CR引物设计及相关软件数据裤的使用.ppt

《CR引物设计及相关软件数据裤的使用.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《CR引物设计及相关软件数据裤的使用.ppt（91页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、 分子生物学实验课分子生物学实验课 1、欢迎欢迎大家大家参加分生实验参加分生实验的学习；的学习；2 2、学习分生实验的、学习分生实验的重要性重要性；3 3、课堂上守纪律，听老师安排，、课堂上守纪律，听老师安排，做实验穿白衣做实验穿白衣；4 4、每组做一份实验、每组做一份实验5 5、上课时间：上午、上课时间：上午8:00,下午下午13:00.6 6、每天实验结束应主动整理实验台，、每天实验结束应主动整理实验台，值日安排值日安排。实验仪器的使用及注意事项实验仪器的使用及注意事项加样器加样器离心机离心机一、加样器一、加样器1、用途用途 2、如何使用？如何使用？根据取样量，选择合适的加样器。根据取样量

2、，选择合适的加样器。顶部标有加样器的最大量程，分别为：顶部标有加样器的最大量程，分别为：20ul:0.5 20 l100/200ul:20 100/200 l 1000ul:200ul 1000 l 5ul、50ul、500ul，应选择哪个加样器应选择哪个加样器?练习：加样器读数为练习：加样器读数为 10100 0，实际体积各为多少，实际体积各为多少?(1)(1)首先观察目前读数首先观察目前读数,假设为假设为050:050:1000 1000 l:500 l:500 l l 100/200 100/200 l:50 l:50 l l 20 20 l l：5 5 l l (2)(2)顺时针调节顺

3、时针调节-读数变小读数变小 逆时针调节逆时针调节-读数变大读数变大(3)(3)加加样样器器读读数数处处于于最最大大量量程程或或最最小小量量程程时时，如如果果向向错错误误方方向向调节，调节，超出量程，将超出量程，将会损害加样器的精度会损害加样器的精度。如何调节加样器。如何调节加样器。1 1）选择选择加样器加样器 观察读数；调节读数；2 2）安装安装吸头（紧密）；吸头（紧密）；3 3）吸取吸取液体液体 按加样器第一挡；将吸头插入液面下适当深度；松开拇指（缓慢）,吸取液体 4 4）打出打出液体液体 抬起加样器；估计体积是否正确；移入容器；按到加样器第二档；打出液体（匀速）加样器使用步骤加样器使用步骤

4、(示教及学生练习示教及学生练习)：加样器使用注意事项：加样器使用注意事项：1 1）吸头的安装（紧密）吸头的安装（紧密）不要用手直接拿吸头，安上吸头安上吸头后一定要再固定一下再固定一下2 2）吸取液体）吸取液体 枪头不能插入过深或过浅过深或过浅，过深可能会腐蚀加样器,过浅可能会吸入空气。吸取完液体后，估计体积的准确性估计体积的准确性（加样器可能会不准）吸头内有液体时，不能将加样器倒置或平放加样器倒置或平放，以防液体倒流损坏加样器！3 3）打出液体）打出液体 观察吸头内液体液体是否完全打出完全打出 1 1、打开电源打开电源 2 2、离心管中的液体为、离心管中的液体为2/3,2/3,盖紧盖子盖紧盖子

5、,防止离心机被腐蚀。防止离心机被腐蚀。1 代表转速盘上方的数据2 代表下方的数据。3 3、样品配平样品配平,对称放入离心机对称放入离心机(管管的连接处朝外的连接处朝外).).二、离心机二、离心机 4 4、设定时间、设定时间(旋转时间转扭，然后自旋转时间转扭，然后自己记时间）。己记时间）。5 5、统一离心，逐渐升到要求转速。、统一离心，逐渐升到要求转速。六个小组统一用一个离六个小组统一用一个离心机心机一起离心一起离心实验课的整体安排实验课的整体安排基因克隆基因克隆3天天.RNA提取逆转录及提取逆转录及PCR重组质粒5天天.重组质粒重组质粒提取及酶切提取及酶切TA 连接连接,T载体转化，转化，平板

