二章节菌种与种子扩大培养.ppt

《二章节菌种与种子扩大培养.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《二章节菌种与种子扩大培养.ppt（70页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、二章节菌种与种子扩大培养 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望本章讲述内容v第一节第一节 微生物工业用菌种微生物工业用菌种 v第二节第二节 种子扩大培养种子扩大培养第一节第一节 微生物工业用菌种微生物工业用菌种一、菌种的分离筛选一、菌种的分离筛选1、菌种的来源、菌种的来源v根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买；v从大自然中分离筛选新的微生物菌种。2、分离思路、分离思路 v新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照生产的要求、菌种

2、的特性，采用各种筛选方法，快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。v实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌，也必须重新进行分离纯化。v有了优良的菌种，还要有合适的工艺条件和合理先进的设备与之配合。v定定方方案案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性。v采样：采样：有针对性地采集样品。v增增殖殖：人为地通过控制养分或培条件，使所需菌种增殖培养后，在数量上占优势。v分分离离筛筛选选：采用选择性培养基利用分离技术得到纯种目的菌。v发发酵酵性性能能测测定定：进行生产性能测定。这些特性包括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最适pH值、提取工

3、艺等。3、新种分离与筛选的步骤、新种分离与筛选的步骤（1）采样）采样v采样对象：以采集土壤为主。v采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。采取土壤样品要考虑的几个问题采取土壤样品要考虑的几个问题v土质肥，微生物含量高，特别肥沃的土壤中细菌多，放线菌少；在植物残体枯枝落叶下的土壤中较多含有拮抗性真菌。v离地面520cm处的土壤通气良好、不受阳光直射，含菌量最高。v采土季节以春秋两季最好。v采土方法：选择适当地点、铲除表土、取土样数十克，盛入事先准备的无菌防水纸袋中，其上记录采土时间、地点、植被情况等。v多点采土、混合分离，可以代表每一地块上的微生物分布平均情况（2）增殖培养）增殖培养v含有目的

4、菌较多的土样不需要富集培养v如果原有样品中目的菌含量低，可以人为地添加相应的基质，培养使之以较其它微生物更快的速度生长繁殖，从而提高它们在样品中的比例，便于分离。v富集培养的一般方法：采用有利于目的菌种而不利于无关微生物的营养和培养条件，以达到使目的菌种在群体中比例上升的目的。v 例如碳源利用的控制，可选定糖，淀粉、纤维素，或者石油等，以其中的一种为唯一碳源，那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常生长，而其它微生物就可能死亡或淘汰。这样对下阶段的纯种分离就会顺利得多。v一些有特定物质产生能力的菌种，不容易富集，只有通过大量艰苦的工作筛选取得。（3）培养分离）培养分离v 尽管通过增殖培养效果显

5、著，但还是处于微生物的混杂生长状态。因此还必须分离，纯化。在这步，增殖培养的选择性控制条件还应进一步应用，而且控制得细一点，好一点。纯种分离的方法有划线分离法、稀释分离法。稀释分离法稀释分离法 稀释倒稀释倒 平板法平板法 平板平板 涂布法涂布法注意：必须要做多个浓度的稀释分离平板。注意：必须要做多个浓度的稀释分离平板。划线分离法划线分离法平板划线法平板划线法（4）筛）筛 选选、初筛：从分离得到的大量微生物中，将目标微生物、初筛：从分离得到的大量微生物中，将目标微生物 筛选出来的过程。筛选出来的过程。常用的初选方法：常用的初选方法：水解酶产生菌的筛选：水解酶产生菌的筛选：将酶的作用底物加在培将酶

6、的作用底物加在培 养基中，接种后适温培养基中，接种后适温培 养，根据菌苔周围是否养，根据菌苔周围是否 产生水解圈筛选出水解产生水解圈筛选出水解 酶产生菌。酶产生菌。一般采用平板筛选。一般采用平板筛选。拮抗菌的筛选拮抗菌的筛选对峙培养：对峙培养：将病原指示菌与待测菌株将病原指示菌与待测菌株 相对接种在平板上适温培相对接种在平板上适温培 养，根据病原菌的生长情养，根据病原菌的生长情 况筛选出拮抗性菌株。况筛选出拮抗性菌株。分初筛、复筛。分初筛、复筛。2）摇瓶发酵筛选：将待测菌株进行液体振荡培养，取）摇瓶发酵筛选：将待测菌株进行液体振荡培养，取 发酵滤液进行活力测定。发酵滤液进行活力测定。、复筛：在

