《SDSPAGE电泳测定》PPT课件.ppt

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1、SDS-PAGE电泳测定电泳测定蛋白质相对分子质量蛋白质相对分子质量实验目的n n了解SDS-PAGE垂直板型电泳法的基本原理及操作技术。n n学习并掌握SDSPAGE法测定蛋白质相对分子量的技术。实验原理 SDS-PAGE SDS-PAGE电泳法，即十二烷基硫酸钠电泳法，即十二烷基硫酸钠聚丙烯酰聚丙烯酰胺凝胶电泳法，。胺凝胶电泳法，。n n1 1在蛋白质混合样品中各蛋白质组分的迁移率主在蛋白质混合样品中各蛋白质组分的迁移率主要取决于分子大小和形状以及所带电荷多少。要取决于分子大小和形状以及所带电荷多少。n n2 2在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的十二在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的十

2、二烷基硫酸钠（烷基硫酸钠（SDSSDS），），SDSSDS是一种阴离子表面活性是一种阴离子表面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上（在一定条件下，键打开，并结合到蛋白质分子上（在一定条件下，大多数蛋白质与大多数蛋白质与SDSSDS的结合比为蛋白质），使各的结合比为蛋白质），使各种蛋白质种蛋白质SDSSDS复合物都带上相同密度的负电荷，复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。此而掩盖了不同种类蛋白质间原有

3、的电荷差别。此时，蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分时，蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小，而其它因素对电泳迁移率的影响几乎子量大小，而其它因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。可以忽略不计。n n3.3.当蛋白质的分子量在当蛋白质的分子量在1500015000200000200000之间时，电之间时，电泳迁移率与分子量的对数值呈直线关系，符合下泳迁移率与分子量的对数值呈直线关系，符合下列方程：列方程：1gMr=1gMr=K K bmRbmR 式中：式中：MrMr为蛋白质的分子量；为蛋白质的分子量；K K为常数；为常数；b b为为斜率；斜率；mRmR为相对迁移率。在条件一定时

4、，为相对迁移率。在条件一定时，b b和和K K均均为常数。为常数。若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图，可获得一条标准曲线。未知蛋子量的对数作图，可获得一条标准曲线。未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。率即可在标准曲线上求得分子量。仪器、原料和试剂n n仪器：垂直板型电泳槽；直流稳压电源；仪器：垂直板型电泳槽；直流稳压电源；5050或或100l100l微量微量注射器、玻璃板、水浴锅，染色槽；烧杯；吸量管；常注射器、玻璃板、水浴锅，染色槽；烧杯；吸量管；常头滴

5、管等。头滴管等。n n原料：低分子量标准蛋白质按照每种蛋白原料：低分子量标准蛋白质按照每种蛋白0.51mgml-10.51mgml-1样品溶解液配制。可配制成单一蛋白质标准液，也可配样品溶解液配制。可配制成单一蛋白质标准液，也可配成混合蛋白质标准液。成混合蛋白质标准液。n n试剂：试剂：（1 1）分离胶缓冲液（）分离胶缓冲液（Tris-HClTris-HCl缓冲液缓冲液 ）:取取1mol/L1mol/L盐酸盐酸48mL48mL，Tris 36.3g,Tris 36.3g,用无离子水溶解后定容至用无离子水溶解后定容至100mL100mL。（2 2）浓缩胶缓冲液（）浓缩胶缓冲液（Tris-HClT

6、ris-HCl缓冲液缓冲液 ）:取取1mol/L1mol/L盐酸盐酸48mL,Tris 5.98g,48mL,Tris 5.98g,用无离子水溶解后定容至用无离子水溶解后定容至100mL100mL。（3 3）30%30%分离胶贮液：配制方法与连续体系相同，称丙分离胶贮液：配制方法与连续体系相同，称丙烯酰胺（烯酰胺（AcrAcr）30g 30g及及NN，N-N-甲叉双丙烯酰胺（甲叉双丙烯酰胺（BisBis），溶），溶于重蒸水中，最后定容至于重蒸水中，最后定容至100ml100ml，过滤后置棕色试剂瓶中，过滤后置棕色试剂瓶中，4 4保存。保存。（4 4）10%10%浓缩胶贮液：称浓缩胶贮液：称Ac

7、r 10gAcr 10g及及BisBis，溶于重蒸水中，溶于重蒸水中，最后定容至最后定容至100mL100mL，过滤后置棕色试剂瓶中，过滤后置棕色试剂瓶中，4 4贮存。贮存。（5 5）10%SDS10%SDS溶液：溶液：SDSSDS在低温易析出结晶，用前微热，在低温易析出结晶，用前微热，使其完全溶解。使其完全溶解。（6 6）1%TEMED1%TEMED；（7 7）10%10%过硫酸铵（过硫酸铵（APAP）：现用现配。）：现用现配。（8 8）电泳缓冲液（）电泳缓冲液（Tris-Tris-甘氨酸缓冲液）甘氨酸缓冲液）:称取称取Tris 6.0g,Tris 6.0g,甘氨酸甘氨酸28.8g,SDS

