《中药含量测定技术》PPT课件.ppt

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1、1第四章第四章-复复习n杂质n概念概念n来源来源n分分类n重金属重金属n概念概念n检查原因原因n检查方法方法n干干扰物排除物排除n最最终产物物n砷砷盐n检查原因原因n药典收典收载方法方法n检查中酸性中酸性SnCl2作用？作用？2中中药制制剂含量含量测定技定技术 3方法方法化学方法化学方法*仪器分析方法器分析方法有效成分有效成分指指标性成分性成分毒性成分毒性成分 分析成分分析成分中中药制制剂含量含量测定技定技术4高效液相色高效液相色谱法法薄薄层扫描法描法可可见-紫外分光光度法紫外分光光度法气相色气相色谱法法原子吸收分光光度法原子吸收分光光度法方法方法仪器分析方法器分析方法滴定法滴定法浸出物浸出物

2、测定法定法重量法重量法挥发油油测定法定法总氮氮测定法定法化学方法化学方法5仪器分析法之器分析法之紫外紫外-可可见分光光度法分光光度法6A:吸光度吸光度K:吸收系数吸收系数C:溶液溶液浓度度L:液液层厚度厚度 基本原理基本原理:Lamber-Beer定律定律紫外紫外-可可见分光光度法分光光度法7uu吸收系数两种表示法：吸收系数两种表示法：吸收系数两种表示法：吸收系数两种表示法：u摩摩尔吸收系数吸收系数：一定，一定，C=1mol/L，L=1cm时的吸光度的吸光度u百分含量吸收系数百分含量吸收系数/比吸收系数比吸收系数 一定，一定，C=1g/100ml，L=1cm时的吸光度的吸光度紫外紫外-可可见分

3、光光度法分光光度法*8紫外紫外-可可见分光光度法分光光度法n吸收光吸收光谱（吸收曲（吸收曲线）：n定性依据定性依据:n 吸收峰吸收峰maxn 吸收谷吸收谷minn 肩峰肩峰shn定量依据定量依据:吸收峰吸收峰max9光源光源单色器色器样品池品池检测器器记录装置装置紫紫外外|可可见见分分光光光光度度计数据数据处理理报告告书10钨灯灯或或卤钨灯灯：可可见光光源源 3501000nm氢灯灯或或氘灯灯：紫紫外外光光源源 200360nm吸收池：吸收池：玻璃玻璃-能吸收能吸收UV光，光，仅适用于可适用于可见光区光区石英石英-不能吸收紫外光，适用于紫外和可不能吸收紫外光，适用于紫外和可见光区光区要求：匹配

4、性（要求：匹配性（对光的吸收和反射光的吸收和反射应一致）一致）光光源源紫外紫外-可可见分光光度法分光光度法11测定波定波长的的选择：max吸光度吸光度读数范数范围的的选择：UV 吸光度吸光度测量的条件量的条件选择样参参调节光路光路光学性光学性质和厚度相同和厚度相同样品池品池样品溶液品溶液，参比池参比池空白溶液空白溶液样品池品池参比池参比池配制配制样品的溶品的溶剂空白溶液空白溶液ATA+=+%100012样品品A值UV-标准曲准曲线法法对照品溶液：一系列不同照品溶液：一系列不同浓度的度的对照品溶液照品溶液 相同条件下相同条件下A为纵坐坐标，C为横坐横坐标标准曲准曲线（工作曲（工作曲线）样品的品的

5、浓度和含量度和含量一系列一系列A值13标准曲准曲线又称工作曲又称工作曲线。如。如吸光光度吸光光度法，在法，在绘制制时，首先在一定条件下配制一系列具有首先在一定条件下配制一系列具有不同已知不同已知浓度吸度吸光物光物质的的标准溶液，然后在确定的波准溶液，然后在确定的波长和光程等条和光程等条件下，分件下，分别测量系列溶液的吸光度，量系列溶液的吸光度，绘制制A-c曲曲线，从而得到一条通从而得到一条通过原点原点的直的直线，即，即标准曲准曲线。当需。当需要要对某未知液的某未知液的浓度度cx进行行测定定时，只需要在相同，只需要在相同条件下条件下测得未知液的吸光度得未知液的吸光度Ax，就可由就可由cx=Ax/

6、b计算算得出或直接在得出或直接在标准曲准曲线上上查得得cx。在在实际操作中，操作中，应注意注意调整整cx的大小，使其的大小，使其对应的的Ax处于于标准曲准曲线的直的直线范范围（线性范性范围）之内。）之内。UV-标准曲准曲线法法14UV-标准曲准曲线法法 标准曲准曲线的的直直线部分部分所所对应的被的被测物物质浓度（或含量）的范度（或含量）的范围称称为该方法的方法的线性性范范围。15 标准曲准曲线是依据是依据标准系列的准系列的浓度（或含量）和其相度（或含量）和其相对应的相的相应信号信号测量量值来来绘制的。如制的。如浓度（或含量）分度（或含量）分别为x1,x2xn，其相，其相应信号信号(吸光吸光度度

