)的过程。13第13页，本讲稿共34页物与像之间的相似性是由什么决定的呢？物与像之间的相似性是由什么决定的呢？物像是由直射光和衍射光互相干涉形成的，不让衍射物像是由直射光和衍射光互相干涉形成的，不让衍射光通过就不能成像，参与成像的衍射斑点越多，则物像与光通过就不能成像，参与成像的衍射斑点越多，则物像与物体的相似性越好。物体的相似性越好。遮蔽方法：最终图像：(a)(b)(c)(d)14（遮蔽夫琅和费衍射花（遮蔽夫琅和费衍射花样的一部分）样的一部分）第14页，本讲

8、稿共34页 由于衍射等因素的影响，显微镜的分辨能力和放大能力都受到一定限制。目前金相显微镜可观察的最小尺寸是200 nm，有效放大率最大为1500-1600倍。显微镜可实现放大原因的理解：（直线传播作图解释）15 阿贝成像原理真实地反应了光学显微镜的成像过程，但解释放大不够直观。第15页，本讲稿共34页2.3 光学显微镜的构造和光路图光学显微镜的构造和光路图16第16页，本讲稿共34页2.3.1 光学系统光学系统目镜、物镜、光源、聚光器:集中光线，包括聚光镜和孔径光阑。2.3.2 机械部分机械部分机架：底座和弯臂目镜筒物镜转换器载物台调焦机构17第17页，本讲稿共34页2.4 显微镜的重要光学

9、技术参数显微镜的重要光学技术参数 显微镜的光学技术参数包括：数值孔径、分辨率、放大率、焦深、视场宽度、覆盖差、工作距离等等。这些参数并不都是越高越好，它们之间是相互联系又相互制约的。18第18页，本讲稿共34页2.4.1 数值孔径数值孔径 数值孔径是物镜与被检物体之间数值孔径是物镜与被检物体之间介质的折射率介质的折射率和和半孔径角的正弦半孔径角的正弦之之乘积。乘积。NA是表示物镜分辨细节能力的参数，是判断物镜性能高低的重要标是表示物镜分辨细节能力的参数，是判断物镜性能高低的重要标志。志。19孔径角越大，进入物镜的光通量就越大，分辨率就越高。孔径角越大，进入物镜的光通量就越大，分辨率就越高。与物

10、镜的有效直径成正比，与焦点的距离成反比。与物镜的有效直径成正比，与焦点的距离成反比。物物 第19页，本讲稿共34页 根据阿贝成像原理，衍射光线反映了物体形貌的细节衍射光线反映了物体形貌的细节，因此一个物镜要反映物体的细节，必须能够接受尽量多的高阶衍射光线接受尽量多的高阶衍射光线。作为最低的要求，物镜必须能接收0级光和部分的一阶衍射极大值光线，如果能够能够全部接收一阶衍射光线，图像基本上不会失去细节全部接收一阶衍射光线，图像基本上不会失去细节。孔径角的影响孔径角的影响 20第20页，本讲稿共34页 样品的细节越微小（b的值越小）,P1会越远离P0，形成各级衍射极大值所需要的衍射角越大，越需要更大

11、口径的物镜去接收衍射光线，过于细小的物体会形成超过物镜接收能力的一阶极大值衍射光线，将无法成像。21第21页，本讲稿共34页 物镜接收衍射光线的能力也强烈地依依赖赖于于样样品品与与镜镜头头之之间间的的介介质质，如空气、水、玻璃和油等。显微镜观察时，若想增大NA 值，孔径角是无法增大的，唯一的办法是增增大大介介质质的的折折射射值值。基于这一原理，就产生了水浸物镜和油浸物镜率，因介质的折射率值大于1,NA值就能大于1。因此，数值孔径的概念更加能够有效地描述物镜的成像能力。折射率的影响折射率的影响22第22页，本讲稿共34页2.4.2 分辨率分辨率23第23页，本讲稿共34页 通常把两埃利斑中心间距

12、两埃利斑中心间距等于第一暗环半径R0时，样品上相应的两个物点间距离r0定义为透镜能分辨的最小距离，也就是透镜的分辨本领。24像平面像平面 第24页，本讲稿共34页 此时，两个光斑强度峰间的强度谷值比强度峰值低强度谷值比强度峰值低19时（最大值），这个强度反差对人眼来说是刚有所感觉。也就是说，这个反差值是人眼能否感觉出存在两个斑点的临界值。25第25页，本讲稿共34页 透镜的分辨本领（分辨率）是由物物镜镜的的NA值值与与照照明明光光源源的波长两个因素决定的，NA值越大，照明光线波长越短，分辨率就越高。可见光的波长在390-760 nm之间，最佳情况下，光学玻璃透镜分辨本领的理论极限可达200 n

13、m。26为什么？=90 n：1.33 /2第26页，本讲稿共34页2.4.3 放大率和有效放大率放大率和有效放大率放大倍数放大倍数 =物镜放大倍数物镜放大倍数 目镜放大倍数目镜放大倍数 人眼的分辨本领约是0.2 mm，光学显微镜分辨本领极限大约是0.2 m。有效放大倍数为0.2 mm/0.2 m=1000。为了减轻人眼的负担，所选用的相应的有效放大倍数略高些，根据上述原则确定光学显微镜的最高放大倍数是1000-1500倍。27 光学显微镜必须提供足够大的放大倍数，把它能分辨的最小距离放大到人眼能分辨的程度，相应的放大倍数为有效放大倍数：有效放大倍数：第27页，本讲稿共34页2.4.4 光学透镜

14、的像差光学透镜的像差 通通常常平平行行于于透透镜镜光光轴轴的的光光线线在在通通过过透透镜镜后后并并不不会会聚聚集集于于一一点点，而而是是会会聚聚成成一一个个模模糊糊的的斑斑点点或或称称弥弥散散圈圈。同样，一个物体通过透镜后也不可能形成完全相似的像，图像往往发生了变形。造成这些缺陷的主要原因是透镜本身存在的各种像差透镜本身存在的各种像差。28第28页，本讲稿共34页 一个物点散射的光束经过具有球差的磁透镜后，物像并不会聚一点，而分别会聚于轴向的一定距离上。1.球差球差 球差即球面像差，是透镜的不同部分对光有不同的会聚能力引起的。无论像平面在什么位置，都不能得到清晰的像，而是一个弥散圆斑。29第2

15、9页，本讲稿共34页2.色差色差 玻璃透镜对不同波长的光具有不同的焦距，即色差。30第30页，本讲稿共34页31球差，色差，球面透镜都存在，无法消除；组合透镜进行校正。第31页，本讲稿共34页3.像像域弯曲域弯曲 垂直于光轴的直立的物体经过透镜后会形成一弯曲的像面，称为像域弯曲像域弯曲；是几种像差综合作用过的结果。32第32页，本讲稿共34页2.5 样品制备样品制备 如果按照步骤划分，可以将样品制备分成取样、镶样、磨光、抛光、腐蚀五个部分。33第33页，本讲稿共34页作业：作业：1.1.阿贝成像原理。阿贝成像原理。2.2.解释球差和色差。解释球差和色差。3.3.为什么说光学显微镜的最大分辨率是为什么说光学显微镜的最大分辨率是200 nm200 nm。End第34页，本讲稿共34页