《分光光度法》PPT课件.ppt

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1、第八章第八章吸吸 光光 光光 度度 法法1化学分析化学分析：常量组分：常量组分(1%),Er 0.1%0.2%依据化学反应依据化学反应,使用玻璃仪器使用玻璃仪器 化学分析与仪器分析方法比较化学分析与仪器分析方法比较仪器分析仪器分析：微量组分：微量组分(105为高灵敏度为高灵敏度;10104 4*选择性好选择性好*显色剂在测定波长处无明显吸收。显色剂在测定波长处无明显吸收。对照性好对照性好,maxmax60 nm.60 nm.*反应生成的有色化合物反应生成的有色化合物组成恒定，稳定组成恒定，稳定。*显色条件易于控制，显色条件易于控制，重现性好重现性好。6.2 光度分析法的设计光度分析法的设计6.

2、2.1 显色反应显色反应34：助色团助色团NH2，OH，X （孤对电子）（孤对电子）ne2.显色剂显色剂O生色团生色团：NN，NO，OC=S,N （共轭双键）（共轭双键）e无机显色剂无机显色剂:SCN-Fe(SCN)2+H2O2 TiOH2O22+有机显色剂有机显色剂:35有机显色剂有机显色剂 CH3CCCH3 HON NOH NNOHCOOHSO3HOO型：型：NNNOH OHON型型：PARNH NHNSNS型型：双硫腙双硫腙NN型：型：丁二丁二酮肟酮肟邻二邻二氮菲氮菲磺基水杨酸磺基水杨酸36 实验条件包括实验条件包括:溶液酸度，显色剂用量，试剂溶液酸度，显色剂用量，试剂加入顺序，显色时间

3、，显色温度，有机络合物的加入顺序，显色时间，显色温度，有机络合物的稳定性及共存离子的干扰等稳定性及共存离子的干扰等。（1）溶液的酸度）溶液的酸度 M+HR=MR+H+*影响显色剂的平衡浓度和颜色影响显色剂的平衡浓度和颜色*影响被测金属离子的存在状态影响被测金属离子的存在状态*影响络合物的组成影响络合物的组成 pH与吸光度关系曲线确定与吸光度关系曲线确定pH 范围。范围。6.2.2 显色条件的选择显色条件的选择37（2）显色剂的用量）显色剂的用量 M(被测组分被测组分)+R(显色剂显色剂)=MR(有色络合物有色络合物)为使显色反应进行完全，需加入过量的显色剂。但为使显色反应进行完全，需加入过量的

4、显色剂。但显色剂不是越多越好。有些显色反应，显色剂加人太显色剂不是越多越好。有些显色反应，显色剂加人太多，反而会引起副反应，对测定不利。在实际工作中多，反而会引起副反应，对测定不利。在实际工作中根据实验结果来确定显色剂的用量。根据实验结果来确定显色剂的用量。c(R)c(R)c(R)38（3 3）显色反应时间显色反应时间 有有些些显显色色反反应应瞬瞬间间完完成成，溶溶液液颜颜色色很很快快达达到到稳稳定定状状态态，并并在在较较长长时时间间内内保保持持不不变变;有有些些显显色色反反应应虽虽能能迅迅速速完完成成，但但有有色色络络合合物物的的颜颜色色很很快快开开始始褪褪色色;有有些些显显色色反反应应进进

5、行行缓缓慢慢，溶溶液液颜颜色色需需经经一一段段时时间后才稳定。制作吸光度间后才稳定。制作吸光度-时间曲线确定适宜时间。时间曲线确定适宜时间。（4）显显色色反反应应温温度度：显显色色反反应应大大多多在在室室温温下下进进行行。但是，有些显色反应必需加热至一定温度完成但是，有些显色反应必需加热至一定温度完成。（5）溶溶剂剂：有有机机溶溶剂剂降降低低有有色色化化合合物物的的解解离离度度，提提高高显显色色反反应应的的灵灵敏敏度度。如如在在Fe(SCN)3的的溶溶液液中中加加入入丙丙酮酮颜颜色色加加深深。还还可可能能提提高高显显色色反反应应的的速速率率，影响有色络合物的溶解度和组成等。影响有色络合物的溶解

6、度和组成等。39邻二氮菲亚铁反应完全度与邻二氮菲亚铁反应完全度与pH的关系的关系 Fe2+3RHHA柠檬酸柠檬酸c(R)R=10-4molL-13103FeR340pH38为适宜为适宜的酸度范围的酸度范围41（6 6）干）干扰及其消除方法及其消除方法a.控制溶液酸度控制溶液酸度b.加加入入掩掩蔽蔽剂剂 选选取取的的条条件件是是掩掩蔽蔽剂剂不不与与待待测测离离子子作作用用，掩掩蔽蔽剂剂以以及及它它与与干干扰扰物物质质形形成成的的络络合合物物的的颜颜色色应不干扰待测离子的测定。应不干扰待测离子的测定。c.利用氧化还原反应，改变干扰离子的价态利用氧化还原反应，改变干扰离子的价态 d.利用校正系数利用

7、校正系数e.用参比溶液消除显色剂和某些共存有色离子的干扰。用参比溶液消除显色剂和某些共存有色离子的干扰。f.选择适当的波长选择适当的波长g.当当溶溶液液中中存存在在有有消消耗耗显显色色剂剂的的干干扰扰离离子子时时，可可通通过过增加显色剂的用量来消除干扰。增加显色剂的用量来消除干扰。h.分离分离 以上方法均不奏效时，采用预先分离的方法。以上方法均不奏效时，采用预先分离的方法。42测量波长和吸光度范围的选择测量波长和吸光度范围的选择（1 1）测测 量量 波波 长长 的的 选选 择择 为为 了了 使使 测测 定定 结结 果果 有有 较较高高 的的 灵灵 敏敏 度度，应应 选选 择择 被被 测测 物物

8、 质质 的的 最最 大大 吸吸 收收 波波长长的的光光作作为为入入射射光光，这这称称为为“最最 大大 吸吸 收收 原原 则则”（maximum absorption）。选选 用用 这这 种种 波波 长长 的的光光 进进 行行 分分 析析，不不 仅仅 灵灵 敏敏 度度 高高，且且 能能 减减 少少 或或 消消除除 由由 非非 单单 色色 光光 引引 起起 的的 对对 朗朗 伯伯-比比 尔尔 定定 律律 的的 偏偏 离离。但但 是是，在在 最最 大大 吸吸 收收 波波 长长 处处 有有 其其 他他 吸吸 光光 物物质质 干干 扰扰 测测 定定 时时，则则 应应 根根 据据 入入 射射 光光 波波

9、长长 吸吸 收收 最最大大，干干扰扰最最小小的的原原则则。43例例 丁二酮肟光度法测钢中镍，丁二酮肟光度法测钢中镍，络合物丁二酮肟镍的最大吸收络合物丁二酮肟镍的最大吸收波长为波长为470 nm，但试样中的铁，但试样中的铁用酒石酸钠掩蔽后，在用酒石酸钠掩蔽后，在470 nm处也有一定吸收，干扰镍的测处也有一定吸收，干扰镍的测定。为避免铁的干扰，可以选定。为避免铁的干扰，可以选择波长择波长 520 nm进行测定，虽然进行测定，虽然测镍的灵敏度有所降低，但酒测镍的灵敏度有所降低，但酒石酸铁不干扰镍的测定。石酸铁不干扰镍的测定。44（2）吸光度范围的选择）吸光度范围的选择 从从仪仪器器测测量量误误差差

10、的的角角度度来来看看，为为使使测测量量结结果果得得到到较较高高的的准准确确度度，一一般般应应控控制制标标准准溶溶液液和和被被测测试试液液的的吸吸光光度度在在范范围围内内。可可通通过过控控制制溶溶液液的的浓浓度度或或选选择择不不同同厚厚度度的的吸吸收收池来达到目的。池来达到目的。456.2.4 6.2.4 参比溶液的选择参比溶液的选择 利用参比溶液来调节仪器的零点，可消除利用参比溶液来调节仪器的零点，可消除由吸收池壁及溶剂对入射光的反射和吸收带由吸收池壁及溶剂对入射光的反射和吸收带来的误差，扣除干扰的影响。参比溶液选择：来的误差，扣除干扰的影响。参比溶液选择：a 试液及显色剂均无色，蒸馏水作参比

11、溶液。试液及显色剂均无色，蒸馏水作参比溶液。b 显显色色剂剂为为无无色色，被被测测试试液液中中存存在在其其他他有有色色离离子子，用用不不加加显显色色剂剂的的被被测测试试液液作作参参比比溶溶液。液。c 显显色色剂剂有有颜颜色色，可可选选择择不不加加试试样样溶溶液液的的试试剂空白作参比溶液。剂空白作参比溶液。46d 显色剂和试液均有颜色，可将一份试液加入适显色剂和试液均有颜色，可将一份试液加入适当掩蔽剂，将被测组分掩蔽起来，使之不再与当掩蔽剂，将被测组分掩蔽起来，使之不再与显色剂作用，而显色剂及其他试剂均按试液测显色剂作用，而显色剂及其他试剂均按试液测定方法加入，以此作为参比溶液，这样就可以定方法

12、加入，以此作为参比溶液，这样就可以消除显色剂和一些共存组分的干扰。消除显色剂和一些共存组分的干扰。e 改变加入试剂的顺序，使被测组分不发生显色改变加入试剂的顺序，使被测组分不发生显色反应，可以此溶液作为参比溶液消除干扰。反应，可以此溶液作为参比溶液消除干扰。47 0 1 2 3 4 mg/mlA。*0.80.60.40.20溶液浓度的测定溶液浓度的测定A bc工作曲线法工作曲线法(校准曲线校准曲线)6.2.5 标准曲线的制作标准曲线的制作(p229)486.36.3光度分析法的光度分析法的误差差11对朗伯对朗伯-比尔定律的偏离比尔定律的偏离 在吸光光度分析中，经常出现标准曲线不呈直线在吸光光度

13、分析中，经常出现标准曲线不呈直线的情况，特别是当吸光物质浓度较高时，明显地看到的情况，特别是当吸光物质浓度较高时，明显地看到通过原点向浓度轴弯曲的现象通过原点向浓度轴弯曲的现象(吸光度轴弯曲吸光度轴弯曲)。这种。这种情情况况称称为为偏偏离离朗朗伯伯-比比尔尔定定律律。若若在在曲曲线线弯弯曲曲部部分分进进行定量，将会引起较大的误差。行定量，将会引起较大的误差。偏离朗伯比尔定律偏离朗伯比尔定律的原因主要是仪器或溶液的原因主要是仪器或溶液的实际条件与朗伯的实际条件与朗伯-比尔定比尔定律所要求的理想条件不一致。律所要求的理想条件不一致。49（1）非单色光引起的偏离）非单色光引起的偏离 *朗朗伯伯-比比

14、尔尔定定律律只只适适用用于于单单色色光光，但但由由于于单单色色器器色色散散能能力力的的限限制制和和出出口口狭狭缝缝需需要要保保持持一一定定的的宽宽度度，所所以以目目前前各各种种分分光光光光度度计计得得到到的的入入射射光光实实际际上上都都是是具具有有某某一一波波段段的的复复合合光光。由由于于物物质质对对不不同同波波长长光光的的吸吸收收程程度度的的不不同同，因因而而导导致致对对朗朗伯伯比比尔尔定定律的偏离律的偏离。50*克服非单色光引起的偏离的措施克服非单色光引起的偏离的措施 使用比较好的单色器，从而获得纯度较高的使用比较好的单色器，从而获得纯度较高的 “单色光单色光”，使标准曲线有较宽的线性范围

15、。，使标准曲线有较宽的线性范围。人射光波长选择在被测物质的最大吸收处，保证人射光波长选择在被测物质的最大吸收处，保证测定有较高的灵敏度，此处的吸收曲线较为平坦，测定有较高的灵敏度，此处的吸收曲线较为平坦，在此最大吸收波长附近各波长的光的在此最大吸收波长附近各波长的光的值大体相等，值大体相等，由于非单色光引起的偏离要比在其他波长处小得由于非单色光引起的偏离要比在其他波长处小得多。多。测定时应选择适当的浓度范围，使吸光度读数测定时应选择适当的浓度范围，使吸光度读数在标准曲线的线性范围内。在标准曲线的线性范围内。51（2 2）介质不均匀引起的偏离介质不均匀引起的偏离 朗朗伯伯比比尔尔定定律律要要求求

16、吸吸光光物物质质的的溶溶液液是是均均匀匀的的。如如果果被被测测溶溶液液不不均均匀匀，是是胶胶体体溶溶液液、乳乳浊浊液液或或悬悬浮浮液液时时，入入射射光光通通过过溶溶液液后后，除除一一部部分分被被试试液液吸吸收收外外，还还有有一一部部分分因因散散射射现现象象而而损损失失，使使透透射射比比减减少少，因因而而实实测测吸吸光光度度增增加加，便便标标准准曲曲线线偏偏离离直直线线向向吸吸光光度度轴轴弯弯曲曲。故故在在光光度度法法中中应应避避免免溶溶液液产产生生胶体或混浊。胶体或混浊。52（3 3）由于溶液本身的化学反应引起的偏离由于溶液本身的化学反应引起的偏离 溶溶液液中中的的吸吸光光物物质质常常因因解解

17、离离、缔缔合合、形形成成新新化化合合物物或或互互变变异异构构等等化化学学变变化化而而改改变变其其浓浓度度，因因而而导致偏离朗伯导致偏离朗伯比尔定律。比尔定律。A 解解离离 大大部部分分有有机机酸酸碱碱的的酸酸式式、碱碱式式对对光光有有不不同同的的吸吸收收性性质质，溶溶液液的的酸酸度度不不同同，酸酸(碱碱)解解离离程程度度不不同同，导导致致酸酸式式与与碱碱式式的的比比例例改改变变，使使溶溶液液的的吸吸光光度发生改变。度发生改变。53 B 络合络合 显色剂与金属离子生成的是多级络合物，显色剂与金属离子生成的是多级络合物，且各级络合物对光的吸收性质不同，例如在且各级络合物对光的吸收性质不同，例如在F

18、e()与与SCN-的络合物中，的络合物中，Fe(SCN)3颜色最深，颜色最深，Fe(SCN)2+颜色最浅，故颜色最浅，故SCN-浓度越大，溶液颜浓度越大，溶液颜色越深，即吸光度越大。色越深，即吸光度越大。c 缔合缔合 例如在酸性条件下，例如在酸性条件下，CrO42-会缔合生成会缔合生成Cr2O72-，而它们对光的吸收有很大的不同。，而它们对光的吸收有很大的不同。在分析测定中，要控制溶液的条件，使被测在分析测定中，要控制溶液的条件，使被测组分以一种形式存在，以克服化学因素所引起的组分以一种形式存在，以克服化学因素所引起的对朗伯比尔定律的偏离。对朗伯比尔定律的偏离。5422吸光度吸光度测量的量的误

19、差差 在吸光光度分析中，仪器测量不准确也是误差在吸光光度分析中，仪器测量不准确也是误差的主要来源。任何光度计都有一定的测量误差。这的主要来源。任何光度计都有一定的测量误差。这些误差可能来源于光源不稳定，实验条件偶然变动，些误差可能来源于光源不稳定，实验条件偶然变动，读数不准确等。读数不准确等。在光度计中，透射比的标尺刻度均匀。吸光度标在光度计中，透射比的标尺刻度均匀。吸光度标尺刻度不均匀。对于同一仪器，读数的波动对透射尺刻度不均匀。对于同一仪器，读数的波动对透射比为一定值；而对吸光度读数波动则不再为定值。比为一定值；而对吸光度读数波动则不再为定值。吸光度越大，读数波动所引起的吸光度误差也越大吸

20、光度越大，读数波动所引起的吸光度误差也越大55 透射比很小或很大时，浓度测量误差都较大，即透射比很小或很大时，浓度测量误差都较大，即光度测量最好选吸光度读数在刻度尺的中间而不落两光度测量最好选吸光度读数在刻度尺的中间而不落两端。待测溶液的透射比端。待测溶液的透射比T在在15%65%之间，或使吸光之间，或使吸光度度A在之间，才能保证测量的相对误差较小。在之间，才能保证测量的相对误差较小。当当A=0.434(或透射比或透射比T=36.8%)时，测量的相对误时，测量的相对误差最小。差最小。566.4 其他吸光光度法及吸光光度法其他吸光光度法及吸光光度法应用用1 示差吸光光度法示差吸光光度法2 双波长

21、吸光光度法双波长吸光光度法3 弱酸和弱碱解离常数的测定弱酸和弱碱解离常数的测定4 络合物组成的测定络合物组成的测定57（1）示差吸光光度法的原理）示差吸光光度法的原理 吸吸光光光光度度法法一一般般仅仅适适用用于于微微量量组组分分的的测测定定，当当待待测测定定组组分分浓浓度度过过高高或或过过低低，会会引引起起很很大大的的测测量量误误差差，导导致致准准确确度度降降低低。示示差差吸吸光光光光度度法法可可克克服服这这一一缺缺点点。目目前前，主主要要有有高高浓浓度度示示差差吸吸光光光光度度法法、低低浓浓度度示示差差吸吸光光光光度度法法和和使使用用两两个个参参比比溶溶液液的的精精密密示示差差吸吸光光光光度

22、度法法。它它们们的的基基本本原原理理相相同同，且且以以高高浓浓度度示示差差吸吸光光光光度度法法应应用用最最多多，仅仅介介绍绍高高浓浓度度示差吸光光度法。示差吸光光度法。6.4.16.4.1示差吸光光度法示差吸光光度法58 吸光度差与这两种溶液的浓度差成正比。以把吸光度差与这两种溶液的浓度差成正比。以把空白溶液作为参比的稀溶液的标准曲线作为空白溶液作为参比的稀溶液的标准曲线作为A和和c的标准曲线，根据测得的的标准曲线，根据测得的A求出相应的求出相应的c值，值，从从cx=co+c可求出待测试液的浓度，这就是示差吸可求出待测试液的浓度，这就是示差吸光光度法定量的基本原理。光光度法定量的基本原理。59

23、（2）示差吸光光度法的误差）示差吸光光度法的误差 c(即即cxco)，测测量量误误差差为为x%，结结果果为为cx(cx-co)x%；普普通通光光度度法法的的结结果果为为cxcxx%。因因cx只只是是稍稍大大于于co，故故cx总总是是远远大大于于c，故故示示差差吸吸光光光光度度法法的的准准确确度度高高。参参比比溶溶液液的的浓浓度度越越接接近近待待测测试试液液的的浓度，测量误差越小，最小误差可达浓度，测量误差越小，最小误差可达0.3%。60（1）双波长吸光光度法的原理）双波长吸光光度法的原理 使两束不同波长的单色光以一定的时使两束不同波长的单色光以一定的时间间隔交替地照射同一吸收池，测量并记间间隔

24、交替地照射同一吸收池，测量并记录两者吸光度的差值。这样就可以从分析录两者吸光度的差值。这样就可以从分析波长的信号中扣除来自参比波长的信号，波长的信号中扣除来自参比波长的信号，消除各种干扰，得待测组分的含量。分析消除各种干扰，得待测组分的含量。分析方法的灵敏度、选择性及测量的精密度高。方法的灵敏度、选择性及测量的精密度高。被广泛用于环境试样及生物试样的分析被广泛用于环境试样及生物试样的分析。6.4.2 双波长吸光光度法双波长吸光光度法61 A与吸光物质浓度成正比。这是定量的理论依与吸光物质浓度成正比。这是定量的理论依据。只用一个吸收池，以试液本身对某一波长的光据。只用一个吸收池，以试液本身对某一

25、波长的光的吸光度为参比，消除了因试液与参比液及两个吸的吸光度为参比，消除了因试液与参比液及两个吸收池之间的差异引起的测量误差，提高测量的准确度。收池之间的差异引起的测量误差，提高测量的准确度。62（2）双波长吸光光度法的应用）双波长吸光光度法的应用*混混浊浊试试液液中中组组分分测测定定：一一般般选选择择待待测测组组分分的的最最大大吸吸收收波波长长为为测测量量波波长长(l)，选选择择与与其其相相近近而而两两波波长长相相差差在在4060 nm范范围围内内且且有有较较大大的的A值值的的波波长为参比波长。长为参比波长。*单单组组分分的的测测定定：进进行行单单组组分分的的测测定定，以以络络合合物物吸吸收

26、收峰峰作作测测量量波波长长，参参比比波波长长的的选选择择有有：以以等等吸吸收收点点为为参参比比波波长长;以以有有色色络络合合物物吸吸收收曲曲线线下下端端的的某某一一波波长长作作为为参参比比波波长长；以以显显色色剂剂的的吸吸收收峰峰为为参参比比波长。波长。63*两组分共存时的分别测定两组分共存时的分别测定：当两种组分的吸收光谱当两种组分的吸收光谱有重叠时，要测定其中一个组分就必须消除另一组有重叠时，要测定其中一个组分就必须消除另一组分的光吸收。对于相互干扰的双组分体系，它们的分的光吸收。对于相互干扰的双组分体系，它们的吸收光谱重叠，选择参比波长和测定波长的条件是吸收光谱重叠，选择参比波长和测定波

27、长的条件是:待测组分在两波长处的吸光度之差待测组分在两波长处的吸光度之差A要足够大，要足够大，干扰组分在两波长处的吸光度应相等，这样用双波干扰组分在两波长处的吸光度应相等，这样用双波长法测得的吸光度差只与待测组分的浓度成线性关长法测得的吸光度差只与待测组分的浓度成线性关系，与干扰组分无关，从而消除了干扰系，与干扰组分无关，从而消除了干扰。64 测定苯酚测定苯酚(X)与与2，4，6-三氯苯酚三氯苯酚(Y)混合物中的混合物中的苯酚时就可用这种方法。苯酚时就可用这种方法。当选择当选择2为测量波长，三为测量波长，三氯苯酚在此波长处也有较氯苯酚在此波长处也有较大吸收，产生干扰。选择大吸收，产生干扰。选择

28、波长波长1或或1（等吸收点）（等吸收点）作为参比波长，则可以消作为参比波长，则可以消除三氯苯酚对苯酚测定的除三氯苯酚对苯酚测定的干扰。干扰。653 弱酸和弱碱解离常数的测定弱酸和弱碱解离常数的测定 HB=H+B-666.4.4 络合物组成的测定络合物组成的测定（1）饱和法）饱和法(又称摩尔比法又称摩尔比法)固定一种组分固定一种组分(通常是金通常是金属离子属离子M)的浓度，改变络合的浓度，改变络合剂剂(R)的浓度，得到一系列的浓度，得到一系列R/M比值不同的溶液，比值不同的溶液，并配制相应的试剂空白作并配制相应的试剂空白作参比液，分别测定其吸光度。参比液，分别测定其吸光度。以吸光度以吸光度A为纵

29、坐标，为纵坐标，R/M为横坐标作图。为横坐标作图。67（2）连续变化法）连续变化法(又称等摩尔系列法又称等摩尔系列法)cM+cR=c，改变，改变cM和和cR的相对量，的相对量，配制一系列溶液，在有色络合物配制一系列溶液，在有色络合物的最大吸收波长处测量这一系列的最大吸收波长处测量这一系列溶液的吸光度。当溶液中络合物溶液的吸光度。当溶液中络合物MRn浓度最大时，浓度最大时，cR/cM比值为比值为n。当当cM/c为时，络合比为为时，络合比为1:1；当当cM/c为，络合比为为，络合比为1:2；当当cM/c时，络合比为时，络合比为1:3。681 了了解解分分子子对对光光的的吸吸收收与与溶溶液液颜颜色色

30、的的关关系系.吸吸收收曲曲线线定定性分析的基础。性分析的基础。定定量量分分析析的的基基础础朗朗伯伯-比比尔尔定定律律：A=bc=-lgT 式式中中各各参数的物理意义，定量计算。参数的物理意义，定量计算。2 了了解解目目视视比比色色法法、分分光光光光度度法法的的特特点点，分分光光光光度度计计的的基基本部件。本部件。3 灵敏度的表示灵敏度的表示摩尔吸光系数的意义和计算摩尔吸光系数的意义和计算；准确度准确度适宜的测量范围、偏离比尔定律的原因。适宜的测量范围、偏离比尔定律的原因。4 显显色色反反应应及及条条件件的的确确定定:显显色色剂剂用用量量、酸酸度度、时时间间、温温度、干扰及消除。度、干扰及消除。5 应应用用:单单一一组组分分测测定定示示例例、多多组组分分测测定定、光光度度滴滴定定、络络合物组成的测定、酸碱离解常数的测定。合物组成的测定、酸碱离解常数的测定。第六章第六章 小小 结结69