7、)的的测量量值分分别为y1,y2yn，用，用简单的方法的方法很很难绘制出能制出能准确准确反映反映y与与x之之间关系的关系的标准曲准曲线。通常，用。通常，用“一元一元线性回性回归法法”来来给出出y与与x的的关系式关系式 y=a+bx （1-1）式中其中式中其中式式(1-1)称称为一元一元线性回性回归方程，方程，b称称为回回归系数，即回系数，即回归直直线的的斜率斜率，a为截距。截距。UV-标准曲准曲线法法16当两个当两个变量量之之间直直线关系关系不不够严格格，数据的，数据的偏离偏离较严重重时，虽然然也也可以求得一条回可以求得一条回归线，但是，但是，实际上只有当两个上只有当两个变量之量之间存存在在某

8、种某种线性性关系关系时，这条回条回归线才有意才有意义。判断回。判断回归线是否有是否有意意义，可用相关系数，可用相关系数r来来检验。相关系数的定相关系数的定义式式为：r值在与之在与之间。相关系数的物理意。相关系数的物理意义如下：如下：（1）r=1时，y与与x之之间存在存在严格格的的线性关系，所有的性关系，所有的yi值都在都在回回归线上。上。（2）r=0时，y与与x之之间完全不存在完全不存在线性关系。性关系。（3）0r1时，y与与x之之间存在一定存在一定的的线性关系。性关系。r值愈接近愈接近1，线性关系就愈好性关系就愈好UV-标准曲准曲线法法-相关系数相关系数r17例：用光度法例：用光度法测定合金

9、定合金钢中中Mn的含量，吸光度与的含量，吸光度与Mn的含量的含量间有下列关系：有下列关系：Mn的的质量量/g 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 未知未知样吸光度吸光度/A 0.032 0.135 0.187 0.268 0.359 0.435 0.511 0.242试求出求出标准曲准曲线的回的回归方程及其相关系数方程及其相关系数r并并计算未知算未知样品中品中Mn的含量的含量解：此解：此组数据中，数据中，组分分浓度度为零零时，吸光度不，吸光度不为零，零，这可能是在可能是在试剂中中含有少量含有少量Mn，或者含有其它在，或者含有其它在该测量波量波长下有吸光的物下有吸光的

10、物质。设Mn含量含量值为x，吸光度，吸光度值为y，按公式，按公式计算回算回归系数系数a，b值。n=7。所以所以n该标准曲准曲线的回的回归方程方程为UV-标准曲准曲线法法-实例例18n未知未知样品的吸光度品的吸光度为所以所以g故求出故求出样品中含品中含Mn为g(注：注：该题可用可用计算机方便算机方便统计处理理)相关系数相关系数UV-标准曲准曲线法法-实例例19-特点：用于可特点：用于可见分光光度法分光光度法批量生批量生产曲曲线可多次使用可多次使用UV-标准曲准曲线法法20UV-对照品比照品比较法法 对照品溶液中所含被照品溶液中所含被测成分的量成分的量应为：供供试品溶液中被品溶液中被测成分成分标示

11、量的示量的100%10%C供供=（A供供/A对对）C对对供供试的含量（的含量（%）=C C供供DD供供 VW供供100%对照品、照品、样品：各配制两份品：各配制两份21吸收系数法吸收系数法含量（含量（%）=ADVL100W100%注意：注意：仪器波器波长空白校正空白校正吸收度准确度的吸收度准确度的检定定杂散光的散光的检查优点：无需点：无需对照品，方法照品，方法简便便AD1%VLW含量（含量（%）=100%22注意事注意事项 光源光源选择波波长吸收池种吸收池种类溶液高度溶液高度吸收度吸收度读数范数范围供供试品品应取取2份份（对照品比照品比较法，法，对照品一般也照品一般也应取取2份）份）平行操作，

12、平均偏差平行操作，平均偏差应在在0.5%以内以内23例例题：黄黄杨宁片中黄宁片中黄杨宁的含量宁的含量测定定n本品本品为黄黄杨宁宁经加工制成的片加工制成的片剂。每片。每片含含环维黄黄杨星或星或1mg。可用。可用对照品比照品比较法法测其含量。其含量。n 环维黄黄杨星星D24测定原理：酸性染料比色法定原理：酸性染料比色法例例题：黄黄杨宁片中黄宁片中黄杨宁的含量宁的含量测定定25n对照品溶液的制照品溶液的制备n精密称取精密称取经105干燥至恒重的干燥至恒重的环维黄黄杨星星D对照品照品25mg（实际称取称取24.94mg)，置，置250ml量量瓶中，加甲醇瓶中，加甲醇70ml使溶解，用磷酸二使溶解，用磷