7、初筛的基础上，进一步鉴定有希望菌株的、复筛：在初筛的基础上，进一步鉴定有希望菌株的 生产能力强弱的过程。生产能力强弱的过程。复筛采用摇瓶培养后，发酵液采用精确的分析方法复筛采用摇瓶培养后，发酵液采用精确的分析方法 进行测定。进行测定。复筛过程中，要结合培养条件进行。复筛过程中，要结合培养条件进行。培养条件包括：培养基培养条件包括：培养基 pH值值 发酵温度发酵温度 供氧量等。供氧量等。（5）菌种鉴定）菌种鉴定v 经典分类鉴定方法：形态特征、生理生化特经典分类鉴定方法：形态特征、生理生化特征、血清学试验等。征、血清学试验等。v现代分类鉴定方法：遗传特性、细胞化学组现代分类鉴定方法：遗传特性、细胞

8、化学组分、计算机数值分析。分、计算机数值分析。（6）毒性试验）毒性试验v 自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的，将其作为生产菌种应当十分当心，尤其与食品工业有关的菌种，更应慎重。据有的国家规定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性试验外，其他微生物作为食用，均需通过两年以上的毒性试验。二、菌种的保藏与复壮（一）菌种的保藏1、菌种保藏的意义 菌种是从事微生物学以及生命科学研究的基本材料，特别是利用微生物进行有关生产如抗生素、氨基酸、酿造等工业，更离不开菌种。所以菌种保藏是进行微生物学研究和微生物育种工作的重要组成部分。其任务首先是使菌种不致死亡，同时还要尽可

9、能设法把菌种的优良特性保持下来而不致向坏的方面转化。2、菌种保藏的原理、菌种保藏的原理菌种保藏主要是根据菌种的生理生化特点人工创造条件使孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低，以减少其变异。一般可通过保持培养基营养成分在最低水平缺氧状态，干燥和低温，使菌种处于“体眠”状态，抑制其繁殖能力。一种好的保藏方法首先应能长期保持菌种原有的优良性状不变，同时还需考虑到方法本身的简便和经济，以便生产上能推广使用。菌种保藏的方法很多，一般有下面几种一般有下面几种：A 斜面冰箱保藏法（酵母）斜面冰箱保藏法（酵母）斜斜面面保保藏藏是是一一种种短短期期、过过渡渡的的保保藏藏方方法法，用新鲜斜面接种后，置最适条件下培养到

10、菌体或孢子生长丰满后，放在4冰冰箱箱保保存存。一一般般保保存存期期为为三三个个月到六个月月到六个月。B 石蜡油封存法（酵母）石蜡油封存法（酵母）向培养成熟的菌种斜面上，倒入一层灭过菌的石蜡油，用量要高出斜面高出斜面一厘米一厘米，然后保存在冰箱中。此法可通用于不能利用石蜡油作碳源的细菌、通用于不能利用石蜡油作碳源的细菌、霉菌、酵母等微生物的保存霉菌、酵母等微生物的保存。保存期约一年左右。保存期约一年左右。3、菌种保藏的方法C 沙土管保藏法（沙土管保藏法（细菌，霉菌，防线菌细菌，霉菌，防线菌）这是国内常采用的一种方法。适合于产孢子或芽孢产孢子或芽孢的微生物。它的制备方法制备方法是：首先，将沙与土洗

11、洗净净烘烘干干过过筛筛后，按按沙沙与与土土的的比比例例为为l2 l混混合合均均匀匀，分装于小试管中，装料高度约为1厘厘米米左左右右，121C间间歇歇灭灭菌菌三三次次，灭菌试验合格后烘干备用。一般沙沙用用80目目过过筛筛，土土用用30100目目过过筛筛。其次，将斜面孢子制成孢子悬浮液接入沙土管中或将斜面孢子刮下直直接接与与沙沙土土混混合合，于干燥器中用真空泵抽干，放在冰箱内保存。一般保存期可达保存期可达2-10年不等年不等。D真空冷冻干燥保减法（真空冷冻干燥保减法（细菌，防线菌）真空冷冻干燥保臧法真空冷冻干燥保臧法是目前常用的较理想的一种方法。其基本原理基本原理是在较低的温度下（15），快速她将