6、筛选平板筛选2天，基因天，基因组组DNA提取及提取及酶酶切后切后电电泳离泳离1天天.序列查找及引物的设计序列查找及引物的设计4 天天PCR引物设计及相关软件数据引物设计及相关软件数据库的使用库的使用.本次实验课课件不允许拷贝本次实验课课件不允许拷贝介绍如何查找基因的序列介绍如何查找基因的序列介绍介绍NCBINCBI的数据库，及检索页面的数据库，及检索页面介绍如何设计介绍如何设计PCRPCR引物，及设计引物的注意事项引物，及设计引物的注意事项 扩增目的基因的全长扩增目的基因的全长 扩增目的基因的任意一部分扩增目的基因的任意一部分讲解的内容（上午）讲解的内容（上午）介绍常规的生物学软件的使用介绍常

7、规的生物学软件的使用 Primer 5.0;Oligo 6.0;Blast;PCRDESIGN；讲解的内容（上午）讲解的内容（上午）(一）如何查找基因的序列一）如何查找基因的序列观看录像观看录像GenBank 数据库数据库GenBank-序列数据库序列数据库GenBank-是是NIH遗传序列数据库，一个所有可以公遗传序列数据库，一个所有可以公开获得的开获得的DNA序列的注释过的收集序列的注释过的收集网址：1.打开打开网络演示网络演示1.1.根据文献根据文献如果你在文献种看到你感兴趣的基因，而且文中还提到在如果你在文献种看到你感兴趣的基因，而且文中还提到在GenbankGenbank中的中的ID

8、ID号号直接打开直接打开，在，在searchsearch后下拉框只中选择后下拉框只中选择NucleotideNucleotide，把，把Gnebank IDGnebank ID号（号（AJ318831.1)输入输入GOGO前面的文本框中，点前面的文本框中，点GoGo就可以找到了。就可以找到了。例如：在在2012年年发发表表Biotechlogy letters 文章文章(TheFMDVserotypebovineOFMDVusedtochallengesucklingmicewasstrainO/CHA/2/99(GenBankNO.AJ318831.1).http:/www.ncbi.nlm

9、.nih.gov，在，在Search后的后的下拉框中选择下拉框中选择Nucleotide，把，把Genbank ID号输入号输入GO前面的文本框中，点前面的文本框中，点“GO”，就可以找到他，就可以找到他了了注意：同学们应该学会注意：同学们应该学会看看Genbank数据库中基数据库中基因的因的ID号号打开打开在在search后面的下拉框中选择后面的下拉框中选择Gene，然后在中间的文本框中输入基因，然后在中间的文本框中输入基因名称名称“IFN-gamma”，点击，点击GO.2.2.从从Gene Gene 数据库中直接查找序列数据库中直接查找序列检索检索4242项，哪一条是呢？项，哪一条是呢？（

10、这也许是大多数人对（这也许是大多数人对GenbankGenbank的第一印象，东西的第一印象，东西太多，不知道是哪一个。）太多，不知道是哪一个。）利用利用limitslimits 高级检索高级检索Limits的意思其实就是高级检索，你可以在这里对检索词进行的意思其实就是高级检索，你可以在这里对检索词进行很多限制，这样能大大精简查询结果。很多限制，这样能大大精简查询结果。这样就能获得我们所想要寻找的基因信息。这样就能获得我们所想要寻找的基因信息。提醒：注意一下右侧的基因提醒：注意一下右侧的基因 相关信息，很有用的。相关信息，很有用的。可以看到可以看到Genomic regions,transcr

11、ipts,and products，这，这里显示了该基因在基因组中的位里显示了该基因在基因组中的位置，以及转录本的生成情况：置，以及转录本的生成情况：若你只想获得序列若你只想获得序列（例如设计（例如设计PCRPCR引物，引物，可以选择可以选择FASTAFASTA格式。格式。FASTAFASTA格式的序列文件，格式的序列文件，没有其他数字和格式没有其他数字和格式的干扰。的干扰。在获得在获得FASTA格式的格式的序列后，需要关注一序列后，需要关注一下下Genebank 中中CDS的信息，来确认该基的信息，来确认该基因的编码序列。因的编码序列。红色框中的才是红色框中的才是IFN-gamma的编码序列