13、酸二氢钠缓冲冲液稀液稀释至刻度，至刻度，摇匀，精密量取匀，精密量取10ml，置，置100ml量瓶中，用磷酸二量瓶中，用磷酸二氢钠缓冲液稀冲液稀释至刻至刻度，度，摇匀，即得每匀，即得每1ml含黄含黄杨星星D10g的的对照照溶液（溶液（实际浓度度C对g/ml）n试写出写出计算算过程程例例题：黄黄杨宁片中黄宁片中黄杨宁的含量宁的含量测定定26n供供试品溶液的制品溶液的制备n取本品取本品20片（片（标示量示量为片），精密称定（片），精密称定（2.050g)，研，研细，精密称取适量（，精密称取适量（约相当于黄相当于黄杨宁）宁）(称取称取0.1021g)，置，置50ml量瓶中，加磷酸二量瓶中，加磷酸二氢钠

14、缓冲液至冲液至近刻度，近刻度，80水浴恒温小水浴恒温小时后取出，冷却至室温，后取出，冷却至室温，加磷酸二加磷酸二氢钠缓冲液至刻度，冲液至刻度，摇匀，离心匀，离心6分分钟（3000转/分），取上清液，即可分），取上清液，即可n若若标示量示量为1mg/片，其他数片，其他数值不不变，试求取求取样范范围？例例题：黄黄杨宁片中黄宁片中黄杨宁的含量宁的含量测定定27n测定法定法n精密量取精密量取对照品溶液与供照品溶液与供试品溶液各品溶液各5ml，分，分别置置分液漏斗中，各精密加入溴麝香草酚分液漏斗中，各精密加入溴麝香草酚蓝溶液（取溴溶液（取溴麝香草酚麝香草酚蓝18mg，置，置250ml量瓶中，加甲醇量瓶中

15、，加甲醇5ml使使溶解，加磷酸二溶解，加磷酸二氢钠缓冲液至刻度，冲液至刻度，摇匀，即得）匀，即得）5ml，摇匀，立即分匀，立即分别精密加入三精密加入三氯甲甲烷10ml，振，振摇2分分钟，静置小，静置小时，分取三，分取三氯甲甲烷层，置含无水，置含无水硫酸硫酸钠的具塞的具塞试管中，振管中，振摇，静置，取上清液，照，静置，取上清液，照分光光度法在分光光度法在410nm处分分别测定吸光度（定吸光度（A对=0.454,A样），），计算，即得。算，即得。药品品标准准规定每片含定每片含环维黄黄杨星星D（C26H46N2O），），应为标示量的示量的90.0%110%n试写出写出计算公式算公式例例题：黄黄杨宁片

16、中黄宁片中黄杨宁的含量宁的含量测定定28n计算算n药品品标准准规定每片含黄定每片含黄杨宁以宁以环维黄黄杨星星D（C26H46N2O）计算，算，应为标示量的示量的90.0%110.0%。n 100%(A供供/A对)C对50.0平均片重平均片重(mg)标示量示量%=%=W供供标 示示 量量(mg)例例题：黄黄杨宁片中黄宁片中黄杨宁的含量宁的含量测定定29六味地黄六味地黄颗粒中牡丹皮的含量粒中牡丹皮的含量测定定 n取装量差异取装量差异项下的本品下的本品约2g，研，研细，精密称，精密称定，用水蒸汽蒸定，用水蒸汽蒸馏，收集，收集馏出液出液约450ml，置置500ml量瓶中，加水稀量瓶中，加水稀释至刻度，

17、至刻度，摇匀。匀。照分光光度法在照分光光度法在274nm波波长处测定吸收度，定吸收度，按丹皮酚（按丹皮酚（C9H10O3）的吸收系数）的吸收系数为862计算，算，即得。即得。药品品标准准规定每袋（装量定每袋（装量为5g）含牡）含牡丹皮按丹皮酚（丹皮按丹皮酚（C9H10O3）计，不得少于。，不得少于。301g供供试品中含牡丹皮按丹皮酚品中含牡丹皮按丹皮酚计，含量，含量为：含量（含量（%）=A供供1%500.01000862m供供每袋六味地黄每袋六味地黄颗粒（粒（5g装）含牡丹皮按丹皮酚装）含牡丹皮按丹皮酚计含量含量为：含量（含量（mg/g）=A供供1%500.01000平均装量平均装量862m供

18、供六味地黄六味地黄颗粒中牡丹皮的含量粒中牡丹皮的含量测定定 31仪器分析法之器分析法之薄层扫描法（薄层扫描法（TLCS）32n概念：概念：指用一定波长的光照射在薄层板上，对薄层色指用一定波长的光照射在薄层板上，对薄层色谱中有紫外或可见吸收的斑点或经照射能激发产生荧谱中有紫外或可见吸收的斑点或经照射能激发产生荧光的斑点进行扫描，将扫描得到的图谱及积分值用于光的斑点进行扫描，将扫描得到的图谱及积分值用于药品质量检测的方法药品质量检测的方法n色谱条件：选择性好，组分能完全分离，斑点对称、色谱条件：选择性好，组分能完全分离，斑点对称、均匀均匀、不拖尾。、不拖尾。n测量方法：多使用反射法测量方法：多使用

