《发酵工程制药》PPT课件.ppt

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1、第九节第九节 基因工程在发酵工程中的应用基因工程在发酵工程中的应用以天然产物为基础发展药物的方法以天然产物为基础发展药物的方法获得新型结构和生物活获得新型结构和生物活性的抗生素变得越来越难性的抗生素变得越来越难一一.自然分离自然分离合成步骤繁多、合成产率低下合成步骤繁多、合成产率低下二二.化学合成化学合成以微生物作为以微生物作为以微生物作为以微生物作为“细胞工厂细胞工厂细胞工厂细胞工厂”，通过对代谢途径，通过对代谢途径，通过对代谢途径，通过对代谢途径的遗传控制，生物合成所需要的新型药物。的遗传控制，生物合成所需要的新型药物。的遗传控制，生物合成所需要的新型药物。的遗传控制，生物合成所需要的新型

2、药物。基因工程改造传统制药工业基因工程改造传统制药工业体现在四个方面体现在四个方面1 1、抗抗抗抗生生生生素素素素生生生生产产产产：分分分分离离离离抗抗抗抗生生生生素素素素合合合合成成成成酶酶酶酶基基基基因因因因，提高产量、得到杂合抗生素；提高产量、得到杂合抗生素；提高产量、得到杂合抗生素；提高产量、得到杂合抗生素；2 2、氨氨氨氨基基基基酸酸酸酸生生生生产产产产：基基基基因因因因克克克克隆隆隆隆的的的的工工工工程程程程菌菌菌菌、细细细细胞胞胞胞融合育种；融合育种；融合育种；融合育种；3 3、维维维维生生生生素素素素生生生生产产产产：构构构构建建建建制制制制造造造造维维维维生生生生素素素素C

3、C的的的的基基基基因因因因工程菌；工程菌；工程菌；工程菌；4 4、疫疫疫疫苗苗苗苗生生生生产产产产：把把把把抗抗抗抗原原原原克克克克隆隆隆隆到到到到 E.E.colicoli中中中中大大大大量量量量生产疫苗。生产疫苗。生产疫苗。生产疫苗。直接从自然界分离得到的菌株为野生型菌株。直接从自然界分离得到的菌株为野生型菌株。菌种选育菌种选育突变、体内重组、突变、体内重组、体外重组（基因工程）体外重组（基因工程）一一、基因工程在抗生素生产中的应用、基因工程在抗生素生产中的应用往往低产甚至不产所需的产物，只有经过往往低产甚至不产所需的产物，只有经过进一步的人工改造才能真正用于工业生产进一步的人工改造才能真

4、正用于工业生产微生物基因工程育种微生物基因工程育种 这是一种自觉的、能像工程一样事先设这是一种自觉的、能像工程一样事先设计和控制的育种技术，可以完成超远缘杂交，计和控制的育种技术，可以完成超远缘杂交，是最新最有前途的育种方法。是最新最有前途的育种方法。获得特定的目标基因获得特定的目标基因获得特定的目标基因获得特定的目标基因载体载体载体载体(质粒或病毒质粒或病毒质粒或病毒质粒或病毒)目标基因片段目标基因片段目标基因片段目标基因片段质粒质粒质粒质粒DNADNA片段片段片段片段内切酶切割内切酶切割内切酶切割内切酶切割细胞外重组细胞外重组细胞外重组细胞外重组重组重组重组重组DNADNA重组重组重组重组

5、DNADNA进入受体细胞并扩增、表达进入受体细胞并扩增、表达进入受体细胞并扩增、表达进入受体细胞并扩增、表达具有目标基因表达功能的重组体具有目标基因表达功能的重组体具有目标基因表达功能的重组体具有目标基因表达功能的重组体利用遗传标记筛选利用遗传标记筛选利用遗传标记筛选利用遗传标记筛选转化转化转化转化(质粒质粒质粒质粒)、转导或转染、转导或转染、转导或转染、转导或转染(病毒病毒病毒病毒)（一）（一）（一）（一）抗生素生物合成基因的特点及其克隆的策略抗生素生物合成基因的特点及其克隆的策略抗生素生物合成基因的特点及其克隆的策略抗生素生物合成基因的特点及其克隆的策略和方法和方法和方法和方法1 1 1