12、细胞冻结，并且保持细胞完整，然后在真空中使水分升华水分升华。在这样的环境中，微生物的生长和代谢都暂时停止，不易发生变异。因此，菌种可以保存很长时间，一般一般5年左右年左右。这种保藏方法虽然需要一定的设备，要求亦比较严格，但由于该方法保藏效果好，对各种微生物都适用。所以，国内外都已较普遍地应用。这种方法的基本操作基本操作过程是先将微生物制成悬浮液制成悬浮液，再与保护剂混合与保护剂混合，然后放在特制的安瓶管内，用低温酒精或干冰，使其迅速冻结，在低温下用真空泵抽干低温下用真空泵抽干，最后将安瓿管真空熔封，并低温保藏。保护剂一般采用脱脂牛奶或血清保护剂一般采用脱脂牛奶或血清。保护剂的作用可能是在冷冻干

13、燥的脱水过程中代脱水过程中代替结合水而稳定细胞成分（细胞膜）的构型替结合水而稳定细胞成分（细胞膜）的构型，防此细胞膜因为冻结而破坏防此细胞膜因为冻结而破坏。保护剂还可以起支持作用支持作用，使微生物疏松地固定在上面。牛奶可以离心或加热的方法脱脂牛奶可以离心或加热的方法脱脂。E 液氮超低温保藏法（液氮超低温保藏法（细菌，真菌）细菌，真菌）液氮超低温保臧法足近几年才发展起来的，此法国外已较普遍采用，是是适适用用范范围围最最广广的的微微生生物物保保藏藏法法。尤其是一些不不产产孢孢子子的的菌菌丝丝体体，用其它保藏方法不理想，可用液液氮氮保保臧臧法法。其保存期最长。a 原理原理用液氮能长期保存菌种。这是因

14、为液氮的温度可达一一196，远远低于其新陈代谢作用停止的温度（一新陈代谢作用停止的温度（一130），所以此时菌种的代谢活动已停止代谢活动已停止，化学作用亦随之消失化学作用亦随之消失。b 操作方法及步骤操作方法及步骤（1）安安瓿瓿管管要要求求由于液氮保存于超低温状态，所使用的安安瓿瓿管管需需能能承承受受大大的的温温差差而而不不致致于于破破裂裂，一般用95料料或或GCl7的的玻玻璃璃管管，安瓿管选好后印上标记印上标记，加棉塞后灭菌，烘干后备用加棉塞后灭菌，烘干后备用。（2）菌种准备及分装）菌种准备及分装 因为液氮法菌种要经受超低温的冷冻过超低温的冷冻过程程。所以也需要保护剂保护剂，常用的保护剂为保

15、护剂为10甘油甘油。用保护剂制备好菌液后，加入准备好的安瓶管中，一般安瓿管的装量为0.21mL。（3）冻冻结结液氮法的关关键键是先先把把微微生生物物从从常常温温过过渡渡到到低低温温。这样在细胞接接触触低温前低温前，使细胞内自由水通过膜渗出而不使其遇冷形成冰晶而伤害细胞使细胞内自由水通过膜渗出而不使其遇冷形成冰晶而伤害细胞。美国ATCC采用先先将将菌菌液液降降温温到到0，再以每每分分钟钟降降低低1的的速速度度，一一直直降降低低到到38，然后才把装有菌液的安瓿管放入液液氮氮罐罐的的气气相相中中。由于液氮要蒸发，这样温度就会上升，冰冰晶晶状状态态发发生生变变化化，从而导致菌种死亡。所以要常常注意液氮