19、反射法n光源光源n氘灯：氘灯：200200370nm370nmn钨灯：钨灯：370370700nm700nmn氙灯氙灯n汞灯汞灯薄薄层扫描法描法33n薄层扫描法有外标法和内标法。常用外标法薄层扫描法有外标法和内标法。常用外标法n外标法系指将一定量的供试品溶液和对照品溶液分别交叉点加在同一块外标法系指将一定量的供试品溶液和对照品溶液分别交叉点加在同一块薄层板上，展开，显色，定位，扫描待测组分和对照品斑点，测定相应薄层板上，展开，显色，定位，扫描待测组分和对照品斑点，测定相应的吸光度或荧光强度积分值，计算被测成分的含量。的吸光度或荧光强度积分值，计算被测成分的含量。n外标一点法外标一点法：标准曲线

20、通过原点标准曲线通过原点，马钱子散等个别品种马钱子散等个别品种n外标两点法外标两点法：标准曲线不通过原点标准曲线不通过原点，绝大多数品种采用绝大多数品种采用n所谓一点法是指在一块薄层板上对照品的浓度为一种点样浓度，两点所谓一点法是指在一块薄层板上对照品的浓度为一种点样浓度，两点法则是指在一块薄层板上对照品的浓度为两种点样浓度。法则是指在一块薄层板上对照品的浓度为两种点样浓度。n操作方法：操作方法：n供试品溶液：两份或以上供试品溶液：两份或以上n点样：供试品和对照品交叉点样，每份原点不得少于点样：供试品和对照品交叉点样，每份原点不得少于2 2个个n展开：展距为展开：展距为15cm15cm薄薄层扫

21、描法描法34n扫描方式：描方式：单波波长双波双波长n测定波定波长被被测组分分max，n参比波参比波长组分无吸收位置上分无吸收位置上若背景有均匀若背景有均匀污染染时，可，可选择背景光背景光谱中与中与测定波定波长的等吸收的等吸收处。薄薄层扫描法描法薄薄层扫描法描法n计算n外标一点法n外标二点法35 薄薄层扫描法描法n马钱子散中马钱子的含量测定马钱子散中马钱子的含量测定：【含量测定】取装量差异项【含量测定】取装量差异项下的本品约，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入三氯甲烷下的本品约，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入三氯甲烷20ml20ml，浓氨试液，浓氨试液1ml1ml，轻轻摇匀，称定重量后，于室

22、温放置，轻轻摇匀，称定重量后，于室温放置2424小小时，再称定重量，用三氯甲烷量补足减失重量，充分振摇，滤时，再称定重量，用三氯甲烷量补足减失重量，充分振摇，滤过，滤液作为供试品溶液。另取士的宁对照品，加三氯甲烷制过，滤液作为供试品溶液。另取士的宁对照品，加三氯甲烷制成每成每1ml1ml含含1mg 1mg 的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（附录的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（附录 B B）试验，分别吸取供试品溶液）试验，分别吸取供试品溶液8l8l和对照品溶液和对照品溶液4l4l，交，交叉点于同一硅胶叉点于同一硅胶GFGF254254薄层板上，以甲苯薄层板上，以甲苯-丙酮丙酮-乙醇乙醇

23、-浓氨试液浓氨试液（16:12:1:416:12:1:4）的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干。照薄）的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干。照薄层色谱法（附录层色谱法（附录 B B薄层色谱扫描法）进行扫描，波长：薄层色谱扫描法）进行扫描，波长：S S=257nm=257nm，R R300nm300nm，测量供试品与对照品吸光度积分值，测量供试品与对照品吸光度积分值，计算，即得。计算，即得。n实验数据：实验数据：m m对对=24=24.90mg.90mg,m mS S=,A=,A对对=,A=,A供供=n本品每袋含马钱子以士的宁计（本品每袋含马钱子以士的宁计（C C2121H H2222N N2

24、2O O2 2）应为。）应为。36薄薄层扫描法描法n马钱子散中马钱子的含量测定马钱子散中马钱子的含量测定37薄薄层扫描法描法n大山楂丸中山楂的含量测定大山楂丸中山楂的含量测定：【含量测定含量测定】取重量差异项下的本品，剪碎，取重量差异项下的本品，剪碎，混匀，取约混匀，取约3g3g，精密称定，加水，精密称定，加水30ml30ml，6060水浴温热使充分溶散，加硅藻水浴温热使充分溶散，加硅藻土土2g2g，搅匀，滤过，残渣用水，搅匀，滤过，残渣用水30ml30ml洗涤，洗涤，100100烘干，连同滤纸一并置索氏烘干，连同滤纸一并置索氏提取器中，加乙醚适量，加热回流提取提取器中，加乙醚适量，加热回流提

25、取4 4小时，提取液回收溶剂至干，残渣小时，提取液回收溶剂至干，残渣用石油醚（用石油醚（30306060）浸泡）浸泡2 2次（每次约次（每次约2 2分钟），每次分钟），每次5ml5ml，倾去石油醚液，倾去石油醚液，残渣加无水乙醇残渣加无水乙醇-三氯甲烷（三氯甲烷（3:23:2）的混合溶液适量，微热使溶解，转移至）的混合溶液适量，微热使溶解，转移至5ml5ml量瓶中，用上述混合溶液稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。另取熊量瓶中，用上述混合溶液稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。另取熊果酸对照品适量，精密称定，加无水乙醇制成每果酸对照品适量，精密称定，加无水乙醇制成每1ml1ml含的溶液，作为对照品

