东吴大学微生物学系P教学实验室训练课程.ppt

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1、东吴大学微生物学系P教学实验室训练课程 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望生物科技風險nSARS，至民國九十二七月底止，台灣有669個可能病n有72之直接死因為SARS，負責第一線照護任務的醫護人員乏因職業而感染SARS者n台灣地區的SARS病百分九十自院內感染生物安全的目的n保護n實驗室操作人員（WORKERS）n實驗的產品（PRODUCTS）n實驗室維護人員（SUPPORTPERSONAL）n外部環境（ENVIRONMENT）生物安全防護n實驗操作

2、程序及技術（Practice）n安全設備（或稱初級防護）n硬體設施（或稱二級防護）內容n生物醫科技產業生物性危害n生物危害健康風險評估nP2實驗室規劃設計與空調n生物安全操作台、運作與檢測n生物安全實驗室操作規範n消毒與滅菌nP2實驗室之防護具使用n本系P2實驗室之規範生物醫科技產業生物性危害生物醫科技產業之概況n生技醫藥產業n生技農業產業n生技食品產業n生技特用化學品產業n生技環保產業n生技服務生物醫科技之相關安全衛生法規n勞工委員會n工安全衛生法n局限空間作業危害預防要點n農業委員會n基因轉移植物田間試驗管規範n國家科學委員會n基因重組實驗守則n環境保護署n遺傳工程環境用藥微生物製劑開發試

3、驗研究管辦法生物物質安全資表（BSDS）n挑選二十種目前國內常用的生物性物質n內容n生物物質與廠商資n生物成分辨資n健康危害資n致病情況、病資、主要症、宿主、傳播方式、潛伏期等n醫措施n實驗室危害n洩處方法n安全儲存方法n預防措施n存活n廢棄處置方法n運送資n法規資n其他資VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS-MATERIALSAFETYDATASHEETS(MSDS)-1nMATERIAL SAFETY DATA SHEET-INFECTIOUS SUBSTANCESnSECTION I-INFECTIOUS AGENTnNAME:Vibrio parahaemolyticusnS

4、YNONYM OR CROSS REFERENCE:N/AnCHARACTERISTICS:Gramnegativerod,halophilic,facultativeanaerobe,0.5-0.8mx1.4-2.4m.Pathogenicstrainsusuallypossesscharacteristichemolyticreaction(Kanagawaphenomenon)nSECTION II-HEALTH HAZARDnPATHOGENICITY:Gastroenteritischaracterizedbywaterydiarrheaandabdominalcramps;some

5、timesnausea,vomiting,feverandheadache;occasionallyadysentery-likeillnesswithbloodyormucoidstools,highfever,andhighWBC;openwoundsmaybecomeinfected;systemicinfectionanddeathrarelyoccurnEPIDEMIOLOGY:Sporadiccasesandcommonsourceoutbreaks,particularlyinJapan,SoutheastAsia,andNorthAmerica;occursprimarilyi

6、nwarmmonthsoftheyearnHOST RANGE:HumansnINFECTIOUS DOSE:Ingestion-106organismsnMODE OF TRANSMISSION:Byingestionofraworinadequatelycookedseafood,oranyfoodcross-contaminatedbyhandlingrawseafoodinthesameenvironment,orbyrinsingwithcontaminatedseawater;aperiodoftimeatroomtemperatureisgenerallynecessarytoa

7、llowmultiplicationoforganismstoinfectiouslevel;exposureofopenwoundtocontaminatedseawaterVIBRIO PARAHAEMOLYTICUS-MATERIALSAFETYDATASHEETS(MSDS)-2nINCUBATION PERIOD:Usuallybetween12-24hours,butcanrangefrom4-96hoursnCOMMUNICABILITY:Notcommunicablefromperson-to-personnSECTION III-DISSEMINATIONnRESERVOIR

8、:Marinecoastalenvironsarethenaturalhabitat;duringthecoldseason,organismsarefoundinmarinesilt;duringthewarmseason,theyarefoundfreeincoastalwatersandinfishandshellfishnZOONOSIS:NonenVECTORS:NonenSECTION IV-VIABILITYnDRUG SUSCEPTIBILITY:Sensitivetopenicillin,ampicillin,fluoroquinolones;strainsresistant

9、tomultipleantibioticshavebeenisolatednSUSCEPTIBILITY TO DISINFECTANTS:Susceptibletomanydisinfectants-1%sodiumhypochlorite,70%ethanol,2%glutaraldehyde,formaldehydenPHYSICAL INACTIVATION:SensitivetocoldnSURVIVAL OUTSIDE HOST:Shrimp-upto120days;swabs-72daysnSECTION V-MEDICALnSURVEILLANCE:Monitorforsymp