16、的残存量，定期补加常常注意液氮的残存量，定期补加。（4）重新培养）重新培养当要使用或检查所保存的菌种时，可将安瓿管从冰箱中取出，室温或室温或3540水浴中迅速解冻水浴中迅速解冻，当升温至升温至0时即可打开安瓿管时即可打开安瓿管，将菌种移到适宜的培养基斜面上培养。4、国内外主要菌种保藏机构介绍、国内外主要菌种保藏机构介绍菌种是一个国家的重要资源，世界各国都对菌种极为重视，设置了各种专业性保臧机构专业性保臧机构，主要的菌种保臧机构介绍如下：（1）ATCC American Type Culture Collection.Rockvil1Maryland.U.S.A。美国标准菌种收藏所美国标准菌种收

17、藏所，美国，马里兰洲，罗克维尔市。（2）CSH（Cold Spring Harbor Laboratory），），U.S.A冷泉港研究室，美国。冷泉港研究室，美国。（3）IAM（Institute of Applied Microbiology），University of Tokyo，Japan。日本东京大学应用微生物研究所，日本东京。日本东京大学应用微生物研究所，日本东京。（4）IFO（Institute for Fermentation），Osaka，Japan。发酵研究所，日本大阪。发酵研究所，日本大阪。（5）KCC（Kaken Chemical Company Ltd），Tokyo，

18、Japan。科研化学有限公司，日本东京。科研化学有限公司，日本东京。（6）NCTC（National Collection of Type Cuure），London United Kingdom，国立标准菌种收藏所，英国伦敦。国立标准菌种收藏所，英国伦敦。（7）NIH（National Institutes of Health），Bethesda，Maryland，U.S.A国立卫生研究所，美国，马里兰洲，贝塞斯达。国立卫生研究所，美国，马里兰洲，贝塞斯达。（8）NRRL（Northern Utilization Research and Developmcnt Division，U.S.D

19、partment of Agriculture，Peoria，U.S.A。美国农业部、北方开发利用研究部，美国皮奥里亚市美国农业部、北方开发利用研究部，美国皮奥里亚市。在我国为了推动菌种保臧事业的发展，1970午7月在国家科委和中国科学院主持下，召开了第一次全国菌种保藏工作会议，在会上成立了中中国国微微生生物物菌菌种种保保减减管管理理委委员员会会（CCCMS）委委托托中中国国科科学学院院负负责责担担负负全全国国菌菌种种保保臧臧管管理理业业务务，下设六个菌种保藏管理中心。下设六个菌种保藏管理中心。l）普通微生物菌种保臧管理中心（）普通微生物菌种保臧管理中心（CCGMC）；）；中国科学院微生物研究

20、所，北京（中国科学院微生物研究所，北京（AS）：真菌，细菌。）：真菌，细菌。中国科学院武汉病毒研究所，武汉（中国科学院武汉病毒研究所，武汉（ALIV）：病毒。）：病毒。2）农业微生物菌种保藏管理中心（）农业微生物菌种保藏管理中心（ACCC）；）；中国农业科学院土壤肥料研究所，中国农业科学院土壤肥料研究所，3）工业微生物菌种保臧管理中心（）工业微生物菌种保臧管理中心（CICC）；）；轻工业部食品发酵工业科学研究所，北京。轻工业部食品发酵工业科学研究所，北京。4）医学微生物菌种保臧管理中心（）医学微生物菌种保臧管理中心（CMCC）；）；中国医学科学院皮肤病研究所，南京（中国医学科学院皮肤病研究所，

21、南京（ID）真菌。真菌。卫生部药品生物制品检定所，北京：细菌。卫生部药品生物制品检定所，北京：细菌。中国医学科学院病毒研究所，北京：病毒。中国医学科学院病毒研究所，北京：病毒。5）抗生素菌种保藏管理中心（）抗生素菌种保藏管理中心（CACC）；）；中中圈圈医医学学科科学学院院抗抗生生素素研研究究所所，北北京京和和四四川川抗抗生生素素工工业业研研究究所所，成成都都：新新抗生素菌种。抗生素菌种。华北药厂抗生素研究所，石家庄：生产用抗生素菌种华北药厂抗生素研究所，石家庄：生产用抗生素菌种6）兽医微生物菌种保藏管理中心（）兽医微生物菌种保藏管理中心（CVCC）；）；农业部兽医药品监察所，北京。农业部兽医

