第17章基因扩增仪优秀课件.ppt

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1、第17章基因扩增仪第1页，本讲稿共40页内容提要1.PCR基因扩增仪的工作原理基因扩增仪的工作原理 PCR技术的原理及发展技术的原理及发展 PCR基因扩增仪的工作原理基因扩增仪的工作原理 2.PCR扩增仪的分类与结构扩增仪的分类与结构 定性定性PCR扩增仪扩增仪实时荧光定量实时荧光定量PCR扩增仪扩增仪 3.PCR扩增仪的性能指标、操作规程及常见故障的排除扩增仪的性能指标、操作规程及常见故障的排除 PCR扩增仪的性能指标扩增仪的性能指标PCR扩增仪的操作规程扩增仪的操作规程PCR扩增仪常见故障的排除扩增仪常见故障的排除 4.PCR扩增仪的应用扩增仪的应用第2页，本讲稿共40页内容提要3.PCR

2、扩增仪的性能指标、操作规程及常见故障的排除扩增仪的性能指标、操作规程及常见故障的排除 PCR扩增仪的性能指标扩增仪的性能指标PCR扩增仪的操作规程扩增仪的操作规程PCR扩增仪常见故障的排除扩增仪常见故障的排除 4.PCR扩增仪的应用扩增仪的应用第3页，本讲稿共40页教学基本要求1.掌握掌握PCR基因扩增仪的工作原理和主要性能指标。基因扩增仪的工作原理和主要性能指标。2.掌握梯度掌握梯度PCR仪和原位仪和原位PCR仪的功能和特点。仪的功能和特点。3.掌握实时荧光定量掌握实时荧光定量PCR扩增仪的种类；金属板式实时定扩增仪的种类；金属板式实时定量量PCR仪和离心式实时定量仪和离心式实时定量PCR仪

3、的特点。仪的特点。4.熟悉熟悉PCR技术的原理；技术的原理；PCR扩增仪的种类；荧光实时定量扩增仪的种类；荧光实时定量PCR（RQ-PCR）技术原理。）技术原理。5.了解了解PCR扩增仪的操作规程；扩增仪的操作规程；PCR扩增仪常见故障的排除；扩增仪常见故障的排除；PCR扩增仪的应用。扩增仪的应用。第4页，本讲稿共40页第一节 PCR基因扩增仪的工作原理基因扩增仪的工作原理 一、一、PCR技术的发展及原理技术的发展及原理 1971年，年，Kleppe等人首次在文章中准确、等人首次在文章中准确、客观地阐述了客观地阐述了PCR方法。方法。1985年，美国年，美国PE-Cetus公司的公司的Kary

4、 Mullis等人发明等人发明PCR技术。技术。第5页，本讲稿共40页第一节 PCR基因扩增仪的工作原理基因扩增仪的工作原理FPCR技术的本质是体外核酸扩增，加热使技术的本质是体外核酸扩增，加热使双链双链DNA解开螺旋，在退火温度条件下引解开螺旋，在退火温度条件下引物同模板物同模板DNA杂交，在杂交，在Taq DNA聚合酶，聚合酶，dNTPs，Mg2+和合适和合适pH缓冲液存在条件缓冲液存在条件下延伸引物，重复下延伸引物，重复“变性变性退火退火引物延引物延伸伸”过程至过程至25-40个循环，呈指数级扩大待个循环，呈指数级扩大待测样本中的核酸拷贝数。测样本中的核酸拷贝数。第6页，本讲稿共40页第

5、一节 PCR基因扩增仪的工作原理基因扩增仪的工作原理PCR的基本原理的基本原理 第7页，本讲稿共40页第一节 PCR基因扩增仪的工作原理基因扩增仪的工作原理二、二、PCR基因扩增仪的工作原理基因扩增仪的工作原理 从从PCR反应基本原理可以看出，反应基本原理可以看出，PCR基因扩增仪工作关键是温度控制。基因扩增仪工作关键是温度控制。第8页，本讲稿共40页第一节 PCR基因扩增仪的工作原理基因扩增仪的工作原理PCRPCR仪温度控制仪温度控制水浴锅控温水浴锅控温 压缩机控温压缩机控温 半导体控温半导体控温 离心式空气加热控温离心式空气加热控温 第9页，本讲稿共40页第二节 PCR扩增仪的分类与结构扩