10、toms;confirmationbystoolcultureorcultureofsuspectedcontaminatedfood(105organisms)nFIRST AID/TREATMENT:FluidreplacementasnecessarynIMMUNIZATION:NonenPROPHYLAXIS:NoneVIBRIO PARAHAEMOLYTICUS-MATERIALSAFETYDATASHEETS(MSDS)-3nSECTION VI-LABORATORY HAZARDSnLABORATORY-ACQUIRED INFECTIONS:Atleast1reportedca

11、seoflaboratoryacquiredinfectionnSOURCES/SPECIMENS:Feces,infectedseafoodandseawaternPRIMARY HAZARDS:Ingestion,parenteralinoculation;importanceofaerosolhazardsnotknownnSPECIAL HAZARDS:NaturallyandexperimentallyinfectedanimalsareapotentialsourceofinfectionnSECTION VII-RECOMMENDED PRECAUTIONSnCONTAINMEN

12、T REQUIREMENTS:Biosafetylevel2practicesandcontainmentforactivitieswithculturesorpotentiallyinfectiousclinicalmaterials;animalbiosafetylevel2practicesandfacilitiesforactivitieswithinfectedanimalsnPROTECTIVE CLOTHING:Laboratorycoat;gloveswhendirectcontactwithinfectiousmaterialsisunavoidablenOTHER PREC

13、AUTIONS:GoodpersonalhygieneandfrequenthandwashingnSECTION VIII-HANDLING INFORMATIONnSPILLS:Allowaerosolstosettle;wearingprotectiveclothing,gentlycoverspillwithpapertowelsandapply1%sodiumhypochlorite,startingatperimeterandworkingtowardsthecentre;allowsufficientcontacttime(30min)beforecleanupnDISPOSAL

14、:Decontaminatebeforedisposal;steamsterilization,chemicaldisinfectionnSTORAGE:InsealedcontainersthatareappropriatelylabelledVIBRIO PARAHAEMOLYTICUS-MATERIALSAFETYDATASHEETS(MSDS)-4nSECTION IX-MISCELLANEOUS INFORMATIONnDate prepared:February,2001nPrepared by:OfficeofLaboratorySecurity,PHACnAlthoughthe

15、information,opinionsandrecommendationscontainedinthisMaterialSafetyDataSheetarecompiledfromsourcesbelievedtobereliable,weacceptnoresponsibilityfortheaccuracy,sufficiency,orreliabilityorforanylossorinjuryresultingfromtheuseoftheinformation.Newlydiscoveredhazardsarefrequentandthisinformationmaynotbeco

16、mpletelyuptodate.nCopyrightHealthCanada,2001生物醫產業可能發生的危害n生物性的危害n包括微生物、病毒等可能會造成過敏、免疫系統方面或致癌反應n產品所造成的危害n如員工當操作放射性物質時可能會於過之放射線物質，這些放射線物質亦可能經由當操作而污染環境n一般之製程危害n包括像是純化過程所使用之化學物質（腐蝕性或可燃性）、物因素（噪音、低溫）等生物性危害n微生物n包括人與動植物之病原體，如細菌、黴菌、病毒以及寄生蟲等。動物n實驗動物n噬咬、抓刮，或接觸動物血液、糞、毛髮、組織等而形成人畜共通疾病（zoonoses）。動物毛皮及液產生之過敏等n植物n植物性毒

17、物、過敏物等。生物性危害主要傳播方式n主要經由血液、體液（傷口）、空氣心、氣懸、攪拌、實驗動物噴嚏、動物咬傷與接觸等傳播方式所造成。空氣傳播n呼吸道進入的病原菌，往往是透過空氣或病人噴出的飛沫所造成n雖然許多微生物無法在乾燥的環境生存，但有些卻可以，如：結核桿菌、葡萄球菌及鏈球菌。空氣傳播之微生物n病毒n冠病毒(coronavirus)，如SARSn依波病毒(Ebola)n細菌n退伍軍人菌屬(Legionellaspp.)n炭疽病(Anthrax)n結 核 分 枝 桿 菌 屬(Mycobacterium tuberculosis)n腸桿菌(Clostridium botulinum)n鼠疫菌(

18、Plague，Yersinia pestis)n黴菌生物性危害所造成的疾病型態n感染（如肺結核、性感冒、退伍軍人症）n過敏（氣喘、過敏性肺炎）n中毒（毒素造成急性中毒等）所以需要防護與管理生物危害健康風險評估風險(risk)n為傷害、損毀或損失的機會，或是損失的可能性(likelihood)程。而可能性則是指造成傷害的事件或活動之發生機n對於人體健康而言，可以用死亡事故(fatality)、壽命預期損失(loss of lifeexpectancy)、事故發生的件、以及事件發生的速測。nRisk=ProbabilityofoccurrenceofhazardXmagnitudeofhazard

