乙型病毒性肝炎的实验室检查.ppt

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1、乙型病毒性肝炎的实验室检查 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望我国我国HBVHBV感染概况感染概况一般人群HBsAg携带率高达7.18%；现有慢性HBV感染者约9 300万人，占全世界的1/4；其中慢性乙型病毒性肝炎患者超过 2 000万例，占全世界慢性乙肝患者的1/3；15岁以下儿童HBsAg携带率下降显著，1-4岁组仅为0.96%；1 4岁组HBsAb阳性率由1992年15.75%升至72.25%;抗HBcAb阳性率由1992年30.08%降至3.

2、76%；2HBVHBV基因组基因组HBV DNAHBV DNA是由是由长链长链L(L(负链负链)和和短链短链S(S(正链正链)组成的不完全双链环状组成的不完全双链环状DNADNA，短链的长度相当于长链的，短链的长度相当于长链的50%50%85%85%。HBV DNAHBV DNA长链载有病毒蛋长链载有病毒蛋白质的全部密码，有白质的全部密码，有4 4个开放读码个开放读码框架框架(ORF)(ORF)，分别称为，分别称为S S、C C、P P和和X X区区 。编码。编码7 7个蛋白质。个蛋白质。HBV DNAHBV DNA易发生变异，特别是前易发生变异，特别是前S S或或S S区基因较易突变。区基因

3、较易突变。嗜肝嗜肝DNA病毒的共同特点：病毒的共同特点：内含33.3kb松散环状、部分双链DNA基因组及DNA聚合酶；病毒的复制需逆转录过程。3HBVHBV抗抗原原和抗体系统和抗体系统表面抗原表面抗原(HBsAg)(HBsAg)：HBVHBV外膜糖蛋白外膜糖蛋白=S+L+M=S+L+M蛋白蛋白 S S蛋白：狭义的蛋白：狭义的HBsAgHBsAg指指S S蛋白。蛋白。HBsAg HBsAg阳性说明机体有阳性说明机体有HBVHBV感染。感染。中分子蛋白：中分子蛋白：preS2+SpreS2+S 大分子蛋白：大分子蛋白：preS1+preS2+SpreS1+preS2+SS蛋白蛋白中分子蛋白中分子蛋

4、白大分子蛋白大分子蛋白PreS1PreS1PreS2PreS2S S1.HBsAg1.HBsAg和抗和抗-HBs-HBse e抗原抗原(HBeAg)(HBeAg)：是可溶性蛋白质是可溶性蛋白质只存在于血液中只存在于血液中是病毒复制和传染性的标志是病毒复制和传染性的标志e e抗体抗体(抗抗-HBe)-HBe)：对对HBVHBV感染有一定的保护作用感染有一定的保护作用其出现标志着病毒复制减少、其出现标志着病毒复制减少、传染性降低传染性降低前前C区区C区区前前C/C 蛋白蛋白HBeAgHBcAg表达表达切割、加工切割、加工HBeAg只存在于血清中只存在于血清中HBV C基因基因分泌到细胞外分泌到细胞

5、外2.HBeAg 2.HBeAg 和抗和抗-HBe-HBe5HBV HBV 的三种形态的三种形态1,Hepatitis B virion(Dane particle)2,secreted filament3,secreted sphere67HBV HBV 自然复制周期自然复制周期8生物化学检测生物化学检测1HBV血清标志物的检测血清标志物的检测2HBV 分子生物学诊断分子生物学诊断3HBV临床药物疗效检测临床药物疗效检测4HBVHBV感染的实验室检查感染的实验室检查1.1.乙型肝炎的生物化学检乙型肝炎的生物化学检测测主要指标：ALT,AST,ASTm，血清白蛋白，血清胆红素，胆碱酯酶,甲胎蛋