12、的编码序列IFN-IFN-cDNA cDNA的编码的编码序列序列 at gaaatataca agttatatct tggcttttca gctctgcatc gttttgggtt ctcttggctg ttactgccag gacccatatg taaaagaagc agaaaacctt aagaaatatt ttaatgcagg tcattcagat gtagcggata atggaactct tttcttaggc attttgaaga attggaaaga ggagagtgac agaaaaataa tgcagagcca attgtctcc ttttacttca aactttttaa a

13、aactttaaa gatgaccaga gcatccaaaa gagtgtggag accatcaagg aagacatgaa tgtcaagttt ttcaatagca acaaaaagaa acgagatgac ttcgaaaagc tgactaatta ttcggtaact gacttgaatg tccaacgcaa agcaatacat gaactcatcc aagtgatggc tgaactgtcg ccagcagcta aaacagggaa gcgaaaaagg agtcagatgc tgtttcaagg tcgaagagca tcccagtaa3.3.从从Nucletide数据

14、库中直接查找序列数据库中直接查找序列打开打开在在search后面的下拉框中选择后面的下拉框中选择Nucletide，然后在中间的文本框中输入，然后在中间的文本框中输入基因名称基因名称“IFN-gamma”，点击，点击GO.与与gene gene 数据库进数据库进入，查找的序列入，查找的序列是一样的是一样的。2.2.从从Gene Gene 数据库种查找基因序列的优势：数据库种查找基因序列的优势：可以查看基因在基因组中的位置可以查看基因在基因组中的位置可以查看基因转录本的生成情况，因为有的基因有多种可以查看基因转录本的生成情况，因为有的基因有多种mRNAmRNA根据具体的课题需要选择根据具体的课题

15、需要选择mRNAmRNA剪接体，并选择其对应的编码序列剪接体，并选择其对应的编码序列Gene 数据库与数据库与Nucleotide 数据库查找基因数据库查找基因序列的区别序列的区别1.1.从从Nucleotide Nucleotide 数据库种查找基因序列的优势：数据库种查找基因序列的优势：直接查看基因的直接查看基因的mRNAmRNA序列，查找方式比较简单，快速序列，查找方式比较简单，快速TNF-alpha TNF-alpha 有有七个七个mRNAmRNA剪接剪接体。体。(二）如何设计二）如何设计PCR引物引物观看录像观看录像什么是引物？什么是引物？引物设计的原则是什么？引物设计的原则是什么？

16、介绍常用的引物设计的软件。介绍常用的引物设计的软件。引物同源性分析引物同源性分析介绍内容介绍内容引物是引物是人工合成人工合成的的两段寡核苷酸序列两段寡核苷酸序列。什么是引物？什么是引物？PCR的的特异性特异性要求引物与靶要求引物与靶DNA特异结合，不与其他非目的特异结合，不与其他非目的DNA结合。结合。PCR的的灵敏性灵敏性要求要求DNA聚合酶能对引物进行有效的延伸。聚合酶能对引物进行有效的延伸。PCR反应反应成功成功扩增的一个关键扩增的一个关键条件在于引物条件在于引物的的正确设计正确设计。PCR反应需要两种引物，分别为反应需要两种引物，分别为5引物和引物和3引物引物，或称，或称为正向引物和反

17、向引物。为正向引物和反向引物。引物设计的原则引物设计的原则355355target sequencetarget sequence一个引物与感兴趣区域一端的一条一个引物与感兴趣区域一端的一条DNADNA模板链互补。模板链互补。另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNADNA模板链互补。模板链互补。Genebank上显示的只有一条链的信息，一般情况下显示的是上显示的只有一条链的信息，一般情况下显示的是正链（编码链）。正链（编码链）。靠近正链靠近正链5端称为端称为5引物，靠近正链引物，靠近正链3端称为端称为3引物引物正链正链负链负链首先回顾首先回顾PCRPCR原