22、药品监察所，北京。（二）菌种的衰退与复壮 1、菌种衰退：菌种经过长期人工培养或保藏，由于自发突变的作用而引起某些优良特性变弱或消失的现象。2、菌种退化的原因：v基因突变；v变异菌株性状分离；诱变的单菌落是由个以上孢子或细胞形成菌落由个孢子或单个细胞形成，但它是多核细胞单核孢子发生突变时，双链DNA上仅条链上某个位点发生变化v连续传代v其它因素菌种保藏不当 生长条件不满足（培养基组成、培养条件）3、防止菌种退化的措施控制传代次数选择合适的培养条件选择合适的保藏方法菌种稳定性检查 分离复壮4、菌种复壮：使衰退的菌种重新恢复原来的优良特性。v复壮措施：对已衰退菌种配合一定培养条件进行单细胞分离纯化淘

23、汰衰退的个体选择合适的培养基三、菌种选育三、菌种选育v菌种选育菌种选育是一门应用科学技术应用科学技术，其理论基础理论基础是微生物遗传学、生物化学遗传学、生物化学等，而其研究目的目的是微生物产品的高产优质高产优质和发展新品种新品种为生产不断地提供优良提供优良菌种菌种，从而促进生产发展。v 目前菌种选育常采用自然选育和诱变育种自然选育和诱变育种等方法，带有一定的盲目性盲目性，尚属于经典育种经典育种的范畴。随着微生物学、生化遗传学的发展，出现了转化、转化、转导、原生质体融合、代谢调控和基因工程转导、原生质体融合、代谢调控和基因工程等较为定向的育种方法定向的育种方法。第二节 种子扩大培养v种子扩大培养

24、：是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，在经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级放大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。作为种子的准则 v菌种细胞的生长活力强，移种至发酵罐后能迅速生长，迟缓期短；v生理性状稳定；v菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求；v无杂菌污染；v保持稳定的生产能力。一、种子的制备过程v种子制备的过程大致可分为：实验室种子制备阶段 生产车间种子制备阶段 1、实验室种子的制备v实验室种子的制备一般采用两种方式对于产孢子能力强的及孢子发芽、生长繁殖快的菌种可以采用固体培养基培养孢子，孢子可直接作为种子罐的种子，这样操作简便，不易

25、污染杂菌。对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，可以用液体培养法。2、生产车间种子制备 v实验室制备的孢子或液体种子移种至种子罐扩大培养，种子罐的培养基虽因不同菌种而异，但其原则为采用易被菌利用的成分如葡萄糖、玉米浆、磷酸盐等，如果是需氧菌，同时还需供给足够的无菌空气，并不断搅拌，使菌（丝）体在培养液中均匀分布，获得相同的培养条件。（1）种子罐的作用：v主要是使孢子发芽，生长繁殖成菌（丝）体，接入发酵罐能迅速生长，达到一定的菌体量，以利于产物的合成。（2）种子罐级数的确定 v种子罐级数：是指制备种子需逐级扩大培养的次数，取决于：菌种生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度；所采用发酵罐的容积 v确定种

26、子罐级数需注意的问题种子级数越少越好，可简化工艺和控制，减少染菌机会种子级数太少，接种量小，发酵时间延长，降低发酵罐的生产率，增加染菌机会虽然种子罐级数随产物的品种及生产规模而定。但也与所选用工艺条件有关。如改变种子罐的培养条件，加速了孢子发芽及菌体的繁殖，也可相应地减少种子罐的级数。二、影响种子质量的主要因素1、培养基v营养成分适合种子培养的需要选择有利于孢子发芽和菌体生长的培养基；营养上要易于被菌体直接吸收和利用；营养成分要适当丰富和完全，氮源和维生素含量要高v营养成分要尽可能与发酵培养基相近。v生产过程中经常出现种子质量不稳定的现象，其主要原因是原材料质量波动。例如在四环素、土霉素生产中