8、1.0g,28.8g,SDS 1.0g,用无离子水溶解后定容至用无离子水溶解后定容至1L1L。（9 9）样品溶解液：取）样品溶解液：取SDS 100mgSDS 100mg，巯基乙醇，甘油，巯基乙醇，甘油1mL1mL，溴酚蓝，溴酚蓝2mg2mg，磷酸缓冲液，加重蒸水至，磷酸缓冲液，加重蒸水至10mL10mL（遇液体（遇液体样品浓度增加一倍配制）。用来溶解标准蛋白质及待测固样品浓度增加一倍配制）。用来溶解标准蛋白质及待测固体。体。（1010）染色液：考马斯亮蓝）染色液：考马斯亮蓝G-250G-250，加入，加入454mL 50%454mL 50%甲甲醇溶液和醇溶液和46mL46mL冰乙酸即可。冰乙

9、酸即可。（1111）脱色液：）脱色液：75mL75mL冰乙酸，冰乙酸，875mL875mL重蒸水与重蒸水与50mL50mL甲甲醇混匀。醇混匀。实验步骤n n1 1 安装夹心式垂直板电泳槽：目前，夹心式垂安装夹心式垂直板电泳槽：目前，夹心式垂直板电泳槽有很多型号，虽然设置略有不同，但直板电泳槽有很多型号，虽然设置略有不同，但主要结构相同，且操作简单，不易泄漏。同学们主要结构相同，且操作简单，不易泄漏。同学们可根据具体不同型号要求进行操作。主要注意：可根据具体不同型号要求进行操作。主要注意：安装前，胶条、玻板、槽子都要洁净干燥；勿用安装前，胶条、玻板、槽子都要洁净干燥；勿用手接触灌胶面的玻璃。手接

10、触灌胶面的玻璃。n n2 2配胶：根据所测蛋白质分子量范围，选择适宜配胶：根据所测蛋白质分子量范围，选择适宜的分离胶浓度。本实验采用的分离胶浓度。本实验采用SDS-PAGESDS-PAGE不连续系统，不连续系统，按下表的配制分离胶和浓缩胶。按下表的配制分离胶和浓缩胶。试剂名称试剂名称配制配制20ml20ml不同浓度分离胶所需各种试剂不同浓度分离胶所需各种试剂用量用量/ml/ml配制配制10ml10ml浓缩胶所需试浓缩胶所需试剂用量剂用量5%5%7.5%7.5%10%10%15%15%3%3%分离胶贮液分离胶贮液（30%Acr-0.8%Bis)30%Acr-0.8%Bis)3.333.335.0

11、05.006.666.6610.0010.00-分离胶缓冲液分离胶缓冲液（pH8.9Tris-HClpH8.9Tris-HCl）2.502.502.502.502.502.502.502.50-浓缩胶贮液浓缩胶贮液（10%Acr-0.5%Bis10%Acr-0.5%Bis）-3.03.0浓缩胶缓冲液浓缩胶缓冲液（pH6.7 Tris-HClpH6.7 Tris-HCl）-1.251.2510%SDS10%SDS 0.200.200.200.200.200.200.200.200.100.101%TEMED 1%TEMED 2.002.002.002.002.002.002.002.002.00

12、2.00重蒸馏水重蒸馏水 11.8711.8710.2010.208.548.545.205.204.604.60混匀后，置真空干燥器中，抽气混匀后，置真空干燥器中，抽气10min10min10%AP10%AP0.100.100.100.100.100.100.100.100.050.05n n3 3制备凝胶板：制备凝胶板：（1 1）分离胶制备：按表配制）分离胶制备：按表配制20ml 10%20ml 10%分离胶，分离胶，混匀后用细长头滴管将凝胶液加至长、短玻璃板混匀后用细长头滴管将凝胶液加至长、短玻璃板间的缝隙内，约间的缝隙内，约8cm8cm高，用高，用1ml1ml注射器取少许蒸馏注射器取少

13、许蒸馏水，沿长玻璃板板壁缓慢注入，约水，沿长玻璃板板壁缓慢注入，约34mm34mm高，以高，以进行水封。约进行水封。约30min30min后，凝胶与水封层间出现折射后，凝胶与水封层间出现折射率不同的界线，则表示凝胶完全聚合。倾去水封率不同的界线，则表示凝胶完全聚合。倾去水封层的蒸馏水，再用滤纸条吸去多余水分。层的蒸馏水，再用滤纸条吸去多余水分。（2 2）浓缩胶的制备：按表配制）浓缩胶的制备：按表配制10ml 3%10ml 3%浓缩胶，浓缩胶，混匀后用细长头滴管将浓缩胶加到已聚合的分离混匀后用细长头滴管将浓缩胶加到已聚合的分离胶上方，直至距离短玻璃板上缘约处，轻轻将样胶上方，直至距离短玻璃板上缘