6、1、抗生素生物合成基因群成员的结构特点、抗生素生物合成基因群成员的结构特点、抗生素生物合成基因群成员的结构特点、抗生素生物合成基因群成员的结构特点 在已知的微生物所产在已知的微生物所产生的抗生素中，约生的抗生素中，约2 23 3由放线菌产生，而其中由放线菌产生，而其中的的8080来源于链霉菌；来源于链霉菌；链霉菌属中的链霉菌，链霉菌属中的链霉菌，有约有约500500个种。个种。2002200220022002年年年年5 5 5 5月月月月，Bentley Bentley Bentley Bentley S.D.S.D.S.D.S.D.等等等等在在在在英英英英国国国国 Nature Nature

7、 Nature Nature 报报报报道道道道了了了了链链链链霉霉霉霉菌菌菌菌的的的的模模模模式式式式种种种种天天天天蓝蓝蓝蓝色色色色链链链链霉霉霉霉菌菌菌菌(Streptomyces Streptomyces Streptomyces Streptomyces coelicolorcoelicolorcoelicolorcoelicolor)A3 A3 A3 A3(2)(2)(2)(2)菌菌菌菌株株株株的的的的基基基基因因因因组组组组全全全全序序序序列列列列研研研研究究究究结结结结果果果果：基基基基因因因因组组组组全全全全序序序序 8,667,507 8,667,507 8,667,507

8、8,667,507 bpbpbpbp，GCGCGCGC含含含含量量量量72.12%72.12%72.12%72.12%，7825782578257825个个个个基基基基因因因因，55555555个个个个假假假假基基基基因因因因，基基基基因因因因平平平平均均均均长长长长度度度度991 991 991 991 bpbpbpbp，编编编编码码码码密度密度密度密度88.9%88.9%88.9%88.9%。链霉菌抗生素生物合成基因群成员的链霉菌抗生素生物合成基因群成员的链霉菌抗生素生物合成基因群成员的链霉菌抗生素生物合成基因群成员的DNADNADNADNA组成组成组成组成GCGCGCGC含量高达含量高达

9、含量高达含量高达70707070以上；以上；以上；以上；三联体密码子中的第三个碱基的三联体密码子中的第三个碱基的三联体密码子中的第三个碱基的三联体密码子中的第三个碱基的GCGCGCGC比例极高。比例极高。比例极高。比例极高。抗生素生物合成基因抗生素生物合成基因成簇存在成簇存在：参与每种抗生素生物合成的基因约参与每种抗生素生物合成的基因约参与每种抗生素生物合成的基因约参与每种抗生素生物合成的基因约1010101030303030个个个个;阿克拉阿克拉阿克拉阿克拉霉素霉素霉素霉素每一种抗生素生物合成相关基因在染色体组中前后每一种抗生素生物合成相关基因在染色体组中前后每一种抗生素生物合成相关基因在染

10、色体组中前后每一种抗生素生物合成相关基因在染色体组中前后排列成基因簇排列成基因簇排列成基因簇排列成基因簇(gene cluster)(gene cluster)(gene cluster)(gene cluster)，包括抗生素的生物合，包括抗生素的生物合，包括抗生素的生物合，包括抗生素的生物合成基因、耐药基因、转运基因和调节基因，而耐药、成基因、耐药基因、转运基因和调节基因，而耐药、成基因、耐药基因、转运基因和调节基因，而耐药、成基因、耐药基因、转运基因和调节基因，而耐药、转运与调节基因三者大多与抗生素生物合成基因紧转运与调节基因三者大多与抗生素生物合成基因紧转运与调节基因三者大多与抗生素生