6、白,凝血酶原时间(PT)及部分凝血因子；9方法学的发展方法学的发展ELISA：灵敏性高，成本低，适用于普通病人筛查；胶体金免疫层析法胶体金免疫层析法(金标法金标法)：简便易行，可用于急诊病人快速检测；化学发光法定量检测：化学发光法定量检测：价格昂贵，可用于HBVMs为临界值的病人的确证；可间接反映宿主HBV的复制水平，在评价抗病毒治疗的病毒学应答、疗效和判断预后方面有重要意义。新增检测指标新增检测指标PreS1、PreS2及其相应抗体对乙肝两对半的新认识对乙肝两对半的新认识102.HBV HBV 血清标志物检测血清标志物检测11HBVHBV血清标志物检测方法的成本效果分析血清标志物检测方法的成

7、本效果分析(1)(1)12HBVHBV血清标志物检测方法的成本效果分析血清标志物检测方法的成本效果分析(2)(2)Back13TerminalTerminal proteinproteinSpacerSpacerReverseReverse TranscriptaseTranscriptase(RT)(RT)RNaseHRNaseHrt1rt1rt344rt344preS1preS2Ss1s266HBsAgXMutation of S&Pre-SS基基因因“a”决决定定簇簇 G 145 R 变变异异，与与抗抗-HBs 的亲和力降低的亲和力降低S 基基因因变变异异可可导导致致隐隐匿匿性性HBV

8、感感染染(occult HBV infection)，表表现现为为血血清清HBsAg 阴阴性性，但但仍仍可可有有HBV 低低水水平平复复制制(血清血清HBV DNA 常常 105 copies/ml,ALT 2 ULN;HBeAg 阴性，HBV DNA 载量 104 copies/ml,ALT 2 ULN;HBV DNA持续阳性，年龄40岁，ALT大于正常上限，也可给予抗病毒治疗；HBV DNA持续阳性，年龄40岁，ALT持续正常，应密切随访，动态观察疾病进展，必要时行肝组织检测，有病变证据时，可以给予抗病毒治疗；23HBV HBV 感染抗病毒治疗的疗效评估感染抗病毒治疗的疗效评估治疗终点：治

9、疗终点：HBV DNA 明显下降或低于检测下限，并伴有ALT正常；HBV DNA 水平治疗开始后3个月内持续下降1 log以上才说明治疗有效；每日0.5mg恩替卡韦治疗1年时,HBeAg 阳性和阴性慢性乙型肝炎患者HBV DNA 检测不到率分别为67%和90%,恩替卡韦的HBeAg转换率为21%,与其他口服抗病毒药相似。并不以HBeAg转阴或HBsAg转阴为治疗终点或目标。24HBV DNA HBV DNA 定量检测试剂盒的性能对比定量检测试剂盒的性能对比2526同时可以实现对同时可以实现对HCV,HIV-1,衣原体，及淋病的一体化检测衣原体，及淋病的一体化检测Back病病毒毒基基因因突突变变

10、疾病进展疾病进展临床表现临床表现对对干干扰扰素素应应答答耐耐药药变变异异生生化化学学改改善善HBeAg血血清清学学转转换换HBV DNA清清除除急急性性乙乙型型肝肝炎炎慢慢性性乙乙型型肝肝炎炎肝肝硬硬化化(LC)肝肝细细胞胞癌癌(HCC)27HBV基因型基因型/基因亚型基因亚型分型方法分型方法优缺点优缺点序列测定法序列测定法最最直直接接，最最可可信信，是是HBV基基因因分分型型的的金金标标准准，但但繁繁琐琐费费时时而而且且价价格格昂昂贵贵，混混合合型型检检测测能能力力差差，不不适适于于大大样样本本检测。检测。聚合酶链反应聚合酶链反应-限制性片限制性片段长度多态性分析法段长度多态性分析法(PCR