26、含的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（附录溶液。照薄层色谱法（附录VI BVI B）试验，分别精密吸取供试品溶液）试验，分别精密吸取供试品溶液5l5l、对、对照品溶液照品溶液4l4l与与8l8l，分别交叉点于同一硅胶，分别交叉点于同一硅胶G G薄层板上，以环己烷薄层板上，以环己烷-三氯甲三氯甲烷烷-乙酸乙酯乙酸乙酯-甲酸（）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以甲酸（）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%10%硫酸乙醇溶硫酸乙醇溶液，在液，在110110加热至斑点显色清晰，在薄层板上覆盖同样大小的玻璃板，周加热至斑点显色清晰，在薄层板上覆盖同样大小的玻璃板，周围用胶布固定，照薄层色谱法（附录围用

27、胶布固定，照薄层色谱法（附录 B B薄层色谱扫描法）进行扫描，波长：薄层色谱扫描法）进行扫描，波长：S=535nmS=535nm；R=650nmR=650nm，测量供试品吸光度积分值与对照品吸光度积分值，测量供试品吸光度积分值与对照品吸光度积分值，计算，即得。计算，即得。n测得数据测得数据：A供、A对1、A对2。n本品每丸含山楂以熊果酸（本品每丸含山楂以熊果酸（C30H4803C30H4803）计，不得少于。）计，不得少于。38薄薄层扫描法描法n大山楂丸中山楂的含量测定大山楂丸中山楂的含量测定39补补:分析天平使用和称量分析天平使用和称量n感量感量n用途：较精密的检验工作称量用途：较精密的检验

28、工作称量n含量测定含量测定n对照品称量对照品称量n滴定液标化滴定液标化n微量水分测定微量水分测定40补补:分析天平使用前准备分析天平使用前准备n精度选择：精密称定精度选择：精密称定n大于大于100mg100mg，感量为天平，感量为天平n10010010mg10mg，感量为天平，感量为天平n小于小于10mg10mg，感量为天平，感量为天平n检查该天平的使用登记表检查该天平的使用登记表n检查水准器内的气泡：水准器圆的中心位置检查水准器内的气泡：水准器圆的中心位置n检查硅胶检查硅胶n软毛刷轻刷天平软毛刷轻刷天平n调好零点调好零点41高效液相色谱法高效液相色谱法n在经典液相色谱实验和技术基础上建立的一

29、种液相色在经典液相色谱实验和技术基础上建立的一种液相色谱法谱法n适用范围适用范围n溶解后能制成溶液的样品溶解后能制成溶液的样品n不受样品挥发性和热稳定性的限制不受样品挥发性和热稳定性的限制n分子量大、难气化、热稳定性差及高分子和离子型样品均分子量大、难气化、热稳定性差及高分子和离子型样品均可检测可检测n用途广泛，占有机物的用途广泛，占有机物的80%80%n特点特点n高柱效（高柱效（n=10n=104 4片片/米）米）n高灵敏度高灵敏度n高选择性高选择性n分析速度快分析速度快42高效液相色谱法高效液相色谱法n仪器仪器n高压输液系统、进样系统、色谱系统、检测系统、高压输液系统、进样系统、色谱系统、

30、检测系统、数据处理系统数据处理系统1.1.储液罐；储液罐；2.2.脱气装置；脱气装置；3.3.梯度洗脱；梯度洗脱；4.4.高压输液泵；高压输液泵；5.5.流动相流量显示；流动相流量显示；6.6.柱前压力表；柱前压力表；7.7.输液泵头输液泵头；8.8.过滤器；过滤器；9.9.阻尼器；阻尼器；10.10.进进样样装置；装置；11.11.色谱柱；色谱柱；12.12.检检测器；测器；13.13.数据处理系统；数据处理系统；14.14.废液储罐废液储罐43高效液相色谱法高效液相色谱法n仪器仪器n高压输液系统高压输液系统n贮液罐：贮液罐：盛装流动相盛装流动相n过滤器：过滤器：过滤流动相中的尘粒或不溶性的

31、颗粒物质过滤流动相中的尘粒或不溶性的颗粒物质n高压输液泵：高压输液泵：完成流动相的输送任务完成流动相的输送任务n进样系统进样系统n六通进样阀进样六通进样阀进样：定量环定量和微量注射器定量定量环定量和微量注射器定量n自动进样器自动进样器n色谱系统色谱系统：色谱柱和柱温箱色谱柱和柱温箱n检测系统检测系统：紫外检测器（紫外检测器（UVDUVD）、二极管阵列检测器（、二极管阵列检测器（DVDDVD）、荧光）、荧光检测器、蒸发光散射检测器、示差折光检测器、电化学检测器和质谱检测器、蒸发光散射检测器、示差折光检测器、电化学检测器和质谱检测器检测器n数据处理系统数据处理系统44nHPLCHPLC进样装置进样