18、理：两条引物与模板结合的位置。原理：两条引物与模板结合的位置。5引物3引物at gaaatataca agtgaagagca tcccagtaa3535at gaaatataca agt上游上游(5)引物的结合引物的结合 CTTCTCGTAGGGTCATT下游下游(3)引物的结合引物的结合(1)5(1)5引物照抄，引物照抄，33引物互补倒读引物互补倒读 ：Genebank上显示的只有一条链的信息，一般情况下显示的是上显示的只有一条链的信息，一般情况下显示的是正链（编码链）正链（编码链）(4)(4)引物方向：引物方向：5 5 33(2)(2)长度：长度：特异性序列一般特异性序列一般15-18bp

19、.15-18bp.常常18-27bp18-27bp，应，应 38bp。(3)(3)碱基分布：碱基分布：嘌呤，嘧啶随机分布嘌呤，嘧啶随机分布 ；避免出现堆积现象；避免出现堆积现象。GCGC比值为比值为45-55%45-55%。3 3端和端和5 5端端 引物具有相似的引物具有相似的TmTm值。值。Tm=4(G+C)+2(A+T)Tm=4(G+C)+2(A+T)。(5)(5)引物的引物的3 3 端：端：严格与模板严格与模板DNADNA配对。配对。尤其是引物尤其是引物33末端连续末端连续8 8个碱基要与模板严格互补。否则影响个碱基要与模板严格互补。否则影响DNADNA聚合酶的延伸聚合酶的延伸 引物引物

20、33端要避开密码子的第端要避开密码子的第3 3位位引物引物5 5 端修饰包括：加酶切位点；端修饰包括：加酶切位点；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；加入其它短序列包括起始密码子，终止密码子。加入其它短序列包括起始密码子，终止密码子。标记生物素、荧光、地高辛等；标记生物素、荧光、地高辛等；(6)(6)引物的引物的5 5 端：端：引物的引物的5 5-端设计限制性酶切位点后端设计限制性酶切位点后PCRPCR示意图示意图第一次第一次循环循环第二次第二次循环循环第三次第三次循环循环(7)(7)引物内部不应存在互补序列。以避免折叠成发夹结引物内部不应存在互补序列。以避

21、免折叠成发夹结构构(Hairpin(Hairpin)不能有连续不能有连续5 5个碱基的互补。引物末端一般不达到个碱基的互补。引物末端一般不达到3bp3bp。5-GTTGACTTGATA 3-GAACTCT T(8)(8)引物间不应存在互补序列引物间不应存在互补序列.尤其应避免3端的互补，以免形成引物二聚体 3-TGCTTAAGCACCGATGGCCA-55-ACCGGTAGCCACGAATTCGT-3(9)(9)比较引物与基因组的同源性比较引物与基因组的同源性引物的碱基序列不应与非扩增区域有同源性。与模板之间的引物的碱基序列不应与非扩增区域有同源性。与模板之间的特异性结合序列一般不少于特异性结

22、合序列一般不少于15-18bp15-18bp。引物设计完成以后，应对其进行引物设计完成以后，应对其进行BLASTBLAST检测。如果与其它检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。利用利用Blast来分析来分析 引物与基因引物与基因组的同源性稍后在讲组的同源性稍后在讲已知已知IFN-cDNA序列序列,你该如何设计引物？你该如何设计引物？at gaaatataca agttatatct tggcttttca gctctgcatc gttttgggtt ctcttggctg ttactgccag gacccatatg taaaagaagc

23、 agaaaacctt aagaaatatt ttaatgcagg tcattcagat gtagcggata atggaactct tttcttaggc attttgaaga attggaaaga ggagagtgac agaaaaataa tgcagagcca attgtctcc ttttacttca aactttttaa aaactttaaa gatgaccaga gcatccaaaa gagtgtggag accatcaagg aagacatgaa tgtcaagttt ttcaatagca acaaaaagaa acgagatgac ttcgaaaagc tgactaatta ttc

24、ggtaact gacttgaatg tccaacgcaa agcaatacat gaactcatcc aagtgatggc tgaactgtcg ccagcagcta aaacagggaa gcgaaaaagg agtcagatgc tgtttcaagg tcgaagagca tcccagtaa举一个实例：举一个实例：1.1.设计设计PCR引物引物 -扩增目的基因的全长扩增目的基因的全长2.2.设计设计PCR引物引物 -扩增目的基因的部分扩增目的基因的部分扩增目的基因的全长扩增目的基因的全长1.1.一般情况下，一般情况下，5 5引物引物需需位于位于编码基因的编码基因的起始密码子起始密码子的的