27、，配制产孢子斜面培养基用的麸皮，因小麦产地、品种、加工方法及用量的不同对孢子质量的影响也不同。蛋白胨加工原料不同如鱼胨或骨胨对孢子影响也不同。v原材料质量的波动，起它要作用的是其中无机离子含量不同，如微量元素Mg2+、Cu2+、Ba2+能刺激孢子的形成。磷含量太多或太少也会影响孢子的质量。v水质的影响：地区不同、季节变化和水源污染，均可造成水质波动，影响种子质量。v菌种在固体培养基上可呈现多种不同代谢类型的菌落，氮源品种越多，出现的菌落类型也越多，不利于生产的稳定。v措施培养基所用原料要经过发酵试验合格才可使用严格控制灭菌后培养基的质量斜面培养基使用前，需在适当温度下放置一定时间供生产用的孢子

28、培养基要用比较单一的氮源，作为选种或分离用的培养基则采用较复杂的有机氮源2、种龄v种龄：是指种子罐中培养的菌丝体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。v通常种龄是以处于生命力极旺盛的对数生长期，菌体量还未达到最大值时的培养时间较为合适。时间太长，菌种趋于老化，生产能力下降，菌体自溶；种龄太短，造成发酵前期生长缓慢。v不同菌种或同一菌种工艺条件不同，种龄是不一样的，一般需经过多种实验来确定。嗜碱性芽孢杆菌生产碱性蛋白酶，12小时最好。3、接种量v接种量：是指移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例。v接种量的大小决定于生产菌种在发酵罐中生长繁殖的速度，采用较大的接种量可以缩短发酵罐中菌丝繁殖

29、达到高峰的时间，使产物的形成提前到来，并可减少杂菌的生长机会。但接种量过大或者过小，均会影响发酵。过大会引起溶氧不足，影响产物合成；而且会过多移入代谢废物，也不经济；过小会延长培养时间，降低发酵罐的生产率。v通常接种量，细菌15%，酵母菌510%，霉菌715%，有时2025%4、温度 任何微生物的生长都需要有适宜的生长温度，在此温度范围内，微生物生长繁殖最快。温度对多数品种斜面孢子质量有显著的影响。如土霉素生产菌种在高于37C培养时，孢子接入发酵罐后出现糖代谢变慢，氨基氮回升提前，菌丝过早自溶，效价降低等现象。一般各生产单位都严格控制孢子斜面的培养温度。5、pHv培养基的氢离子浓度对微生物生命

30、活动有显著影响。各种微生物都有自己生长与合成酶的最适pH。同一菌种合成酶的类型与酶系组成可随pH的改变而产生不同程度的变化。v泡盛酒曲霉突变株在pH6.0培养时以产生a-淀粉酶为主，在pH2.4条件下培养，转向合成糖化型淀粉酶与麦芽糖酶，a-淀粉酶合成受到抑制。6、通风量 在种子罐中培养的种子除保证供给易被利用的培养基外，有足够的通气量可以提高种子质量。例如，青霉素的生产菌种在制备过程中将通气充足和不足两种情况下得到的种子分别接入发酵罐内，它们的发酵单位可相差1倍。但也有例外，例如土霉素生产菌，一级种子罐的通气量小对发酵有利。7、其它因素（1）培养时间v一般来说，衰老的孢子不如年轻的孢子，因为

31、衰老的孢子已在逐步进入发芽阶段，核物质趋于分化状态。过于衰老的孢子会导致生产能力的下降。v措施：孢子培养的时间应该控制在孢子量多、孢子成熟、发酵产量正常的阶段终止培养。（2）冷藏时间v斜面冷藏对孢子质量的影响与孢子成熟程度有关。如土霉素生产菌种孢子斜面培养4天左右即于4C冰箱保存，发现冷藏78天菌体细胞开始自溶。而培养5天以后冷藏，20天未发现自溶。v冷藏时间对孢子的生产能力也有影响。例如在链霉素生产中，斜面孢子在6 C冷藏两个月后的发酵单位比冷藏一个月降低18%，冷藏3个月后降低35%。（3）泡沫 泡沫的大量存在，易影响微生物对溶氧的吸收，降低种子罐的利用率，甚至跑液染菌等不利影响，不利于种