32、装置n隔膜进样（高分子有机硅胶垫隔膜进样（高分子有机硅胶垫进样室）进样室）HPLCHPLC系统压力太大，必须停泵进样（早期）系统压力太大，必须停泵进样（早期）n阀进样：不必停泵，六通阀阀进样：不必停泵，六通阀45透明透明(棕色棕色)玻璃样品瓶玻璃样品瓶 自动进样器自动进样器高效液相色谱法高效液相色谱法n色谱柱色谱柱-ODS ODS柱柱n非极性固定相非极性固定相n反相色谱法反相色谱法n流动相：极性流动相流动相：极性流动相n甲醇甲醇-水水n乙腈乙腈-水水n洗脱洗脱n梯度洗脱梯度洗脱n等度洗脱等度洗脱n极性大组分先出柱，极性小的组分后出柱极性大组分先出柱，极性小的组分后出柱46高效液相色谱法高效液相

33、色谱法高效液相色谱法高效液相色谱法n nHPLC HPLC 流出曲线和色谱峰流出曲线和色谱峰n流出曲线流出曲线（色谱图）（色谱图）：电信号强度随时间变化曲线：电信号强度随时间变化曲线n色谱峰：流出曲线上突起部分色谱峰：流出曲线上突起部分4748n n基本概念基本概念n基基线线：当当没没有有待待测测组组分分进进入入检检测测器器时时，反反映映检检测测器器噪噪音音随随时时间变化的曲线；稳定间变化的曲线；稳定平直直线平直直线n噪噪音音：仪仪器器本本身身所所固固有有的的，以以噪噪音音带带表表示示（仪仪器器越越好好，噪噪音音越小）越小）n漂移：（仪器未稳定造成），基线向某个方向稳定移动漂移：（仪器未稳定造

34、成），基线向某个方向稳定移动n保保留留时时间间t tR R：从从进进样样开开始始到到组组分分出出现现浓浓度度极极大大点点时时所所需需时时间间，即组分通过色谱柱所需要的时间即组分通过色谱柱所需要的时间n死死时时间间tmtm：不不被被固固定定相相溶溶解解或或吸吸附附的的组组分分的的保保留留时时间间（即即组组分分在在流流动动相相中中的的所所消消耗耗的的时时间间），或或流流动动相相充充满满柱柱内内空空隙隙体体积占据的空间所需要的时间，又称流动相保留时间积占据的空间所需要的时间，又称流动相保留时间n调调整整保保留留时时间间t tR R：组组分分的的保保留留时时间间与与死死时时间间之之差差值值，即即组组分

35、在固定相中滞留的时分在固定相中滞留的时高效液相色谱法高效液相色谱法n色谱图及其参数（见图）色谱图及其参数（见图）n保留时间保留时间t tR R ：定性定性n峰高峰高h h ：峰顶到基线的距离。可用于定量：峰顶到基线的距离。可用于定量n半峰宽半峰宽W W1/21/2：峰高一半处的宽度：峰高一半处的宽度n峰宽峰宽W W：从色谱峰两侧拐点作切线与基线相交部分：从色谱峰两侧拐点作切线与基线相交部分n峰面积峰面积A A：色谱峰与基线之间所包括的面积，常用：色谱峰与基线之间所包括的面积，常用来定量来定量49高效液相色谱法高效液相色谱法不对称因子不对称因子正常峰（对称）正常峰（对称）正常峰（对称）正常峰（对

36、称）非正常峰非正常峰非正常峰非正常峰前沿峰前沿峰前沿峰前沿峰拖尾峰拖尾峰拖尾峰拖尾峰色谱峰色谱峰色谱峰色谱峰fs在在0.951.05之间之间fs小于小于0.95fs大于大于1.05HPLC HPLC HPLC HPLC 流出曲线和色谱峰流出曲线和色谱峰流出曲线和色谱峰流出曲线和色谱峰高效液相色谱法高效液相色谱法n系统适用性实验：系统适用性实验：n理论塔板数（理论塔板数（n n）：）：n分离度（分离度（R R）：）：n重复性重复性n对照溶液（待测物质或其他）连续进样对照溶液（待测物质或其他）连续进样3 35 5次次n相对标准偏差应不大于相对标准偏差应不大于2.0%2.0%n拖尾因子（拖尾因子（T

37、 T）：）：高效液相色谱法高效液相色谱法n分离度分离度计算计算n相临两组分间峰顶间距离是峰底宽平均值的几相临两组分间峰顶间距离是峰底宽平均值的几倍（衡量色谱分离条件优劣的参数）倍（衡量色谱分离条件优劣的参数）5222112WWttRRR+-=峰峰宽和之半和之半）保留保留值之差（峰之差（峰顶间距距高效液相色谱法高效液相色谱法n操作方法操作方法n操作前的准备：操作前的准备：n仪器检查仪器检查n流动相的制备纯化流动相的制备纯化n供试品和对照品溶液配制（各两份）供试品和对照品溶液配制（各两份）n系统适用性试验系统适用性试验n测定法测定法n定量依据：峰面积（或峰高）定量定量依据：峰面积（或峰高）定量n杂