25、位置，位置，3 3引物引物 位于编码基因位于编码基因终止子终止子的位置。的位置。2.2.引物的引物的5 5端需加入多克隆酶切位点端需加入多克隆酶切位点，方便后续的基因，方便后续的基因克隆操作。克隆操作。3.3.注意：保证基因的注意：保证基因的阅读框架的不能改变阅读框架的不能改变。5ATGAAATATACAAGTTATATCT.TCGAAGAGCATCCCAGTAA33TACTTTATATGTTCAATATAGA.AGCTTCTCGTAGGGTCATT5第一步：扩增第一步：扩增IFN-IFN-基本序列基本序列变性变性,引物复性引物复性at gaaatataca agtgaagagca tccca

26、gtaaatg aaatataca agt3535上游上游(5)引物的结合引物的结合 CTTCTCGTAGGGTCATT下游下游(3)引物的结合引物的结合IFN-序列序列5引物引物：5-ATG AAATATACAAGT33引物：引物：3-TTA CTGGGATGCTCTTC3特异性序列是特异性序列是否少了点否少了点?start codonstop codon5引物照抄引物照抄3引物互补倒读引物互补倒读第二步：第二步：GCGC比值；比值；TmTm值值5引物：引物：5-ATG AAATATACAAGT33引物：引物：3-TTA CTGGGATGCTCTTC3GC比值比值 太少太少GC比值比值 太多

27、太多5引物：引物：5GCAGCGGATCC ATG AAATATACAAGT3GC=11 AT=153引物引物:5ATCGGAATTC TTA CTGGGATGCTCTTC3BamHIGC=12 AT=15EcoRI-加酶切位点或加酶切位点或G,CG,C第三步：检测引物的发夹结构，二聚体等。第三步：检测引物的发夹结构，二聚体等。1.1.肉眼观察。肉眼观察。2.2.利用软件检测，稍后在软件使用中讲解。利用软件检测，稍后在软件使用中讲解。经过上述三个步骤后，即将获得扩增经过上述三个步骤后，即将获得扩增IFN-gamma全长的引物：全长的引物：5引物：引物：5GCAGCGGATCC ATG AAAT

28、ATACAAGT33引物引物:5ATCGGAATTC TTA CTGGGATGCTCTTC3然后可以将序列信息送到生物公司进行合成。然后可以将序列信息送到生物公司进行合成。一对引物约一对引物约30元人民币元人民币扩增目的基因的部分序列扩增目的基因的部分序列3.3.根据根据PCRPCR产物的长度，选择产物的长度，选择5 5引物和引物和3 3引物引物 的在编码的在编码基因中的位置：基因中的位置：常规PCR反应中：PCR产物的长度300bp左右；实时定量PCR反应中，PCR产物的长度约150bp左右。1.1.引物的位置最好在引物的位置最好在cDNAcDNA保守区的位置进行设计。保守区的位置进行设计。

29、2.2.一般情况下，在设计一般情况下，在设计RT-PCRRT-PCR引物时，引物时，5 5引物和引物和3 3引引物的距离之间物的距离之间跨越跨越1-21-2个内含子。个内含子。Extron 1intron 1Extron 253 DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件比对，各基因相同的序列就是该基因的保守区。Homo sapiens high mobility group box 1(HMGB1),mRNAgi|118918424|ref|NM_002128.4|Homo sapiens high mobility group

30、box 1(HMGB1),mRNA TGGAGAGTAATGTTACAGAGCGGAGAGAGTGAGGAGGCTGCGTCTGGCTCCCGCTCTCACAGCCATTGCAGTACATTGAGCTCCATAGAGACAGCGCCGGGGCAAGTGAGAGCCGGACGGGCACTGGGCGACTCTGTGCCTCGCTGAGGAAAAATAACTAAACATGGGCAAAGGAGATCCTAAGAAGCCGAGAGGCAAAATGTCATCATATGCATTTTTTGTGCAAACTTGTCGGGAGGAGCATAAGAAGAAGCACCCAGATGCTTCAGTCAACTTCTCAGA