11、物合成基因紧转运与调节基因三者大多与抗生素生物合成基因紧密连锁密连锁密连锁密连锁并存在一种协同调节机制并存在一种协同调节机制并存在一种协同调节机制并存在一种协同调节机制。抗性基因还参与了抗生素的生物合成与调控，以确抗性基因还参与了抗生素的生物合成与调控，以确抗性基因还参与了抗生素的生物合成与调控，以确抗性基因还参与了抗生素的生物合成与调控，以确保抗生素耐药性的及时表达，从而免受自身抗生素保抗生素耐药性的及时表达，从而免受自身抗生素保抗生素耐药性的及时表达，从而免受自身抗生素保抗生素耐药性的及时表达，从而免受自身抗生素的伤害。研究还发现，的伤害。研究还发现，的伤害。研究还发现，的伤害。研究还发现

12、，产抗菌株的抗性水平与该菌产抗菌株的抗性水平与该菌产抗菌株的抗性水平与该菌产抗菌株的抗性水平与该菌株自身的抗菌素产量水平呈正相关株自身的抗菌素产量水平呈正相关株自身的抗菌素产量水平呈正相关株自身的抗菌素产量水平呈正相关。阿克拉霉素阿克拉霉素AclacinomycinAclacinomycin 目前用于治疗急性白血病目前用于治疗急性白血病(Leukemia)(Leukemia)与淋与淋巴瘤巴瘤(Lymphomas)(Lymphomas)有良好疗效的阿克拉霉素有良好疗效的阿克拉霉素（AclacinomycinAclacinomycin），它是由），它是由Streptomyces Streptomy

13、ces galilaeus galilaeus 合成的聚酮类化合物，其合成酶的合成的聚酮类化合物，其合成酶的生物合成涉及生物合成涉及1313个基因，紧密成簇排列。个基因，紧密成簇排列。返回返回 少数抗生素的生物合少数抗生素的生物合成基因簇存在于游离成基因簇存在于游离状态的质粒上状态的质粒上 如天蓝色链霉菌如天蓝色链霉菌 3(2)3(2)菌株中的次甲霉素菌株中的次甲霉素A A（Methylenomycin Methylenomycin A A）的生物合成基因位）的生物合成基因位于于SCP1SCP1质粒上。质粒上。抗生素生物合成基因群成员的结构特点抗生素生物合成基因群成员的结构特点抗生素生物合成基

14、因群成员的结构特点抗生素生物合成基因群成员的结构特点 链霉菌抗生素生物合成基因群成员的链霉菌抗生素生物合成基因群成员的链霉菌抗生素生物合成基因群成员的链霉菌抗生素生物合成基因群成员的DNADNADNADNA组成：组成：组成：组成：GC GC GC GC含量高达含量高达含量高达含量高达70707070以上、三联体密码以上、三联体密码以上、三联体密码以上、三联体密码子中的第三个碱基的子中的第三个碱基的子中的第三个碱基的子中的第三个碱基的GCGCGCGC比例极高；比例极高；比例极高；比例极高；抗生素生物合成基因成簇存在：参与每种抗生素生物合成基因成簇存在：参与每种抗生素生物合成基因成簇存在：参与每种

15、抗生素生物合成基因成簇存在：参与每种抗生素生物合成的基因约抗生素生物合成的基因约抗生素生物合成的基因约抗生素生物合成的基因约1010101030303030个；个；个；个；少数抗生素的生物合成基因簇存在于游离少数抗生素的生物合成基因簇存在于游离少数抗生素的生物合成基因簇存在于游离少数抗生素的生物合成基因簇存在于游离状态的质粒上。状态的质粒上。状态的质粒上。状态的质粒上。7 7个利用质粒和噬菌体载体来克隆抗生素生物合成基因个利用质粒和噬菌体载体来克隆抗生素生物合成基因个利用质粒和噬菌体载体来克隆抗生素生物合成基因个利用质粒和噬菌体载体来克隆抗生素生物合成基因簇的方法，利用这些策略已经克隆了不同类