38、质含量：峰面积法杂质含量：峰面积法 53高效液相色谱法高效液相色谱法n含量测定含量测定n面积归一法面积归一法 C%=Ai/A100%C%=Ai/A100%n内标加校正因子法：少用内标加校正因子法：少用n外标法外标法:常用常用54高效液相色谱法高效液相色谱法n三黄片（小片）中大黄的测定三黄片（小片）中大黄的测定n检验依据（中国药典检验依据（中国药典20102010年版一部年版一部457457页）页）n【处方】大黄【处方】大黄300g 300g 盐酸小檗碱盐酸小檗碱5g 5g 黄芩浸膏黄芩浸膏21g21g55高效液相色谱法高效液相色谱法n【含量测定】大黄【含量测定】大黄 照高效液相色谱法（附录照高

39、效液相色谱法（附录 D D）测定。）测定。n色谱条件与系统适用性试验色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-0.1%0.1%磷酸溶液（磷酸溶液（85:1585:15）为流动相；检测波长为）为流动相；检测波长为254nm254nm。理论板数按大黄素。理论板数按大黄素峰计算应不低于峰计算应不低于20002000。n对照品溶液的制备对照品溶液的制备 取大黄素对照品和大黄酚对照品适量，精密称定，加取大黄素对照品和大黄酚对照品适量，精密称定，加无水乙醇无水乙醇-乙酸乙酯（乙酸乙酯（2:12:1）混合溶液制成每）混合溶液制成每1ml1ml含大黄素

40、含大黄素10g10g、大黄酚、大黄酚25g25g的混合液，即得。的混合液，即得。n供试品溶液的制备供试品溶液的制备 取本品取本品2020片，除去包衣，精密称定，研细（过三号筛）片，除去包衣，精密称定，研细（过三号筛），取约，精密称定，置锥形瓶中，精密加乙醇，取约，精密称定，置锥形瓶中，精密加乙醇25ml25ml，称定重量，加热回流，称定重量，加热回流1 1小时，放冷，用乙醇补足减失的重量，滤过，精密量取续滤液小时，放冷，用乙醇补足减失的重量，滤过，精密量取续滤液10ml10ml，置，置烧瓶中，蒸干，加烧瓶中，蒸干，加30%30%乙醇乙醇-盐酸（盐酸（10:110:1）混合溶液）混合溶液15ml

41、15ml，置水浴中加热水，置水浴中加热水解解1 1小时，立即冷却，用三氯甲烷强力振摇提取小时，立即冷却，用三氯甲烷强力振摇提取4 4次，每次次，每次15ml15ml，合并三氯，合并三氯甲烷液，蒸干，残渣用无水乙醇甲烷液，蒸干，残渣用无水乙醇-乙酸乙酯（乙酸乙酯（2:12:1）的混合溶液溶解，转移）的混合溶液溶解，转移至至25ml25ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。n测定法测定法 分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10l10l，注入液相色谱仪，注入液相色谱仪，测定，即得。测定，即得。n本

42、品每片含大黄以大黄素（本品每片含大黄以大黄素（C C1515H H1010O O5 5）和大黄酚（）和大黄酚（C C1515H H1010O O4 4）总量计，小片不）总量计，小片不得少于；大片不得少于。得少于；大片不得少于。56高效液相色谱法：高效液相色谱法：三黄片中大黄的测定三黄片中大黄的测定n流动相的配制流动相的配制 取甲醇（色谱纯）取甲醇（色谱纯）425ml425ml和和0.1%0.1%磷酸溶液磷酸溶液75ml75ml混合均匀，用的滤膜过滤，超声处理混合均匀，用的滤膜过滤，超声处理30min30min，即得。，即得。n对照品溶液的制备对照品溶液的制备 分别精密称取大黄素对照品分别精密称

43、取大黄素对照品25mg25mg和大黄酚和大黄酚对照品对照品63mg63mg，置，置25ml25ml量瓶中，加无水乙醇量瓶中，加无水乙醇-乙酸乙酯（乙酸乙酯（2:12:1）混合溶液至刻度，摇匀，精密量取混合溶液至刻度，摇匀，精密量取1ml1ml，置，置100ml100ml量瓶中，加量瓶中，加无水乙醇无水乙醇-乙酸乙酯（乙酸乙酯（2:12:1）混合溶液至刻度，摇匀，用的滤）混合溶液至刻度，摇匀，用的滤膜过滤，即得。膜过滤，即得。n供试品溶液的制备供试品溶液的制备 取本品取本品2020片，用小刀除去包衣（注意勿损片，用小刀除去包衣（注意勿损失内容物），精密称定，置研钵中研细后，过三号筛，取约，失内容

44、物），精密称定，置研钵中研细后，过三号筛，取约，置锥形瓶中，依法操作，即得。置锥形瓶中，依法操作，即得。n测定，照高效液相色谱法测定。测定，照高效液相色谱法测定。n实验数据实验数据：2020片总重量为片总重量为0 0g g；m m供、供、m m对（大黄素）、对（大黄素）、m m对（大对（大黄酚）；黄酚）；A A供（大黄素）供（大黄素）=285721=285721、A A供（大黄酚）供（大黄酚）=538079=538079、A A对（大黄素）对（大黄素）463379463379、A A对（大黄酚）对（大黄酚）=1300561=1300561。57高效液相色谱法：高效液相色谱法：三黄片中大黄的测定