31、GTTTTCTAAGAAGTGCTCAGAGAGGTGGAAGACCATGTCTGCTAAAGAGAAAGGAAAATTTGAAGATATGGCAAAAGCGGACAAGGCCCGTTATGAAAGAGAAATGAAAACCTATATCCCTCCCAAAGGGGAGACAAAAAAGAAGTTCAAGGATCCCAATGCACCCAAGAGGCCTCCTTCGGCCTTCTTCCTCTTCTGCTCTGAGTATCGCCCAAAAATCAAAGGAGAACATCCTGGCCTGTCCATTGGTGATGTTGCGAAGAAACTGGGAGAGATGTGGAATAACACTGCTGCAGATGA

32、CAAGCAGCCTTATGAAAAGAAGGCTGCGAAGCTGAAGGAAAAATACGAAAAGGATATTGCTGCATATCGAGCTAAAGGAAAGCCTGATGCAGCAAAAAAGGGAGTTGTCAAGGCTGAAAAAAGCAAGAAAAAGAAGGAAGAGGAGGAAGATGAGGAAGATGAAGAGGATGAGGAGGAGGAGGAAGATGAAGAAGATGAAGATGAAGAAGAAGATGATGATGATGAATAAGTTGGTTCTAGCGCAGTTTTTTTTTTCTTGTCTATAAAGCA编码区：编码区：164-811黑色区域显示同源性较高的位置（

33、bio Edit 软件分析）第一步第一步.引物的位置最好在引物的位置最好在cDNAcDNA保守区的位置进行设计。保守区的位置进行设计。引物应该选择保守的位置，如150-370.如：470-580.高度变异，引物不能选择这个位置。当基因有多个当基因有多个mRNA剪接体时：剪接体时：第二步第二步.引物的位置最好跨越基因的一个内含子。引物的位置最好跨越基因的一个内含子。外显子的位置：外显子的位置：（1-149,150-313,314-459,364-459,460-634.)上游引物位置上游引物位置.150-313区间内下游引物位置下游引物位置.314-370区间内区间内上一步同源性比较的结果 15

34、0-370的位置为保守区：可以选择：可以选择：上游引物位置上游引物位置.163bp-183bp下游引物位置下游引物位置.307-327选择：选择：第三步第三步.根据根据PCRPCR产物的长度，选择产物的长度，选择5 5引物和引物和3 3引物引物 的在编码基因中的位置：的在编码基因中的位置：定量定量PCRPCR反应中，反应中，PCRPCR产物的长度约产物的长度约150bp150bp左右左右，第四步第四步.根据引物设计软件对设计的引物进行检查根据引物设计软件对设计的引物进行检查（引物的（引物的GCGC比值，发夹结构，二聚体等）。比值，发夹结构，二聚体等）。GCATGGGCAAAGGAGATCCTA

35、ATTAGCAGACATGGTCTTCCAC引物设计软件引物设计软件PCRDESIGN（分析评价引物的功能，简单方便）（分析评价引物的功能，简单方便）Oligo 6.0（分析评价引物功能，最优秀）（分析评价引物功能，最优秀）Primer Premier 5.0（自助搜索引物的功能）（自助搜索引物的功能）-生物软件网下载生物软件网下载PCRDESIGN 软件使用介绍软件使用介绍 -检测引物检测引物 第一步。第一步。PCRDESIGN 软件启动页面，输入软件启动页面，输入A A即可开始即可开始操作。操作。第二步。编辑第二步。编辑-粘贴粘贴-输入上游引物与下游引物的序列，输入上游引物与下游引物的序列

36、，按按enter enter 键。键。第三步。检测引物的是否有发夹结构（一般小于第三步。检测引物的是否有发夹结构（一般小于6 6个个bpbp）第四步。检测上下游引物之间是否有互补序列，即引第四步。检测上下游引物之间是否有互补序列，即引物的二聚体物的二聚体 （一般小于（一般小于6 6个个bpbp）。第四步。检测上下游引物之间是否有重复序列（一般第四步。检测上下游引物之间是否有重复序列（一般小于小于6 6个个bpbp）。第五步。检测上下游引物之间第五步。检测上下游引物之间GCGC比值比值 。Oligo6.44软件使用介绍软件使用介绍主要功能：主要功能：用于引物的检测用于引物的检测Open sequ