19、危害（hazard）與風險處尖銳物（如針頭）太粗心。遭針扎（物性）。遭針扎並遭到感染（生物性）。在開放式的工作台翻倒危害化學品。因化學品噴濺而灼傷（化學性）。在實驗室中飲食。吞食傳染性物質並致病（生物性）。風險分析與管理危害物質鑑定n蒐集並分析既有之危害物質的毒性或致病資n衡造成毒性效應之證據n決定該種毒性效應是否會發生在人現實的生活中危害物質對人體健康上的影響n急性與慢性的影響（acute and chroniceffects）n局 部 性 與 系 統 性 的 影 響（local andsystemiceffects）n可 逆 與 可 逆 的 影 響（reversible andirreve

20、rsibleeffects）偵測風險之病學研究敏生物性風險量化評估n生物病原體所造成的感染(infection)、疾病(illness)以及死亡(mortality)之風險的定方式表達生物危害與感染之影響評估n劑 反 應 評 估(Dose-ResponseEvaluation)n最小感染劑(minimuminfectiousdose)nID50，使50%以上的動物或人感染或出現某種疾病的癥的最低劑值生物危害與感染之影響評估n評估(ExposureEvaluation)：估算人體 於 環 境 中 危 害 因 子 之 強(intensity)、頻(frequency)以及持續時間之況n傳播介質中化

21、學物質或微生物之濃n(、大小、頻以及持續時間)n受體生物特性之化值(如體重、對化學危害物之吸收容、對生物病源體之免疫程)；微生物風險評估因素n致病n傳染途徑n穩定性n感染劑n濃n源n動物研究資n有效的預防或治方法n醫監控n作業人員的經驗與技術層次世界衛生組織的微生物危害分n風險第一級：低甚至會造成個人及社區大眾的健康風險，也就是微生物會造成人或動物的疾病n風險第二級：造成中的個人健康風險而對社區大眾的健康風險為低者。但是可以透過有效的醫處或預防措施減少危害的程，而感染的擴散風險也相當有限世界衛生組織的微生物危害分n風險第三級：造成高的個人健康風險及低的社區大眾健康風險，時常會造成人或動物嚴重的

22、疾病，但通常會透過散播而傳染他人，已有有效的醫處或預防措施減少危害的程n風險第四級：造成高的個人及社區大眾的健康風險，病原體會造成人或動物嚴重的疾病，而且會透過直接或間接途徑而傳染他人，醫處或預防措施並無法達到很好的成效生物危害分級舉例n第一級n為通常會引發人疾病者，如：Escherichia coliK10（大腸桿菌K10）與yeast（酵母菌）。n第二級n為可導致人疾病，通常會在群體間擴散，需要有效的預防或治措施者，如：Staphylococcus（葡萄球菌）與Candida（珠菌）。n第三級n為感染後可導致嚴重後果，具有傳染性，通常已有效的治或預防措施者，如：HepatitisBviru

23、s（B型肝炎病毒）與HIV（後天免疫全症候群病毒）n第四級n為可導致極嚴重的後果，具高傳播能，且幾乎無預防或治癒措施者，如：Ebolapox（依波病毒）微生物風險分級等級等級說明說明例子例子第一級危險群與人類健康成人之疾病無關nBacillus subtilisnEscherichia coli-K12nadeno-associated virus Type 1-4第二級危險群在人類所引起的疾病很少是嚴重的，而且通常有預防及治療的方法 nMeasles virusnSalmonellaenToxoplasma spp.nHepatitis B virusnVibrio第三級危險群在人類可以引起

24、嚴重或致死的疾病，可能有預防及治療之方法 nM.tuberculosis nSARS-associated CoronavirusesnHantaan virus nRickettsianYersinia pestis第四級危險群在人類可以引起嚴重或致死的疾病，但通常無預防及治療之方法 nEbola virus nMarburg virus風險評估先備知n生物性、化學性和物性危害的相關知n生物性、化學性和物性安全原則的認知n各種傳染性物質之傳播模式的解n實驗室中氣膠重要性之認知n那些操作程序會產生氣膠n何種方法能夠低或控制氣膠之產生n設備之安全特性n應接受哪些健康檢查n整合所有設施、器具、人員