14、约处，轻轻将样品槽模板插入浓缩胶内，避免带入气泡。约品槽模板插入浓缩胶内，避免带入气泡。约30min30min后凝胶聚合，再放置后凝胶聚合，再放置2030min2030min。待凝胶凝固，小。待凝胶凝固，小心拔去样品槽模板，用窄条滤纸吸去样品凹槽中心拔去样品槽模板，用窄条滤纸吸去样品凹槽中多余的水分，将多余的水分，将pH8.3 Tris-pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液倒入上、甘氨酸缓冲液倒入上、下贮槽中，应没过短板约以上，即可准备加样。下贮槽中，应没过短板约以上，即可准备加样。n n4 4样品处理及加样样品处理及加样 各标准蛋白及待测蛋白都用样品溶解液溶解，各标准蛋白及待测蛋白都用样品溶解

15、液溶解，使浓度为使浓度为0.51mg/mL0.51mg/mL，沸水浴加热，沸水浴加热3 3分钟，冷却分钟，冷却至室温备用。处理好的样品液如经长期存放，使至室温备用。处理好的样品液如经长期存放，使用前应在沸水浴中加热用前应在沸水浴中加热1 1分钟，以消除亚稳态聚合。分钟，以消除亚稳态聚合。一般加样体积为一般加样体积为101015L15L（即（即2 210g10g蛋白质）蛋白质）。如样品较稀，可增加加样体积。用微量注射器。如样品较稀，可增加加样体积。用微量注射器小心将样品通过缓冲液加到凝胶凹形样品槽底部，小心将样品通过缓冲液加到凝胶凹形样品槽底部，待所有凹形样品槽内都加了样品，即可开始电泳。待所有

16、凹形样品槽内都加了样品，即可开始电泳。n n5 5电泳电泳 将直流稳压电泳仪开关打开，开始时将电流将直流稳压电泳仪开关打开，开始时将电流调至调至10mA10mA。待样品进入分离较时，将电流调至。待样品进入分离较时，将电流调至202030 mA30 mA。当蓝色染料迁移至底部时，将电流调回。当蓝色染料迁移至底部时，将电流调回到零，关闭电源。拔掉固定板，取出玻璃板，用到零，关闭电源。拔掉固定板，取出玻璃板，用刀片轻轻将一块玻璃撬开移去，在胶板一端切除刀片轻轻将一块玻璃撬开移去，在胶板一端切除一角作为标记，将胶板移至大培养皿中染色。一角作为标记，将胶板移至大培养皿中染色。n n6 6染色及脱色染色及

17、脱色 将染色液倒入培养皿中，染色将染色液倒入培养皿中，染色1h1h左右左右，用蒸，用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白区带馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白区带清晰，即用直尺分别量取各条带与凝胶顶端的距清晰，即用直尺分别量取各条带与凝胶顶端的距离。离。计算n n1.相对迁移率mR=样品迁移距离（cm）/染料迁移距离（cm）n n2.以标准蛋白质分子量的对数对相对迁移率作图，得到标准曲线，根据待测样品相对迁移率，从标准曲线上查出其分子量。注意事项 n n1.1.不是所有的蛋白质都能用不是所有的蛋白质都能用SDS-SDS-凝胶电泳法测凝胶电泳法测定其分子量，已发现有些蛋白质用这种方法测定

18、其分子量，已发现有些蛋白质用这种方法测出的分子量是不可靠的。包括：电荷异常或构出的分子量是不可靠的。包括：电荷异常或构象异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质（如象异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质（如某些糖蛋白）以及一些结构蛋白如胶原蛋白等。某些糖蛋白）以及一些结构蛋白如胶原蛋白等。例如组蛋白例如组蛋白F1F1，它本身带有大量正电荷，因此，它本身带有大量正电荷，因此，尽管结合了正常比例的尽管结合了正常比例的SDSSDS，仍不能完全掩盖其，仍不能完全掩盖其原有正电荷的影响，它的分子量是原有正电荷的影响，它的分子量是21,00021,000，但，但SDS-SDS-凝胶电泳测定的结果却是凝胶电泳测定的

19、结果却是35,00035,000。因此，最。因此，最好至少用两种方法来测定未知样品的分子量，好至少用两种方法来测定未知样品的分子量，互相验证。互相验证。n n2有许多蛋白质，是由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（如-胰凝乳蛋白酶）组成的，它们在SDS和巯基乙醇的作用下，解离成亚基或单条肽链。因此，对于这一类蛋白质，SDS-凝胶电泳测定的只是它们的亚基或单条肽链的分子量，而不是完整分子的分子量。为了得到更全面的资料，还必须用其它方法测定其分子量及分子中肽链的数目等，与SDS-凝胶电泳的结果互相参照。思考题 n n1SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳与聚丙烯酰胺凝胶电泳原理上有何不同？n n2.用SDS-凝胶电泳法测定蛋白质分子量时为什么要用巯基乙醇？n n3用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量，为什么有时和凝胶层析法所得结果有所不同？是否所有的蛋白质都能用SDS-凝胶电泳法测定其分子量？为什么？