45、三黄片中大黄的测定58高效液相色谱法：高效液相色谱法：三黄片中大黄的测定三黄片中大黄的测定 n【处方处方】黄连黄连165g 165g 大黄大黄500g 500g 黄芩黄芩250g250gn【含量测定含量测定】照高效液相色谱法照高效液相色谱法(附录附录 )测定。测定。n色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇磷酸二氢钠缓冲液（用磷酸调节磷酸二氢钠缓冲液（用磷酸调节pHpH值至）值至）(42(4258)58)为流动相；检测波长为流动相；检测波长为为275nm275nm。理论板数按黄芩苷峰计算应不低于。理论板数按黄芩

46、苷峰计算应不低于50005000。n对照品溶液的制备精密称取黄芩苷对照品，置对照品溶液的制备精密称取黄芩苷对照品，置250ml250ml量瓶中量瓶中,加甲醇加甲醇10ml10ml使溶解使溶解,用水稀释至刻度用水稀释至刻度,摇匀摇匀,即得即得(每每1ml1ml中含黄芩苷中含黄芩苷50g)50g)。n供试品溶液的制备取本品装量差异项下的本品，研细，取约，精密称定，供试品溶液的制备取本品装量差异项下的本品，研细，取约，精密称定，置置100ml100ml量瓶中量瓶中,加甲醇加甲醇10ml10ml，超声处理（功率，超声处理（功率250W250W，频率，频率50kHz50kHz）1010分钟，分钟，放冷，

47、加水稀释至刻度放冷，加水稀释至刻度,摇匀，离心，取上清液，即得。摇匀，离心，取上清液，即得。n测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10l,10l,注入液相色谱仪注入液相色谱仪,测定，即得。测定，即得。n本品每袋含黄芩以黄芩苷本品每袋含黄芩以黄芩苷(C(C2121H H1818O O1111)计，不得少于计，不得少于21m21mg g。59高效液相色谱法：高效液相色谱法：一清颗粒一清颗粒气相色谱法气相色谱法n气相色谱法：以气体为流动相的柱色谱分离技术气相色谱法：以气体为流动相的柱色谱分离技术n n分类分类分类分类n n按固定相分按固定相分按固定相分

48、按固定相分n n气气气气-固色谱固色谱固色谱固色谱n n气气气气-液色谱液色谱液色谱液色谱n n按分离原理分按分离原理分按分离原理分按分离原理分n n吸附色谱吸附色谱吸附色谱吸附色谱n n分配色谱分配色谱分配色谱分配色谱n n按柱子粗细分按柱子粗细分按柱子粗细分按柱子粗细分n n填充柱色谱填充柱色谱填充柱色谱填充柱色谱n n毛细管柱色谱毛细管柱色谱毛细管柱色谱毛细管柱色谱n适用性适用性n分析气体、易挥发的液体及固体分析气体、易挥发的液体及固体n不适合分析不易气化或不稳定性物质不适合分析不易气化或不稳定性物质n样品的衍生化使应用范围进一步扩大样品的衍生化使应用范围进一步扩大 60气相色谱法气相色

49、谱法n n气相色谱仪的组成气相色谱仪的组成气相色谱仪的组成气相色谱仪的组成n n载气系统、进样系统、分离系统、检测系统、记录系统载气系统、进样系统、分离系统、检测系统、记录系统载气系统、进样系统、分离系统、检测系统、记录系统载气系统、进样系统、分离系统、检测系统、记录系统61 载气载气载气载气减压减压减压减压净化净化净化净化稳压稳压稳压稳压 色谱柱色谱柱色谱柱色谱柱检测器检测器检测器检测器记录仪记录仪记录仪记录仪进样进样进样进样62气相色谱法气相色谱法流出曲线流出曲线（色谱图）（色谱图）：电信号强度随时间变化曲线：电信号强度随时间变化曲线色谱峰：流出曲线上突起部分色谱峰：流出曲线上突起部分63

50、不对称因子不对称因子正常峰（对称）正常峰（对称）正常峰（对称）正常峰（对称）非正常峰非正常峰非正常峰非正常峰前沿峰前沿峰前沿峰前沿峰拖尾峰拖尾峰拖尾峰拖尾峰色谱峰色谱峰色谱峰色谱峰fs在之间fs小于fs大于气相色谱法气相色谱法n操作前准备操作前准备n样品溶液和对照品溶液的制备样品溶液和对照品溶液的制备：定量测定时，对照品溶定量测定时，对照品溶液和供试品溶液均应分别配制液和供试品溶液均应分别配制2 2份。份。n仪器检查仪器检查n系统适用性试验系统适用性试验：同高效液相色谱法同高效液相色谱法n理论板数理论板数n分离度分离度n重复性重复性：相对标准偏差应不大于相对标准偏差应不大于2.0%2.0%n拖