25、、程序和危險物，以創造一安全的工作環境n實驗中相關作業之法規定危險群等危險群等級級生物安生物安全等級全等級實驗室實驗室類型類型實驗室實驗室操作規範操作規範安全設備安全設備 11基基礎礎教教學學、研研究究優良微生物學技術優良微生物學技術無，開放式工作檯無，開放式工作檯22初初級級衛衛生生服服務務、診診斷斷服服務務、研研究究優優良良微微生生物物學學技技術術加加上上防防護護衣衣、生生物物危害標誌危害標誌開開放放式式工工作作檯檯加加上上防防止止氣氣霧霧外外流流之之生物安全櫃生物安全櫃33特特殊殊診診斷斷服服務務、研究研究同同第第 2 等等級級加加上上特特殊殊防防護護衣衣、進進入入管管制及定向氣流制及定

26、向氣流生生物物安安全全櫃櫃及及（或或）其其他他所所有有實實驗驗室工作所需要之基本防護裝備室工作所需要之基本防護裝備44具具危危險險性性之之病病原體原體同同第第 3 等等級級加加上上氣氣密密門門、出出口口淋淋浴浴及及廢棄物之特殊處理廢棄物之特殊處理級級生生物物安安全全櫃櫃或或級級生生物物安安全全櫃櫃並並穿穿著著正正壓壓防防護護衣衣、雙雙門門高高壓壓蒸蒸氣氣滅菌器（穿牆式）及經過濾之空氣滅菌器（穿牆式）及經過濾之空氣病原體及其使用實驗室分級P2實驗室規劃設計與空調病原體，操作程序，操作人員n解生物危害病原體及其造成實驗室感染的危險性，以決定對實驗室操作人員，所需要提供的保護程n是實驗室內部或外部環

27、境，甚至是整體建物皆必須以負責之態整體考n將上述之解及研究或測試之程序，用危險性評估發展出完整的安全程序n斷思考安全實驗室的設計及選用最適當的設備，達成感染的最終目標n完整而持續的教育訓實驗室操作程序（LaboratoryProcedures）n遵守實驗室操作程序n標準操作程序適用於所有實驗室n特殊操作程序，則由各實驗室依據危險性評估，擬定適用於該實驗室安全之操作。故需由實驗室主管或安全委員會制定，且必須對實驗室人員嚴格實施教育訓初級防護（PrimaryContainment）n目的：保護操作者及其週遭環境n個人防護裝備n生物安全操作櫃（BSC）二級防護（SecondaryContainmen

28、t）n操作空間n適當的材質符合清潔及消毒之需求n由外界往實驗室定向的負壓氣nHEPA的裝設n生物安全操作櫃（BSC）n排氣與實驗室排氣實驗室運作與維護（LaboratoryOperationsandMaintenance）n實驗室的操作目標影響實驗室運作的性能特性與初級及二級防護空間、設備、附屬設施的維護實驗室規劃設計程n研擬需求n初步規劃n細部設計BSL-2 實驗室（P2）規劃設計重點n隔的設備：使用容產生大氣霧的磨碎機（Blender）、超音波細胞打碎機及心機等儀器時，應避免氣霧外洩，或把這些儀器放置在生物安全操作台n需設置生物安全操作台n需具備處污染物及廢棄物滅菌用之高壓滅菌器n實施安全

29、操作規範生物安全操作台n配置必須避免影響操作台作業開口部、入氣與下向氣所形成之氣屏障（AirCurtain）n配置應遠實驗室出入口及主要動線，亦應遠空調進氣口以避免擾動氣實驗室滅菌n污染台面與工具等消毒n當實驗室發生感染物質潑灑外洩，有污染疑慮或實施維護保養換材時，需進實驗室滅菌n一般採用氣體煙薰方式，有福馬（Formadelphyde）煙薰、過氧化氫（H2O2）、臭氧（O3）以及其他種方式n最普遍採用福馬煙薰實驗室的主要技術指標送風系統n全外氣空氣淨化系統還是循環回風空氣淨化系統，均應設置粗、中、高三級空氣過n一級和二級生物安全實驗室設淨化空調系統n第三級過器可採用亞高效過器。三級和四級生物

30、安全實驗室的送風末端應採用B或B以上高效過器(HEPA)實驗室性能確效、測試及系統設施認證n因BSL-3實驗室所進的實驗具有高危害性，故完工驗收時需嚴謹要求測試程序生物安全操作台、運作與檢測第二級生物安全操作台A1第二級生物安全操作台A2第二級生物安全操作台B1第二級生物安全操作台B2生物安全操作台之氣特性n櫃內氣體外溢n排氣至外界前應經過或消毒市售生物安全操作台常缺失n國外標準包括NSF49（NationalSanitationFoundation,NSF）及BSEN12469（BritishStandard,BS）均有針對生物安全櫃之認證與標準，但國內截至目前仍無相關的認證與確效標準國產生