6、增仪的分类与结构PCRPCR扩增仪的种类扩增仪的种类 普通普通PCRPCR扩增仪扩增仪 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR扩增仪扩增仪 梯度梯度PCRPCR仪仪 原位原位PCRPCR仪仪 第10页，本讲稿共40页第二节 PCR扩增仪的分类与结构扩增仪的分类与结构F荧光实时定量荧光实时定量PCR（real-time quantitative PCR,RQ-PCR）技术在）技术在PCR反应体系中加入特异性的荧光染料或探针，反应体系中加入特异性的荧光染料或探针，荧光信号的变化真实地反映了体系中模板荧光信号的变化真实地反映了体系中模板的增加，通过检测荧光信号，从而实时监的增加，通过检测荧光信号，从而

7、实时监测整个测整个PCR反应过程，最后通过标准曲线反应过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。对未知模板进行定量分析。第11页，本讲稿共40页第二节 PCR扩增仪的分类与结构扩增仪的分类与结构实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR仪仪 金属板式实时定量金属板式实时定量PCRPCR仪仪 离心式实时定量离心式实时定量PCRPCR仪仪 各孔独立控温的定量各孔独立控温的定量PCRPCR仪仪 第12页，本讲稿共40页第二节 PCR扩增仪的分类与结构扩增仪的分类与结构金属板式实时定量金属板式实时定量PCR仪仪 可作为普通可作为普通PCR仪使用仪使用可带梯度功能可带梯度功能可容纳的样本量大，无需特殊耗材

8、可容纳的样本量大，无需特殊耗材温度均一性欠佳，有边缘效应，标准曲线温度均一性欠佳，有边缘效应，标准曲线的反应条件难以做到与样品完全一致的反应条件难以做到与样品完全一致 第13页，本讲稿共40页第二节 PCR扩增仪的分类与结构扩增仪的分类与结构ABI 7500荧光定量荧光定量PCR仪仪 MJ公司公司Chromo 4荧光定量荧光定量PCR仪仪 Bio-rad公司公司iCycler荧光定量荧光定量PCR仪仪 第14页，本讲稿共40页第二节 PCR扩增仪的分类与结构扩增仪的分类与结构离心式实时定量离心式实时定量PCR仪仪 温度均一性较好温度均一性较好使用的是同一个激发光源和检测器，随时使用的是同一个激

9、发光源和检测器，随时检测旋转到跟前的样品，有效减少系统误检测旋转到跟前的样品，有效减少系统误差差可容纳样品量少，有的需用特殊毛细管作可容纳样品量少，有的需用特殊毛细管作样品管，增加了使用成本，也不带梯度功样品管，增加了使用成本，也不带梯度功能能 第15页，本讲稿共40页第二节 PCR扩增仪的分类与结构扩增仪的分类与结构Rotor-Gene 3000荧光定量荧光定量PCR仪仪 Light CycleTM荧光定量荧光定量PCR仪仪 第16页，本讲稿共40页第二节 PCR扩增仪的分类与结构扩增仪的分类与结构Light CycleTM荧光定量荧光定量PCR仪结构示意图仪结构示意图 第17页，本讲稿共4

10、0页第二节 PCR扩增仪的分类与结构扩增仪的分类与结构各孔独立控温的定量各孔独立控温的定量PCR仪仪不同样品槽分别拥有独立的智能升降温模块，不同样品槽分别拥有独立的智能升降温模块，各孔独立控温，适合多指标快速检测。各孔独立控温，适合多指标快速检测。SmartCycler的软件允许一台仪器同时操的软件允许一台仪器同时操作六个样品模块，既满足高速批量要求，又作六个样品模块，既满足高速批量要求，又能灵活运用，还可实现任意梯度反应。能灵活运用，还可实现任意梯度反应。SmartCycler上样不如传统方法方便，而上样不如传统方法方便，而且需要独特的扁平反应管，使用成本较高。且需要独特的扁平反应管，使用成

11、本较高。第18页，本讲稿共40页第二节 PCR扩增仪的分类与结构扩增仪的分类与结构SmartCycler荧光定量荧光定量PCR仪仪 第19页，本讲稿共40页第三节第三节 PCR扩增仪的性能指标、扩增仪的性能指标、操作规程及常见故障的排除操作规程及常见故障的排除 一、一、PCR扩增仪的性能指标扩增仪的性能指标（一）温度控制（一）温度控制 温度的准确性温度的准确性 温度的均一性温度的均一性 升降温的速度升降温的速度 不同模式下的相同温度特性不同模式下的相同温度特性 第20页，本讲稿共40页第三节第三节 PCR扩增仪的性能指标、扩增仪的性能指标、操作规程及常见故障的排除操作规程及常见故障的排除（二）

12、荧光检测系统（二）荧光检测系统 激发光源激发光源 检测器检测器 发光二极管发光二极管 卤钨灯光源卤钨灯光源 超低温超低温CCD 光电倍增管光电倍增管 第21页，本讲稿共40页第三节第三节 PCR扩增仪的性能指标、扩增仪的性能指标、操作规程及常见故障的排除操作规程及常见故障的排除（三）软件（三）软件简便的人性化设计最能满足其需求。新型简便的人性化设计最能满足其需求。新型的的PCR仪很注重程序编写的简易性，易学仪很注重程序编写的简易性，易学易用，还具有实时信息显示、记忆存储多易用，还具有实时信息显示、记忆存储多个程序、自动倒记时、自动断电保护等功个程序、自动倒记时、自动断电保护等功能，很多还可以免

13、费升级。能，很多还可以免费升级。第22页，本讲稿共40页第三节第三节 PCR扩增仪的性能指标、扩增仪的性能指标、操作规程及常见故障的排除操作规程及常见故障的排除（四）其他（四）其他多样化样品基座设计、多样化样品基座设计、热盖等都使热盖等都使PCR仪越仪越来越人性化。来越人性化。第23页，本讲稿共40页第三节第三节 PCR扩增仪的性能指标、扩增仪的性能指标、操作规程及常见故障的排除操作规程及常见故障的排除 二、二、PCR扩增仪的操作规程扩增仪的操作规程普通普通PCR扩增仪的操作非常简便，接通电扩增仪的操作非常简便，接通电源，仪器自检，设置温度程序或调出储存源，仪器自检，设置温度程序或调出储存的程

14、序运行即可。的程序运行即可。定量定量PCR扩增仪的操作和普通扩增仪的操作和普通PCR仪基本仪基本相同。相同。三、三、PCR扩增仪常见故障的排除扩增仪常见故障的排除 第24页，本讲稿共40页第四节第四节 PCR扩增仪的应用扩增仪的应用 一、感染性疾病的分子诊断和研究一、感染性疾病的分子诊断和研究二、遗传性疾病的分子诊断和研究二、遗传性疾病的分子诊断和研究三、恶性肿瘤的分子诊断和研究三、恶性肿瘤的分子诊断和研究四、四、PCR扩增仪在移植配型上的应用扩增仪在移植配型上的应用五、五、PCR扩增仪在法医学上的应用扩增仪在法医学上的应用六、六、PCR扩增仪在分子生物学其他领域的应用扩增仪在分子生物学其他领

15、域的应用 第25页，本讲稿共40页第26页，本讲稿共40页第一节 PCR基因扩增仪的工作原理基因扩增仪的工作原理F以不同温度的以不同温度的水浴锅水浴锅串联成一个控温串联成一个控温体系。体系。F样品与水直接无缝接触，控温准确，样品与水直接无缝接触，控温准确，温度均一性好，无边缘效应。温度均一性好，无边缘效应。F体积大，自动化程度不高，需人为干体积大，自动化程度不高，需人为干预，更换水浴锅时控温不稳定。预，更换水浴锅时控温不稳定。第27页，本讲稿共40页第一节 PCR基因扩增仪的工作原理基因扩增仪的工作原理F由由压缩机压缩机自动控温，金属导热，控温较水浴锅方便，一自动控温，金属导热，控温较水浴锅方

16、便，一台机器便可完成整个台机器便可完成整个PCR流程。流程。F压缩机故障率高，边缘效应及温度压缩机故障率高，边缘效应及温度overshooting现象现象严重。严重。F升温过程中，由于一些加热元件，比如半导体、金属块升温过程中，由于一些加热元件，比如半导体、金属块本身会积蓄能量，虽然温度探头探测温度到达了设定温本身会积蓄能量，虽然温度探头探测温度到达了设定温度，但半导体、金属块上积蓄的能量仍然会传给度，但半导体、金属块上积蓄的能量仍然会传给PCR体体系，造成实际的温度高于设定的温度，即系，造成实际的温度高于设定的温度，即overshooting。第28页，本讲稿共40页第一节 PCR基因扩增仪

17、的工作原理基因扩增仪的工作原理F由由半导体半导体自动控温，金属导热，控温方便，自动控温，金属导热，控温方便，体积小，相对稳定性好。体积小，相对稳定性好。F仍有边缘效应，温度均一性尚有欠缺，各仍有边缘效应，温度均一性尚有欠缺，各孔扩增效率可能不一致，并且仍存在温度孔扩增效率可能不一致，并且仍存在温度overshooting现象。现象。第29页，本讲稿共40页第一节 PCR基因扩增仪的工作原理基因扩增仪的工作原理F由金属线圈加热，采用由金属线圈加热，采用空气空气作为导热媒介，作为导热媒介，温度均一性好，各孔扩增效率高度一致温度均一性好，各孔扩增效率高度一致F满足荧光定量满足荧光定量PCR的高要求，

18、直接发展为的高要求，直接发展为离心式的定量离心式的定量PCR仪。仪。第30页，本讲稿共40页第二节 PCR扩增仪的分类与结构扩增仪的分类与结构普通定性普通定性PCR扩增仪扩增仪 F水浴式水浴式PCR仪：由三个不同温度的水浴槽仪：由三个不同温度的水浴槽和机械臂组成。和机械臂组成。F变温金属块式变温金属块式PCR仪：中心是由铝块或不仪：中心是由铝块或不锈钢制成的热槽，上有不同数目甚至不同锈钢制成的热槽，上有不同数目甚至不同规格的凹孔，用来放置样品管。规格的凹孔，用来放置样品管。F变温气流式变温气流式PCR仪：由机壳、热源、冷空仪：由机壳、热源、冷空气泵、控制器及辅助元件等组成。气泵、控制器及辅助元

19、件等组成。第31页，本讲稿共40页第二节 PCR扩增仪的分类与结构扩增仪的分类与结构梯度梯度PCR仪仪由普通由普通PCR仪衍生出的带梯度仪衍生出的带梯度PCR功能的功能的基因扩增仪。基因扩增仪。每个孔的温度可以在指定范围内按照梯度每个孔的温度可以在指定范围内按照梯度设置，设置，根据结果，一步就可以摸索出最适根据结果，一步就可以摸索出最适反应条件。反应条件。使用梯度使用梯度PCR仪，多次实验可在一台仪器仪，多次实验可在一台仪器上完成，既节省实验时间，提高实验效率，上完成，既节省实验时间，提高实验效率，又节约实验成本。又节约实验成本。第32页，本讲稿共40页第二节 PCR扩增仪的分类与结构扩增仪的

20、分类与结构原位原位PCR仪仪 由普通由普通PCR仪衍生出的带原位扩增功能的仪衍生出的带原位扩增功能的基因扩增仪。基因扩增仪。其样品基座上有若干平行的铝槽，每条铝其样品基座上有若干平行的铝槽，每条铝槽内可垂直放置一张载玻片，每张载玻片槽内可垂直放置一张载玻片，每张载玻片面均与铝槽紧密接触，温度传导极佳，控面均与铝槽紧密接触，温度传导极佳，控温很精确。温很精确。配有支持原位配有支持原位PCR模块的模块的PCR仪可以一机仪可以一机两用，比较经济。两用，比较经济。第33页，本讲稿共40页第三节第三节 PCR扩增仪的性能指标、扩增仪的性能指标、操作规程及常见故障的排除操作规程及常见故障的排除温度的准确性

21、温度的准确性：指样品孔温度与设定温度的一致性。指样品孔温度与设定温度的一致性。对对PCR扩增仪而言温度控制就意味着质扩增仪而言温度控制就意味着质量。量。第34页，本讲稿共40页第三节第三节 PCR扩增仪的性能指标、扩增仪的性能指标、操作规程及常见故障的排除操作规程及常见故障的排除温度的均一性温度的均一性：指样品孔间的温度差异，关系到不同样指样品孔间的温度差异，关系到不同样品孔之间反应结果的一致性。品孔之间反应结果的一致性。“位置的边缘效应位置的边缘效应”会影响结果的可重会影响结果的可重复性。复性。第35页，本讲稿共40页第三节第三节 PCR扩增仪的性能指标、扩增仪的性能指标、操作规程及常见故障

22、的排除操作规程及常见故障的排除升降温的速度升降温的速度：升降温速度快，可以提高工作效率，提升降温速度快，可以提高工作效率，提高高PCR反应特异性。反应特异性。样品管与基座接触的紧密性、基座的导样品管与基座接触的紧密性、基座的导热性、邻近样品管的相互影响都会影响热性、邻近样品管的相互影响都会影响样品的实际升降温速度样品的实际升降温速度。第36页，本讲稿共40页第三节第三节 PCR扩增仪的性能指标、扩增仪的性能指标、操作规程及常见故障的排除操作规程及常见故障的排除不同模式下的相同温度特性不同模式下的相同温度特性：带梯度功能的带梯度功能的PCR仪，应考虑仪器在梯度仪，应考虑仪器在梯度模式和标准模式下是否具有同样的温度特模式和标准模式下是否具有同样的温度特性。性。现有专利技术，能以同样的温度变化速率现有专利技术，能以同样的温度变化速率到达所有设定的梯度温度。到达所有设定的梯度温度。第37页，本讲稿共40页第38页，本讲稿共40页第39页，本讲稿共40页第40页，本讲稿共40页