32、子的培养。三、种子质量标准1、细胞或菌体v菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观（色素、颗粒等）单细胞：菌体健壮、菌形一致、均匀整齐，有的还要求有一定的排列或形态；霉菌、放线菌：菌丝粗壮、对某些染料着色力强、生长旺盛、菌丝分枝情况和内含物情况好。2、生化指标v种子液的糖、氮、磷的含量和pH变化。3、产物生成量v在抗生素发酵中，产物生成量是考察种子质量的重要指标，因为种子液中产物生成量的多少间接反映种子的生产能力和成熟程度。4、酶活力v种子液中某种酶的活力，与目的产物的产量有一定的关联。四、实例啤酒酵母的扩大培养v 啤酒酵母纯正与否，对啤酒发酵和啤酒质量的影响很大。啤酒工厂生产使用的酵母由保存的纯种酵母

33、，经过扩大培养，达到一定数量后，供生产现场使用。每个啤酒厂都应保存适合本厂使用的纯种酵母，以保证生产的啤酒具有稳定的风格和特性。（一）扩培流程1、实验室扩大培养v 斜面试管(原菌种）富氏瓶或试管培养一巴氏瓶或三角瓶培养一卡氏罐培养2、生产现场扩大培养v汉生罐培养一酵母扩大培养罐一酵母繁殖罐一发酵罐。（二）扩大培养的几项原则和问题 (1)酵母扩大培养的关键在于使用优良的单细胞出发菌。此出发菌株先经生理特件和生产性能鉴定，然后投人应用，并保证在扩大培养过程中无污染、无变异。每一步扩大后的残留液都应进行无污染和无变异的检查。(2)培养前期，为了提高酵母增殖速率，缩短培养时间，实验室扩大培养阶段，采用

34、酵母最适繁殖温度25。而后每扩大一次，温度均相应有所降低，使酵母逐步适应低温发酵的要求。但每次降温幅度不能太大，以防酵母活性受到抑制。随着培养温度的降低，培养时间视稀释倍数而相应延长。(3)为了缩短酵母生长停滞期和缩短培养时间，每阶段扩大培养的酵母，最好在酵母对数生长期移植，具体地说，就是在酵母增殖率开始回降以前移植。此时的酵母出芽率最高，死亡率最低，移植后，迅速增殖。(4)酵母增殖是依靠糖的生物氧化，即呼吸作用而获取能量的。因此，在酵母扩大培养时，通风供氧是绝对必要的，从三角瓶到卡氏罐培养阶段，一般是依靠定时摇动容器(或使用振荡器)，使酵母液与空气接触，容器上部空间的空气也使酵母与氧有接触的

35、机会。移植到生产现场扩大培养后，即需注意通风供氧。(5)培养酵母，应使用营养丰富的优质培养基。实验室培养阶段应选择一氨基氮含量高的优级麦芽，不加辅料，自制培养基。(6)关于扩大倍数问题，实验室阶段，由于培养温度高，增殖时间短，无菌操作条件较好，扩大倍数可以较高，例如1：10一20，甚至更高一些。汉生罐以后的扩大培养，由于温度逐步降低，酵母倍增时间延长，为了很快地使酵母起发，保持酵母的生长优势，增强其抗污染能力，扩大倍数以1：5左右为宜。根据这一原则，中间扩培罐的数量和容积也就容易确定了。(7)关于通风问题，培养初期，培养液中葡萄糖含量高，受克拉勃垂效应(Crabtree effect)的影响，

36、连续通风，酵母的增殖效果未必如理想的那么好，以间歇通风为宜。总之，通风宜足，但不必过多。传统的做法，上面酵母多采用连续通风，而下面酵母则不采用连续通风，这可能与两者的发酵温度不同(9与20)和发酵时间不同（3天与10天有关）(8)关于扩大培养麦汁的无菌问题。生产现场扩大培养一般都采用糖化车间来的冷麦汁，往往由于输送距离较远，还需另外加热灭菌。思考题一、名词解释v菌种衰退、菌种复壮、种子培养级数、种龄、接种量二、问答题1、简述产淀粉酶菌株的筛选过程。2、简述菌种可能的退化原因。3、菌种保藏的原理是什么？4、菌种保藏的方法有哪些？并例举其中一种保藏方法详细阐述其操作过程。5、什么是种子的扩大培养？为什么要对种子进行扩大培养？6、