31、物安全操作台性能測試結果工安全衛生研究所九十二之研究報告生物安全操作台運作事前準備n將所需要的物儘可能的先置於其內，以使台內的手部移動次能減到最小n實驗室內的人員活動(如快速移動，開關門等)也會干擾櫃內的空氣屏障n操作者應調整其所坐椅子的高n應在雙手置於操作間至少1分鐘之後才進動作n操作臺面前方的格開口應儘避免被手臂、紙張或試驗器具所阻礙n多餘的用品(如多餘的手套、培養皿、器具與培養物等)應在櫃外加以貯藏存放，在櫃內只應有工作期間所需要的物品n在開始工作之前安全櫃內的抽氣機，必須先開啟至少3至5分鐘，以淨化安全櫃內殘氣膠或微生物安全操作台運作操作n應遵守好生物性物質作業規範n台內的手部移動次能

32、減到最小、最少n台內移動手臂，動作要緩慢，方向要垂直於開啟門的表面，才能減低風險n操作必須在前方格開口後緣至少10公分的位置處進n小心避免培養成功的檢體之間交叉感染生物安全操作台運作操作n操作完之處理n將培養物移到培養或儲存的容器中n清除用的物質進滅菌，對於具危險性的物質要適當提防n假如要將設備移走時，以適合用於所含微生物之消毒劑擦拭，因為設備有可能受到污染n以適當的消毒劑擦拭工作區域n脫掉手套（如果有戴時）並丟至感染廢棄物桶中，洗手n使生物安全操作台繼續運轉至少5分鐘，以關掉電源之前驅除髒空氣，關上工作開口生物安全操作台運作操作n其他注意事項n試驗器具必須盡可能的放置在操作臺面後半段，產生氣

33、膠的藥品或設備(如混合器、心機)應置於臺面的最遠端n大型物件如生物安全防治袋，丟棄式吸管盒及安瓶應被放置在臺面的一角n潛在危害的物可被直接取出於安全櫃外，應事先經過消毒處程序n已受到污染的物應被放置於一個封閉的容器內，然後送入滅菌鍋執消毒處生物安全操作台運作操作n其他注意事項n集水槽（sump）應定期（如：每週一次）或在有物品溢出之後清潔，在生物安全操作台運轉時，將工作檯面抬起並用消毒劑清潔底面、格柵後面、空氣入口格柵、集水槽面、和可觸及的表面n可使用本生燈，因為會干擾氣，使用拋棄式接種環或以其他方式加熱。假如使用瓦斯燈時，將之接到生物安全櫃瓦斯開關的軟管應再加強、封上層膠帶。可以在生物安全櫃

34、中使用瓦斯罐，其他如瓦斯管線和插座可以經由工作入口進入生物安全櫃。生物安全操作台運作操作n消毒作業n在生物櫃操作臺面，機台內壁及視窗內部玻璃等都應使用70%濃的酒精加以擦拭n或是用1:100稀釋的家用的漂白劑(如0.055的鈉次氯酸塩，sodiumhypochlorite)，必須使用無菌水再進一次的清潔擦拭。或是使用其他消毒劑n該消毒的液體在被丟棄前須先進高溫消毒。已受污染的物必須被放入生物污染防治袋中或可丟棄式的器皿中，滅菌鍋內部須含有足夠的水份以確保蒸氣的產生。生物安全操作台運作操作n溢出物處n確認操作台仍在運轉n以適當的消毒水蓋住溢出的物質及鄰近區域，並且十分鐘內要接觸n消毒戴手套的手並

35、脫掉保護用的手套，受到污染時，將衣物進滅菌並洗淨雙手及手臂，穿戴上乾淨的手套及防護衣繼續進其餘的清潔步驟n的消毒之後，用吸水性材移除多餘的液體，並丟棄至要滅菌的容器中。n將培養瓶、培養盤和溢出物有關的固體物質丟棄到同一個容器中，對培養物質、培養液和在溢出物質附近的丟棄式器材進除污（或移除進滅菌）n以新製備的消毒水擦拭工作檯面、操作台工作區域及其他設備生物安全操作台n高效空氣過器（HighEfficiencyParticulateAirfilter，HEPA）的換及使用甲醛燻蒸等操作時，需在必移動生物安全操作台的情形下就可操作n每必需定期檢查一次，向實驗室內排氣之生物安全操作台，則每需檢查次n檢查項目：n風速、風試驗n密閉試驗nHEPA過器性能試驗參考資料n勞委會資料n衛生署資料