37、ence fileOligo 6.44 启动界面启动界面点击：接受点击：接受accept.弹出三个窗口弹出三个窗口其中一个是：其中一个是：Melting temperature 一般情况下在一般情况下在这这个窗口上工作。个窗口上工作。编辑编辑上游引物，上游引物，输输入上游引物在模板上入上游引物在模板上结结合的位置合的位置1.上游引物位置上游引物位置.163bp-183bp，与模板结合的位置为，与模板结合的位置为163-1的位置，输入的位置，输入162.2.上游与模板结合后，序列是完全一致的。上游与模板结合后，序列是完全一致的。1.下游引物位置下游引物位置.307bp-327bp，与模板结合的位

38、置为，与模板结合的位置为307的位置的位置.2.下游引物与模板结合后，序列是完全一致的。下游引物与模板结合后，序列是完全一致的。引物分析引物分析HairpinDimer and cross DimerGC%Total PCR information1.检查引物二聚体尤其是3端二聚体形成的可能性。2.发夹结构（hairpin）；与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好3.检查为GC 含量，以45-55为宜4.检测与PCR其他模板上错配的位置。1.引物二聚体分析引物二聚体分析2.引物发夹结构分析引物发夹结构分析3.引物引物GC比值分析比值分析4.引物在模板上错配概率引物在模板上错配概率下游引物分析结果

39、下游引物分析结果使用介绍使用介绍主要功能：主要功能：用于引物的检索用于引物的检索PreimerPremier启动界面Load sequenceChooseafunction第一步第一步.输入基因的序列输入基因的序列第二步第二步.搜索上下游引物在基因序列中适合的位置。搜索上下游引物在基因序列中适合的位置。第三步第三步.引物搜索选项设定引物搜索选项设定引物类型引物类型搜索模式搜索模式5 5引物位置引物位置范围范围3 3引物位置引物位置范围范围产物大小范产物大小范围围引物长度引物长度13个引物引物分值100分为满分每对引物的信息双击选中一对引物第四步，选择引物搜索的结果第四步，选择引物搜索的结果第五

40、步第五步.检测软件设计的引物检测软件设计的引物是否出现引物自身是否出现引物自身发夹结构，二聚体，发夹结构，二聚体，错配位点等错配位点等上游引物搜索结果上游引物搜索结果下游引物搜索结果下游引物搜索结果第六步，获取引物信息第六步，获取引物信息引物及产物信息一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构，因一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构，因此最好的情况是最下面的分析栏没有此最好的情况是最下面的分析栏没有引物设计软件小结引物设计软件小结PCRDESIGN（分析评价引物的功能，简单方便）（分析评价引物的功能，简单方便）Oligo 6.0（分析评价引物功能，最优秀）（分析评价引物功能，最优秀）Prim

41、er Premier 5.0（自助搜索引物的功能）（自助搜索引物的功能）与与Primer Premier 5.0 搭配使用，可快速设计出成功率搭配使用，可快速设计出成功率高的引物。高的引物。引物特异性检测引物特异性检测 设计设计PCRPCR引物后，需要对引物的特异性进行检测。引物后，需要对引物的特异性进行检测。检测引物是否能与基因组或检测引物是否能与基因组或cDNAcDNA数据库中其他位置数据库中其他位置结合，扩增出非特异性条带。结合，扩增出非特异性条带。Primer BlastPrimer-BLAST可以直接从Blast主页进入：（）PrimerBlast也可以直接用下面的链接进入：提交的界

42、面主要包括三个部分：target template（模板区）,the primers（引物区）,和specificity check（特异性验证区）1.在“PCRTemplate”下面的文本框，输入目标模板的序列，FASTA格式或直接用AccessionNumber。输入验证引物输入验证引物根据需要设置外显子与内含子选项根据需要设置外显子与内含子选项在specificity check区：4种数据库：RefSeq mRNA,Genome(selected reference assemblies),Genome,and nr；多个物种（人，鼠）。Primer-blast 软件检测结果软件检测结