11、-RFLP)较较测测序序法法简简便便，适适于于大大样样本本检检测测，但但由由于于需需要要进进行行酶酶切切，所所以以操操作作仍仍较较为为繁繁琐琐，成成本本较较高高，并并存存在在酶酶切切不不彻彻底底等等问题。问题。pre-S2单克隆抗体酶联单克隆抗体酶联免疫测定免疫测定(mAbs EIA法法)简简单单、快快速速，已已商商品品化化，适适于于大大样样本本检检测测，但但检检测测费费用用较较高高并并不不能能有有效效鉴鉴别别有有些些混混合合型型感感染染和和HBsAg低低表表达达及某些表位表达不充分的标本。及某些表位表达不充分的标本。分子探针杂交法分子探针杂交法简简单单、快快速速，对对混混合合型型检检测测非非

12、常常敏敏感感，已已商商品品化化，适适于于大大样样本本检检测测，但但检检测测费费用用较较高高而而且且灵灵敏敏度度和和特特异异度度还还有有待提高。待提高。型特异性引物型特异性引物PCR法法简简单单、快快速速，成成本本低低，具具有有较较高高的的灵灵敏敏度度，适适于于流流行行病病学研究和临床大样本检测。但特异度还有待提高。学研究和临床大样本检测。但特异度还有待提高。常用常用HBV基因分型方法比较基因分型方法比较28B B型型特异性特异性“引物对引物对”的特异度分析的特异度分析B型型特异性引物特异性引物HB（正义链）：（正义链）：5-ACC GTG AAC GCC CAC MGG AA-329Back4

13、.HBV 4.HBV 临床药物治疗监测临床药物治疗监测乙肝病毒的耐药性检测，是精准治疗乙肝的关键！目前由于治疗不够规范，造成我国目前超过95%的乙肝患者发生耐药、病毒变异、病毒耐药，变异检测势在必行！拉米夫定是第一个被批准治疗慢性乙型肝炎的口服抗病毒药,已在全世界广泛应用。但其耐药发生率高,治疗1年时耐药发生率为23%,2年为46%,3年为55%,4和5年分别为65%和71%。30耐药耐药-核苷核苷(酸酸)类似物类似物(NA)治疗失败最重治疗失败最重要原因要原因31拉米夫定拉米夫定LMV阿德福韦酯阿德福韦酯ADV替比夫定替比夫定LdT恩替卡韦恩替卡韦ETVHBV替诺福韦替诺福韦TDVNAs：抑

14、制病毒复制抑制病毒复制长期使用长期使用耐药变异耐药变异临床耐药临床耐药表型耐药表型耐药基因耐药基因耐药耐耐耐耐药药研究研究研究研究323334PolymerasePolymeraseTerminalTerminal proteinproteinSpacerSpacerReverseReverse TranscriptaseTranscriptase(RT)(RT)RNaseHRNaseHrt1rt1rt344rt344逆转录酶逆转录酶 (RT)(RT)区某些位点变异与耐药相关区某些位点变异与耐药相关preS1preS2HBsAgs1s266可同时分析：耐药变异，可同时分析：耐药变异，HBsAg

15、变异，基因型，血清型变异，基因型，血清型全长全长RT区分析技术路线区分析技术路线HBV DNAHBV DNA 提取提取提取提取snPCRsnPCR扩增扩增扩增扩增RTRT区区区区 PCR PCR 产物直接测序产物直接测序产物直接测序产物直接测序生物信息学分析与数据信息挖掘生物信息学分析与数据信息挖掘生物信息学分析与数据信息挖掘生物信息学分析与数据信息挖掘血清与资料收集血清与资料收集血清与资料收集血清与资料收集Neg.BCkb可同时分析：耐药变异，可同时分析：耐药变异，HBsAg变异，基因型，血清型变异，基因型，血清型35小小 结结36更新了对乙肝两对半结果的认识；Pre-S1的临床价值和应用；HBV DNA检测的临床价值和意义；HBV耐药株和耐药位点筛查方法的建立。37报告人：付红伟Email: