免疫细胞功能的测定.ppt

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1、免疫细胞功能的测定 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望T细胞增殖功能测定基础理论基础理论 本技术用于评估本技术用于评估T T细胞对各种刺激的增殖能力。细胞对各种刺激的增殖能力。T T细胞增殖能力是反映细胞增殖能力是反映T T细胞功能的一个重要指标。细胞功能的一个重要指标。免疫细胞功能的测定免疫细胞功能的测定T细胞功能的测定刺激刺激T细胞增殖的因素及意义细胞增殖的因素及意义 1.1.特异性抗原：特异性抗原：引起寡克隆活化增殖。引起寡克隆活化增殖。克用于判

2、断抗原免疫的效果（疫苗接种）和回忆反克用于判断抗原免疫的效果（疫苗接种）和回忆反应能力，也能反映应能力，也能反映T T细胞总体的功能。细胞总体的功能。2.2.丝裂原：多克隆。丝裂原：多克隆。3.3.刺激信号转导分子：多克隆。刺激信号转导分子：多克隆。T细胞增殖功能测定T T细胞增殖测定方法细胞增殖测定方法细胞增殖测定方法细胞增殖测定方法1.1.显微镜下观察细胞形态与细胞计数。显微镜下观察细胞形态与细胞计数。2.2.放射性核素掺入试验。放射性核素掺入试验。细胞增殖时，细胞增殖时，DNADNA复制，须从培养液中补充核复制，须从培养液中补充核苷酸。用放射性核素标记培养液中提供的胸腺嘧苷酸。用放射性核

3、素标记培养液中提供的胸腺嘧啶（啶（3 3HTdRHTdR），当），当DNADNA复制时，复制时，3 3HTdRHTdR掺入正在掺入正在分裂的细胞的分裂的细胞的DNADNA中。细胞增殖程度与细胞内掺中。细胞增殖程度与细胞内掺入的入的3 3HTdRHTdR的量成正比。通过用液闪仪定量测定的量成正比。通过用液闪仪定量测定培养细胞中的放射性强度，就可以确定培养细胞中的放射性强度，就可以确定T T细胞增殖细胞增殖的能力与强度。的能力与强度。丝裂原诱导的增殖反应诱导诱导T细胞增殖反应的丝裂原细胞增殖反应的丝裂原 1.PHA1.PHA（植物血凝素）（植物血凝素）2.Con A 2.Con A（刀豆蛋白（刀豆

4、蛋白 A A）3.PMN 3.PMN（美洲商陆）（美洲商陆）T T细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定丝裂原诱导的增殖反应技术方法技术方法1.1.用用RPMIRPMI1010将将PBMCPBMC配成配成1x101x106 6/ml/ml的悬液。的悬液。2.2.用用100g/ml100g/ml的的PHAPHA配制配制1:101:10、1:201:20和和1:401:40稀释液。稀释液。3.963.96孔板中选择一行（共孔板中选择一行（共1212孔），每孔中加入孔），每孔中加入100100 l l细胞。指定每相邻细胞。指定每相邻3 3孔为一组。前孔为一组。前3 3组分别

5、加入组分别加入一种稀释度的一种稀释度的PHAPHA溶液，最后一组加培养液溶液，最后一组加培养液（对照组）。（对照组）。4.374.37 C C，5 5COCO2 2，54h54h。5.5.配制浓度为配制浓度为50ci/ml50ci/ml的的3 3HTdRHTdR。T T细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定丝裂原诱导的增殖反应6.6.每孔加入每孔加入50ci 50ci 3 3HTdRHTdR，继续培养，继续培养18h18h。7.7.用多孔自动收集仪分别收集每孔细胞于一小管中。用多孔自动收集仪分别收集每孔细胞于一小管中。溶解细胞，将溶解细胞，将DNADNA过滤到滤纸上，

6、洗去未掺入过滤到滤纸上，洗去未掺入的的3 3HTdRHTdR，最后用，最后用100100的甲醇洗涤，以利滤纸的甲醇洗涤，以利滤纸干燥。干燥。8.8.将滤纸放入液闪管内，自动计数，打印结果。将滤纸放入液闪管内，自动计数，打印结果。9.9.扣除本底，计算每一组扣除本底，计算每一组3 3个复本的平均数。个复本的平均数。T T细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定丝裂原诱导的增殖反应影响因素影响因素1.1.细胞活力：冷冻技术影响细胞活力，复苏后应检细胞活力：冷冻技术影响细胞活力，复苏后应检查细胞活力。查细胞活力。2.2.培养液中添加的血清：有些血清可能激活或抑制培养液中添加的

7、血清：有些血清可能激活或抑制细胞增殖。如欲测定人体细胞增殖能力，可采用细胞增殖。如欲测定人体细胞增殖能力，可采用灭活的灭活的ABAB血清。血清。3.3.细胞培养板类型：根据细胞数量采用不同形状底细胞培养板类型：根据细胞数量采用不同形状底部的培养板。部的培养板。4.4.微生物污染：可降低细胞增殖能力。微生物污染：可降低细胞增殖能力。T T细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定单向混合淋巴细胞培养反应原理原理原理原理 T T细胞受体能够识别同种异型细胞受体能够识别同种异型MHCMHC分子。当把分子。当把2 2个不同个个不同个体的单个核细胞在体外混合时，可以相互刺激，引起增

8、殖。体的单个核细胞在体外混合时，可以相互刺激，引起增殖。增殖的强度与两者之间增殖的强度与两者之间MHCMHC的差别的程度成正比。所以同的差别的程度成正比。所以同种异型混合淋巴细胞反应的强度反映种异型混合淋巴细胞反应的强度反映2 2个个体之间个个体之间MHCMHC差差别的程度，并且因为相互识别与增殖，结果是别的程度，并且因为相互识别与增殖，结果是2 2个个体的个个体的淋巴细胞增殖能力的总和。这种试验就是淋巴细胞增殖能力的总和。这种试验就是双向混合淋巴细双向混合淋巴细胞培养试验。胞培养试验。将参加反应之一方的单个核细胞用放射性核素照射，使将参加反应之一方的单个核细胞用放射性核素照射，使其失去反应能

9、力，但仍保存刺激能力，成为刺激细胞，则其失去反应能力，但仍保存刺激能力，成为刺激细胞，则此时的反应结果仅反映另一方（反应方）的增殖能力。在此时的反应结果仅反映另一方（反应方）的增殖能力。在实质性器官移植时，只需了解受者淋巴细胞对供者实质性器官移植时，只需了解受者淋巴细胞对供者MHCMHC的的反应能力，所以适合采用反应能力，所以适合采用单向混合淋巴细胞培养反应单向混合淋巴细胞培养反应。T T细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定单向混合淋巴细胞培养试验方法方法 1.1.分离宿主与供者的分离宿主与供者的PBMCPBMC，调整细胞浓度为，调整细胞浓度为1 x 1 x 101

10、06 6/ml/ml。2.2.刺激细胞灭活：用丝裂霉素（终浓度刺激细胞灭活：用丝裂霉素（终浓度2525gg，37 37 C C，5 5C C，30min30min）或放射性核素照射（）或放射性核素照射（2000 rad2000 rad）的方法处理刺激细胞。的方法处理刺激细胞。3.96 3.96孔板中，每孔加入孔板中，每孔加入1x101x105 5的刺激细胞和的刺激细胞和1x101x105 5反反应细胞。应细胞。3737 C C，5 5COCO2 2，4 46d6d。加。加3 3HTdRHTdR，继，继续培养续培养18h18h。阳性对照孔加反应细胞和丝裂原，不。阳性对照孔加反应细胞和丝裂原，不加

11、刺激细胞。阴性对照孔只加照射的自身细胞。加刺激细胞。阴性对照孔只加照射的自身细胞。3 3复本。复本。4.4.收集细胞，液闪仪计数，打印结果。收集细胞，液闪仪计数，打印结果。T T细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定单向混合淋巴细胞培养 5.5.计算相对反应（计算相对反应（RRRR）（实验组（实验组cpmcpm阴性对照组阴性对照组cpmcpm）RR RR 阳性对照组阳性对照组cpmcpm阴性对照组阴性对照组cpm cpm T T细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定单向混合淋巴细胞培养注意点注意点 1.1.细胞活力：使用冷冻细胞时，复苏后应检查细细胞活力：使用冷冻细胞时，复

12、苏后应检查细胞活力。胞活力。2.2.培养液中添加的血清：有的血清可能会刺激或培养液中添加的血清：有的血清可能会刺激或抑制反应。抑制反应。3.3.本底应小于本底应小于2000 rpm2000 rpm，阳性对照组应大于，阳性对照组应大于20000 20000 rpmrpm。T T细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定抗原诱导的特异性增殖反应原理原理 本试验测定本试验测定T T细胞在体外对某一特定抗原的特细胞在体外对某一特定抗原的特异性免疫应答能力。所用抗原可以是初次接触的异性免疫应答能力。所用抗原可以是初次接触的抗原，也可以是曾经免疫过的抗原。常用的测定抗原，也可以是曾经

13、免疫过的抗原。常用的测定回忆反应的抗原有纯化蛋白衍生物（回忆反应的抗原有纯化蛋白衍生物（PPDPPD）和破）和破伤风类毒素（伤风类毒素（TTTT）。这）。这2 2种抗原都被常规列入计种抗原都被常规列入计划免疫接种范畴，成人应该对它们有回忆反应。划免疫接种范畴，成人应该对它们有回忆反应。在某些免疫缺陷病中，对它们的特异性回忆反应在某些免疫缺陷病中，对它们的特异性回忆反应可减弱或消失。可减弱或消失。T T细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定抗原诱导的特异性增殖反应方法方法（以（以T T细胞对破伤风类毒素刺激的增殖反应为细胞对破伤风类毒素刺激的增殖反应为例）例）1.1.分

14、离分离PBMCPBMC和和APCAPC，APCAPC用丝裂霉素或放射性核素用丝裂霉素或放射性核素处理。处理。2.962.96孔板中每孔加入孔板中每孔加入1x101x105 5 PBMCPBMC和和1x101x104 4 APCAPC。3.3.每孔中加入系列稀释的破伤风类毒素溶液，不同每孔中加入系列稀释的破伤风类毒素溶液，不同孔中抗原终浓度分别为孔中抗原终浓度分别为0 0、1 1、5 5、1010和和2020 g/mlg/ml。每一种浓度设每一种浓度设3 3复本。复本。4.37C4.37C，5 5COCO2 2，6 6天。天。5.5.加加3 3HTdRHTdR，继续培养，继续培养1818小时。计

15、数。小时。计数。T T细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定抗原诱导的特异性增殖反应结果解释结果解释1.1.对于接种过破伤风疫苗者来说，本试验结果呈低对于接种过破伤风疫苗者来说，本试验结果呈低反应反映患者对破伤风类毒素特异性应答能力低反应反映患者对破伤风类毒素特异性应答能力低下或全身免疫缺陷。下或全身免疫缺陷。2.HIV2.HIV感染者反应低下反映感染者反应低下反映CD4CD4+T T细胞减少导致的细胞减少导致的免疫缺陷。免疫缺陷。T T细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定抗原诱导的特异性增殖反应注意点注意点1.1.培养液中最好用人培养液中

16、最好用人ABAB血清。血清。2.2.此此T T细胞增殖反应需要细胞增殖反应需要APCAPC。如使用纯化。如使用纯化T T细胞，细胞，需加需加5 51010自身自身APCAPC。n nT T细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定抗原诱导的特异性增殖反应应用实践应用实践1.1.丝裂原诱导的增殖反应丝裂原诱导的增殖反应丝裂原诱导的增殖反应丝裂原诱导的增殖反应 临床上用于评估临床上用于评估T T细胞对多克隆刺激剂的增殖细胞对多克隆刺激剂的增殖能力，反映能力，反映T T细胞基本免疫功能，即细胞基本免疫功能，即T T细胞群总体细胞群总体的信息，不能反映个别的信息，不能反映个别T

17、T细胞克隆的情况细胞克隆的情况 PHA PHA常用于测试人常用于测试人T T细胞增殖能力，细胞增殖能力，Con ACon A常常用于测试小鼠用于测试小鼠T T细胞增殖能力。细胞增殖能力。T T细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定抗原诱导的特异性增殖反应应用实践应用实践2.2.单向混合淋巴细胞反应单向混合淋巴细胞反应 1 1）本方法主要用于估计器官移植前供体与受者）本方法主要用于估计器官移植前供体与受者之间之间MHCMHC相配程度。相配程度。2 2）如培养时间超过）如培养时间超过96 96 小时，可制备细胞毒性小时，可制备细胞毒性T T细胞（细胞（CTLCTL）。）。

18、T T细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定抗原诱导的特异性增殖反应应用实践应用实践 3.3.抗原诱导的特异性增殖反应抗原诱导的特异性增殖反应 用于估计机体对特异性抗原的应答能力和机体用于估计机体对特异性抗原的应答能力和机体总体免疫应答能力。总体免疫应答能力。T T细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定细胞增殖功能测定B细胞产生抗体能力的测定基础理论基础理论 B B细胞受到多克隆激活剂或特异性抗原刺激后，细胞受到多克隆激活剂或特异性抗原刺激后，活化、增殖，最后分化成为浆细胞，产生抗体。活化、增殖，最后分化成为浆细胞，产生抗体。抗体可以在血浆和其他体液中检出，

19、检测抗体是抗体可以在血浆和其他体液中检出，检测抗体是测定测定B B细胞功能的最重要的方法。细胞功能的最重要的方法。B B细胞分类：细胞分类：B1B1细胞和细胞和B2B2细胞。两者发生学不同、细胞。两者发生学不同、接受刺激的抗原不同，对接受刺激的抗原不同，对T T细胞的依赖性不同。细胞的依赖性不同。由于由于B2B2细胞对抗原的应答依赖细胞对抗原的应答依赖T T细胞，所以，细胞，所以，B B细胞产生抗体能力的低下，其缺陷也可能起源于细胞产生抗体能力的低下，其缺陷也可能起源于T T细胞缺陷。细胞缺陷。丝裂原诱导多克隆抗体产生能力的测定基础理论基础理论 人人B B细胞具有细胞具有PWMPWM受体，在体

20、外受到受体，在体外受到PWMPWM刺激刺激时，发生多克隆激活，产生多克隆抗体。时，发生多克隆激活，产生多克隆抗体。B B细胞产细胞产生抗体的能力可以用生抗体的能力可以用ELISAELISA测定培养上清中抗体测定培养上清中抗体的量估计，也可以用的量估计，也可以用ELISPOTELISPOT方法测定产生抗体方法测定产生抗体的的B B细胞数量估计。细胞数量估计。n nB B细胞产生抗体能力的测定细胞产生抗体能力的测定细胞产生抗体能力的测定细胞产生抗体能力的测定丝裂原诱导多克隆抗体产生能力的测定技术方法与评价技术方法与评价1.1.分离分离PBMC96PBMC96孔板中每孔加入孔板中每孔加入1x1051

21、x105细胞和细胞和PWMPWM终终浓度（浓度（1 1：100100）。阴性对照孔内不加）。阴性对照孔内不加pWMpWM。每一。每一实验设实验设2 2 复本。复本。2.37C52.37C5CO2CO2培养培养1010天（天（ELISAELISA）或）或7 7天天（ELISPOTELISPOT）。）。3.3.收集上清，用收集上清，用ELISAELISA法测抗体。收集细胞，用法测抗体。收集细胞，用ELISPOTELISPOT法测产生抗体的法测产生抗体的B B细胞。细胞。B B细胞产生抗体能力的测定细胞产生抗体能力的测定细胞产生抗体能力的测定细胞产生抗体能力的测定丝裂原诱导多克隆抗体产生能力的测定应

22、用实践应用实践1.1.用于确定用于确定B B细胞活化和分化的信号转导机制，以及细胞活化和分化的信号转导机制，以及细胞因子和其它银子对细胞因子和其它银子对B B细胞分化的影响。细胞分化的影响。2.2.因为因为B2B2细胞产生抗原需要细胞产生抗原需要T T细胞辅助，所以又可以细胞辅助，所以又可以用于检测用于检测T T细胞的辅助功能。细胞的辅助功能。3.3.临床上用于研究免疫缺陷病和自身免疫病患者临床上用于研究免疫缺陷病和自身免疫病患者B B细细胞分化异常的机制。胞分化异常的机制。B B细胞产生抗体能力的测定细胞产生抗体能力的测定细胞产生抗体能力的测定细胞产生抗体能力的测定丝裂原诱导多克隆抗体产生能

23、力的测定注意点注意点 采用以抗体为基础的技术（如磁珠法、淘洗法采用以抗体为基础的技术（如磁珠法、淘洗法和流式细胞仪）分离的和流式细胞仪）分离的B B细胞，需考虑抗体对细胞，需考虑抗体对B B细细胞产生抗体的影响（促进或抑制作用）。胞产生抗体的影响（促进或抑制作用）。B B细胞产生抗体能力的测定细胞产生抗体能力的测定细胞产生抗体能力的测定细胞产生抗体能力的测定ELISPOT法基础理论基础理论 ELISPOTELISPOT全称为酶联免疫斑点试验（全称为酶联免疫斑点试验（全称为酶联免疫斑点试验（全称为酶联免疫斑点试验（enzymeenzymelinked immunospot assaylinked

24、 immunospot assay），可用于测定产生），可用于测定产生），可用于测定产生），可用于测定产生IgGIgG和和和和IgMIgM抗体的抗体的抗体的抗体的B B细胞。其方法是用抗原包被固相，细胞。其方法是用抗原包被固相，细胞。其方法是用抗原包被固相，细胞。其方法是用抗原包被固相，然后加入抗原特异性然后加入抗原特异性然后加入抗原特异性然后加入抗原特异性B B细胞。如果细胞。如果细胞。如果细胞。如果B B细胞产生抗体，细胞产生抗体，细胞产生抗体，细胞产生抗体，抗体与板上的抗原结合。加入酶标二抗和显色剂抗体与板上的抗原结合。加入酶标二抗和显色剂抗体与板上的抗原结合。加入酶标二抗和显色剂抗体与

25、板上的抗原结合。加入酶标二抗和显色剂就会显色。一个斑点就代表一个产生抗体的细胞。就会显色。一个斑点就代表一个产生抗体的细胞。就会显色。一个斑点就代表一个产生抗体的细胞。就会显色。一个斑点就代表一个产生抗体的细胞。B B细胞产生抗体能力的测定细胞产生抗体能力的测定细胞产生抗体能力的测定细胞产生抗体能力的测定ELISPOT法技术方法技术方法1.1.抗原包被：抗原包被：37C2h37C2h，或，或4C4C过夜。固相载体可用聚过夜。固相载体可用聚苯乙烯平皿、亚硝酸纤维膜、苯乙烯平皿、亚硝酸纤维膜、9696孔板。孔板。2.2.抗体生成细胞培育：加入适量抗体生成细胞，抗体生成细胞培育：加入适量抗体生成细胞

26、，37C37C，5 5COCO2 2，3 34h4h，或过夜。洗涤，去除为与，或过夜。洗涤，去除为与固相结合的细胞。固相结合的细胞。3.3.测定斑点产生细胞：加二抗，测定斑点产生细胞：加二抗，37C 37C，5 5COCO2 2，2 23h3h。加辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶和底物显。加辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶和底物显色。色。4 4 计数：计数：24h24h后用后用10103030倍显微镜下计数斑点形成细倍显微镜下计数斑点形成细胞。胞。B B细胞产生抗体能力的测定细胞产生抗体能力的测定细胞产生抗体能力的测定细胞产生抗体能力的测定ELISPOT法评价评价1.1.在操作中应使用无关抗原作阴性对照；

27、病应排除在操作中应使用无关抗原作阴性对照；病应排除细胞标本终抗体污染。细胞标本终抗体污染。2.2.硝酸纤维素膜灵敏度高于聚苯乙烯。硝酸纤维素膜灵敏度高于聚苯乙烯。3.3.与与ELISAELISA联合使用，可以估计单个细胞的抗体产联合使用，可以估计单个细胞的抗体产量。量。4 4 当淋巴细胞受到严重污染时，也可以使用本法，当淋巴细胞受到严重污染时，也可以使用本法，所以适用于测定组织中抗体生成细胞。所以适用于测定组织中抗体生成细胞。应用实践应用实践应用实践应用实践用途同用途同ELISAELISA法。本方法可用于任何可溶性抗原。法。本方法可用于任何可溶性抗原。B B细胞产生抗体能力的测定细胞产生抗体能

28、力的测定细胞产生抗体能力的测定细胞产生抗体能力的测定ELISA测定各类免疫球蛋白基础理论基础理论 B B细胞受抗原刺激后，最初产生细胞受抗原刺激后，最初产生IgMIgM抗体，然抗体，然后在后在ThTh细胞产生的各种细胞因子的作用下，可转细胞产生的各种细胞因子的作用下，可转类成为类成为IgGIgG、IgAIgA、IgEIgE类抗体。应用不同的单抗，类抗体。应用不同的单抗，结合结合ELISAELISA方法，可以测定方法，可以测定B B细胞产生的抗体的类细胞产生的抗体的类别。别。B B细胞产生抗体能力的测定细胞产生抗体能力的测定细胞产生抗体能力的测定细胞产生抗体能力的测定ELISA测定各类免疫球蛋白

29、方法方法1.1.包板：包板：9696孔板用浓度为孔板用浓度为1010g/mlg/ml的特异性的特异性单单抗包被。盖上盖抗包被。盖上盖板，板，37C37C，5 5COCO2 2，2h2h，或，或4C4C过夜。常规洗板，封闭。过夜。常规洗板，封闭。2.2.上样：每孔内加入上样：每孔内加入1:101:10或或1:20 1:20 稀释的细胞培养上清液稀释的细胞培养上清液100100ll。阳性阳性对对照照为标为标准品，阴性准品，阴性对对照照为为培养液。每培养液。每试验设试验设2 2复本。复本。室温培育室温培育2h2h，或，或4C4C过夜。过夜。3.3.加酶标二抗：每孔加加酶标二抗：每孔加100100ll

30、碱性磷酸碱性磷酸酶酶标记标记的羊抗人的羊抗人IgMIgM或或IgGIgG或或IgAIgA二抗。室温培育二抗。室温培育2h2h，或，或4C4C过夜。过夜。4.4.显色：洗板，每孔加显色：洗板，每孔加100100ll底物（底物（p pnitrophenyl phosphatenitrophenyl phosphate）。）。5.5.自动酶标仪读数，从标准曲线读出抗体浓度。自动酶标仪读数，从标准曲线读出抗体浓度。B B细胞产生抗体能力的测定细胞产生抗体能力的测定细胞产生抗体能力的测定细胞产生抗体能力的测定ELISA测定各类免疫球蛋白评价评价 ELISA ELISA法灵敏、简单、快速、特异性高、重复法

31、灵敏、简单、快速、特异性高、重复性好，是测定上清和体液中性好，是测定上清和体液中IgIg的首选方法。碱性的首选方法。碱性磷酸酶标记的二抗显色明显，不必用碱中止反应，磷酸酶标记的二抗显色明显，不必用碱中止反应，尤其适用于测定体外产生的抗体。尤其适用于测定体外产生的抗体。应用实践应用实践 ELISA ELISA可测定各种体液中的抗体，其结果反映可测定各种体液中的抗体，其结果反映被检个体被检个体B B细胞功能。测定免疫球蛋白各种亚类的细胞功能。测定免疫球蛋白各种亚类的水平有助于鉴定免疫缺陷病。水平有助于鉴定免疫缺陷病。B B细胞产生抗体能力的测定细胞产生抗体能力的测定细胞产生抗体能力的测定细胞产生抗

32、体能力的测定CTL杀伤功能的测定杀伤功能的测定基础理论基础理论 CTL CTL为细胞毒性为细胞毒性T T淋巴细胞的简称。是淋巴细胞的简称。是CD8CD8T T细细胞识别胞识别APCAPC表面表面MHC IMHC I类分子递呈的肿瘤或病毒类分子递呈的肿瘤或病毒特异性抗原肽后，分化形成的。当特异性抗原肽后，分化形成的。当CTLCTL遇到相应遇到相应的肿瘤细胞或病毒感染细胞时，能够通过细胞接的肿瘤细胞或病毒感染细胞时，能够通过细胞接触机制或裂解机制杀伤靶细胞。触机制或裂解机制杀伤靶细胞。CTL杀伤功能的测定杀伤功能的测定1.1.细胞接触机制细胞接触机制 CTL CTL表达表达FasLFasL，靶细胞

33、表达，靶细胞表达FasFas，FasLFasL与与FasFas的配的配接，通过接，通过FasFas传入的信号激活靶细胞内细胞凋亡途传入的信号激活靶细胞内细胞凋亡途径，导致靶细胞死亡。径，导致靶细胞死亡。2.2.细胞裂解机制细胞裂解机制 CTL CTL激活后，胞质内颗粒向激活后，胞质内颗粒向2 2个细胞接触点移动。个细胞接触点移动。颗粒膜与细胞膜融合通过外吐释放颗粒内容物。颗粒膜与细胞膜融合通过外吐释放颗粒内容物。穿孔素插入靶细胞膜后聚合，喜爱细胞膜上形成穿孔素插入靶细胞膜后聚合，喜爱细胞膜上形成孔，造成细胞裂解。颗粒酶诱导靶细胞凋亡。孔，造成细胞裂解。颗粒酶诱导靶细胞凋亡。CTL杀伤功能的测定

34、杀伤功能的测定 51Cr标记法原理标记法原理 如在将靶细胞与如在将靶细胞与CTLCTL混合之前，先用放射性核混合之前，先用放射性核素素5151CrCr培育，培育，5151CrCr能穿过细胞膜进入胞浆，与胞浆能穿过细胞膜进入胞浆，与胞浆中小分子蛋白质牢固结合，不能自由从细胞内释中小分子蛋白质牢固结合，不能自由从细胞内释放。当靶细胞膜被放。当靶细胞膜被CTLCTL破坏后，破坏后，5151CrCr被释放进入上被释放进入上清。因为上清中放射性强度与细胞杀伤程度呈正清。因为上清中放射性强度与细胞杀伤程度呈正比，通过测定上清中放射性强度，就可以判定比，通过测定上清中放射性强度，就可以判定CTLCTL杀伤能

35、力。杀伤能力。CTL杀伤功能的测定杀伤功能的测定技术方法技术方法1.1.从肿瘤组织中分离淋巴细胞和肿瘤细胞。从肿瘤组织中分离淋巴细胞和肿瘤细胞。2.2.5151CrCr标记肿瘤细胞。标记肿瘤细胞。3.963.96孔培养板每孔中加入淋巴细胞和靶细胞，效：孔培养板每孔中加入淋巴细胞和靶细胞，效：靶比为靶比为50:150:1，25:125:1，12.5:112.5:1。另设最大释放对照（靶。另设最大释放对照（靶细胞加去污剂）和自发释放对照（不加细胞加去污剂）和自发释放对照（不加CTLCTL）。）。4.37C4.37C，5 5COCO2 2，4h4h。5.5.收集上清，收集上清，计数器测定计数器测定放

36、射活性（放射活性（cpmcpm）。）。CTL杀伤功能的测定杀伤功能的测定 计算公式计算公式计算公式计算公式 试验组平均试验组平均CPMCPM值自发释放组平均值自发释放组平均cpmcpm值值溶解溶解 最大释放平均最大释放平均cpmcpm值自发释放平均值自发释放平均cpmcpm值值注意点注意点注意点注意点由于由于CTLCTL杀伤靶细胞受杀伤靶细胞受MHCMHC限制，所以靶细胞必须限制，所以靶细胞必须来自自身，或选用表达适当来自自身，或选用表达适当MHCMHC的肿瘤细胞系。的肿瘤细胞系。评价评价评价评价优点优点优点优点：方法简单、快速，能定量方法简单、快速，能定量。缺点缺点缺点缺点：自然释放率较高，

37、需要的靶细胞量多。使用自然释放率较高，需要的靶细胞量多。使用放射性核素。放射性核素。CTL杀伤功能的测定杀伤功能的测定应用实践这一方法常用于评估肿瘤患者CTL杀伤肿瘤的能力，可作为判断雨后和观察疗效的指标之一。NK细胞毒性测定细胞毒性测定基础理论基础理论基础理论基础理论 NK NK细胞存在于外周血、淋巴组织中，尤以脾脏最为丰细胞存在于外周血、淋巴组织中，尤以脾脏最为丰富。因细胞体积大和胞浆内含大量颗粒，故称大颗粒淋巴富。因细胞体积大和胞浆内含大量颗粒，故称大颗粒淋巴细胞。表型特征是细胞。表型特征是CD16CD16（FcFc RIII ARIII A）和和CD56CD56（神经细（神经细胞粘附分

38、子）。当胞粘附分子）。当NKNK细胞识别肿瘤细胞活病毒感染细胞细胞识别肿瘤细胞活病毒感染细胞时，时，CD16CD16分子被交联，引起脱颗粒，并分泌分子被交联，引起脱颗粒，并分泌IFNIFN 和和TNFTNF。颗粒中含有穿孔素、颗粒酶和。颗粒中含有穿孔素、颗粒酶和proteoglycansproteoglycans，引起，引起靶细胞溶胀性死亡和凋亡。靶细胞溶胀性死亡和凋亡。NKNK细胞的细胞的CD16CD16与与IgG1IgG1和和IGg3IGg3结合，可介导结合，可介导ADCCADCC作用。作用。NK NK细胞表达一种能识别细胞表达一种能识别HLAHLAA A、B B、C C抗原的受体，抗原的

39、受体，向细胞发出一致性信号，阻止向细胞发出一致性信号，阻止NKNK细胞的杀伤活性。当靶细胞的杀伤活性。当靶细胞不表达或低表达细胞不表达或低表达HLA IHLA I类分子时，抑制解除，类分子时，抑制解除，NKNK细胞细胞活化，杀伤靶细胞。活化，杀伤靶细胞。K562 K562细胞系不表达细胞系不表达HLAHLA分子，对分子，对NKNK细胞杀伤作用敏感，细胞杀伤作用敏感，常用作常用作NKNK细胞的靶细胞，用于检测细胞的靶细胞，用于检测NKNK细胞的活性。细胞的活性。NK细胞毒性测定细胞毒性测定技术方法技术方法1.NK1.NK细胞的分离：用抗细胞的分离：用抗CD3CD3、CD19CD19、CD14CD

40、14单抗和单抗和淘洗法，去除淘洗法，去除T T细胞、细胞、B B细胞和细胞和MoMo，获取，获取NKNK细胞。细胞。2.2.加板：加板：方法同方法同CTLCTL杀伤试验。不同的是，靶细胞杀伤试验。不同的是，靶细胞为为K562K562细胞。最大释放组为靶细胞中加去污剂，细胞。最大释放组为靶细胞中加去污剂，自发释放对照组中不加自发释放对照组中不加NkNk细胞。细胞。37C37C，5 5COCO2 2，4h4h。3.3.收集上清液，收集上清液，计数器测各孔计数器测各孔cpmcpm值。值。4.4.计算溶解值：方法同计算溶解值：方法同CTLCTL法。法。NK细胞毒性测定细胞毒性测定评价评价1.1.本方法

41、稳定，但本方法稳定，但5151CrCr污染环境。污染环境。2.2.从外周血中从外周血中 分离的分离的NKNK细胞是静止细胞，只能杀细胞是静止细胞，只能杀死对峙敏感的死对峙敏感的K562K562细胞系，不能杀伤其它肿瘤细细胞系，不能杀伤其它肿瘤细胞。胞。3.3.冷冻保存影响冷冻保存影响NKNK细胞活性，故宜采用新鲜分离的细胞活性，故宜采用新鲜分离的NKNK细胞。细胞。4.4.人血清中含有的人血清中含有的IgGIgG会抑制会抑制NKNK细胞的杀伤活性，细胞的杀伤活性，故培养液中宜使用小牛血清。故培养液中宜使用小牛血清。NK细胞毒性测定应用实践应用实践 检测检测NKNK细胞免疫活性。在疾病状态下，细

42、胞免疫活性。在疾病状态下，NKNK细细胞的功能会受到影响。胞的功能会受到影响。LAK细胞毒性测定细胞毒性测定基础理论基础理论 LAKLAK细胞是淋巴因子激活杀伤细胞的简称。细胞是淋巴因子激活杀伤细胞的简称。NKNK细胞在大剂量细胞在大剂量ILIL2 2刺激下扩增并分化成为刺激下扩增并分化成为LAKLAK细胞。细胞。LAKLAK细胞对新鲜分离的肿瘤细胞或肿细胞对新鲜分离的肿瘤细胞或肿瘤细胞系具有非特异性杀伤作用。临床上用瘤细胞系具有非特异性杀伤作用。临床上用LAKLAK细胞过继性治疗某些肿瘤患者，例如肾细胞癌、细胞过继性治疗某些肿瘤患者，例如肾细胞癌、黑色素瘤合霍奇金病，有一定疗效。黑色素瘤合霍

43、奇金病，有一定疗效。LAK细胞毒性测定细胞毒性测定技术方法技术方法1.1.制备：抽取患者外周血制备：抽取患者外周血20ml20ml，分离，分离PBMCPBMC。培养皿。培养皿中加入重组中加入重组ILIL2 2，是终浓度为，是终浓度为100U/ml100U/ml。37C37C，5 5CO2CO2，培养，每，培养，每3 34 4天换液；细胞数增加时分天换液；细胞数增加时分瓶。瓶。2.2.培养培养7 71010天。收集细胞，计数。细胞需要量为天。收集细胞，计数。细胞需要量为10109 910101010。3.LAK3.LAK细胞毒性检测：方法同细胞毒性检测：方法同NKNK细胞毒性检测，不细胞毒性检测

44、，不同的是，本方法使用的靶细胞为肿瘤细胞系同的是，本方法使用的靶细胞为肿瘤细胞系 Daudi Daudi细胞。细胞。LAK细胞毒性测定细胞毒性测定应用实践应用实践1.1.用于检测用于检测NKNK细胞的功能：正常人细胞的功能：正常人NKNK细胞在大剂细胞在大剂量量ILIL2 2作用下能够分化成为作用下能够分化成为LAKLAK细胞。细胞。NKNK细胞细胞功能缺陷者，分化能力降低。检测功能缺陷者，分化能力降低。检测LAKLAK细胞活性细胞活性可以作为衡量可以作为衡量NKNK细胞功能活性的指标。细胞功能活性的指标。2.2.检测检测LAKLAK细胞的细胞毒性：预测细胞的细胞毒性：预测LAKLAK细胞功能活细胞功能活性。性。