43、果检测结果显示：HMGB2基因虽然有相似区，但是3端没有完全互补，因此该引物只能特异性地扩增HMGB1基因，不能扩增出HMGB2基因。Primer-blast 软件检测结果软件检测结果下下 午午序列查找及引物的设计序列查找及引物的设计教师指导下，学生自主读取基因的序列，设计引教师指导下，学生自主读取基因的序列，设计引物（物（1313：30-1530-15：0000）根据不同的实验目的设计引物，比如全长，部分 总结自己所遇到的问题及解决方法，与他人分享The mRNA sequence of Homo sapiens interferon,alpha 1Homo sapiens interfer

44、on,alpha 1 is as followed:1 agaacctaga gcccaaggtt cagagtcacc catctcagca agcccagaag tatctgcaat 61 atctacgatg gcctcgccct ttgctttact gatggtcctg gtggtgctca gctgcaagtc 121 aagctgctct ctgggctgtg atctccctga gacccacagc ctggataaca ggaggacctt 181 gatgctcctg gcacaaatga gcagaatctc tccttcctcc tgtctgatgg acagacat

45、ga 241 ctttggattt ccccaggagg agtttgatgg caaccagttc cagaaggctc cagccatctc 301 tgtcctccat gagctgatcc agcagatctt caacctcttt accacaaaag attcatctgc 361 tgcttgggat gaggacctcc tagacaaatt ctgcaccgaa ctctaccagc agctgaatga 421 cttggaagcc tgtgtgatgc aggaggagag ggtgggagaa actcccctga tgaatgcgga 481 ctccatcttg gc

46、tgtgaaga aatacttccg aagaatcact ctctatctga cagagaagaa 541 atacagccct tgtgcctggg aggttgtcag agcagaaatc atgagatccc tctctttatc 601 aacaaacttg caagaaagat taaggaggaa ggaataacat ctggtccaac atgaaaacaa 661 ttcttattga ctcatacacc aggtcacgct ttcatgaatt ctgtcatttc aaagactctc 721 acccctgcta taactatgac catgctgata

47、aactgattta tctatttaaa tatttattta 781 actattcata agatttaaat tatttttgtt catataacgt catgtgcacc tttacactgt 841 ggttagtgta ataaaacatg ttccttatat ttactc 测试题测试题1.请设计一对引物，扩增请设计一对引物，扩增IFN-alpha1的部分序列，用于的部分序列，用于IFN-alpha 1 基因的检测。基因的检测。Group 1The mRNA sequence of Homo sapiens interleukin 4Homo sapiens interleu

48、kin 4 is as followed:1 ttctatgcaa agcaaaaagc cagcagcagc cccaagctga taagattaat ctaaagagca 61 aattatggtg taatttccta tgctgaaact ttgtagttaa ttttttaaaa aggtttcatt 121 ttcctattgg tctgatttca caggaacatt ttacctgttt gtgaggcatt ttttctcctg 181 gaagagaggt gctgattggc cccaagtgac tgacaatctg gtgtaacgaa aatttccaat 24

49、1 gtaaactcat tttccctcgg tttcagcaat tttaaatcta tatatagaga tatctttgtc 301 agcattgcat cgttagcttc tcctgataaa ctaattgcct cacattgtca ctgcaaatcg 361 acacctatta atgggtctca cctcccaact gcttccccct ctgttcttcc tgctagcatg 421 tgccggcaac tttgtccacg gacacaagtg cgatatcacc ttacaggaga tcatcaaaac 481 tttgaacagc ctcacag

50、agc agaagaacac aactgagaag gaaaccttct gcagggctgc 541 gactgtgctc cggcagttct acagccacca tgagaaggac actcgctgcc tgggtgcgac 601 tgcacagcag ttccacaggc acaagcagct gatccgattc ctgaaacggc tcgacaggaa 661 cctctggggc ctggcgggct tgaattcctg tcctgtgaag gaagccaacc agagtacgtt 721 ggaaaacttc ttggaaaggc taaagacgat catga