16、型抗生素簇的方法，利用这些策略已经克隆了不同类型抗生素簇的方法，利用这些策略已经克隆了不同类型抗生素簇的方法，利用这些策略已经克隆了不同类型抗生素的生物合成基因。这的生物合成基因。这的生物合成基因。这的生物合成基因。这7 7个方法是：个方法是：个方法是：个方法是：在标准宿主系统中克隆检测单基因产物在标准宿主系统中克隆检测单基因产物在标准宿主系统中克隆检测单基因产物在标准宿主系统中克隆检测单基因产物阻断变株法阻断变株法阻断变株法阻断变株法突变克隆法突变克隆法突变克隆法突变克隆法直接克隆法直接克隆法直接克隆法直接克隆法克隆抗生素抗性基因法克隆抗生素抗性基因法克隆抗生素抗性基因法克隆抗生素抗性基因法

17、寡核苷酸探针法寡核苷酸探针法寡核苷酸探针法寡核苷酸探针法同源基因杂交法同源基因杂交法同源基因杂交法同源基因杂交法2 2、克隆抗生素生物合成基因的策略和方法、克隆抗生素生物合成基因的策略和方法 在标准宿主系统中克隆检测单基因产物在标准宿主系统中克隆检测单基因产物在标准宿主系统中克隆检测单基因产物在标准宿主系统中克隆检测单基因产物 “鸟枪法鸟枪法鸟枪法鸟枪法”克隆基因：能够检测到单酶基因的产物。克隆基因：能够检测到单酶基因的产物。克隆基因：能够检测到单酶基因的产物。克隆基因：能够检测到单酶基因的产物。对氨基苯甲酸合成酶对氨基苯甲酸合成酶对氨基苯甲酸合成酶对氨基苯甲酸合成酶(PABA)(PABA)(

18、PABA)(PABA)基因基因基因基因(pabpabpabpab)是是是是灰色链霉菌灰色链霉菌灰色链霉菌灰色链霉菌的的的的杀念珠杀念珠杀念珠杀念珠菌素生物合成酶基因簇菌素生物合成酶基因簇菌素生物合成酶基因簇菌素生物合成酶基因簇的一个成员；的一个成员；的一个成员；的一个成员；以以以以pabpabpabpab (野生型野生型野生型野生型)灰色链霉菌菌株为供体，提取总灰色链霉菌菌株为供体，提取总灰色链霉菌菌株为供体，提取总灰色链霉菌菌株为供体，提取总DNADNADNADNA、BamBamBamBamH HH H切割、与质粒切割、与质粒切割、与质粒切割、与质粒 pIJ41 pIJ41 pIJ41 pI

19、J41重组、转化重组、转化重组、转化重组、转化pabpabpabpab (PABA(PABA(PABA(PABA营养缺陷营养缺陷营养缺陷营养缺陷型型型型)菌株，选择菌株，选择菌株，选择菌株，选择pabpabpabpab (PABA(PABA(PABA(PABA营养原养型营养原养型营养原养型营养原养型)菌株；菌株；菌株；菌株；过量表达过量表达过量表达过量表达PABAPABAPABAPABA的灰色链霉菌具有磺胺抗性，以其为供体、的灰色链霉菌具有磺胺抗性，以其为供体、的灰色链霉菌具有磺胺抗性，以其为供体、的灰色链霉菌具有磺胺抗性，以其为供体、鸟枪法转化变青链霉菌鸟枪法转化变青链霉菌鸟枪法转化变青链霉

20、菌鸟枪法转化变青链霉菌66666666，在转化子中筛选，在转化子中筛选，在转化子中筛选，在转化子中筛选PABAPABAPABAPABA原养型或原养型或原养型或原养型或磺胺抗性菌株；磺胺抗性菌株；磺胺抗性菌株；磺胺抗性菌株；二者筛选出来的阳性转化子都携带一个二者筛选出来的阳性转化子都携带一个二者筛选出来的阳性转化子都携带一个二者筛选出来的阳性转化子都携带一个45 kb45 kb45 kb45 kb的的的的BamBamBamBamHHHH片段，片段，片段，片段，意味着意味着意味着意味着pabpabpabpab基因与磺胺抗性基因可能是同一个基因。基因与磺胺抗性基因可能是同一个基因。基因与磺胺抗性基因

21、可能是同一个基因。基因与磺胺抗性基因可能是同一个基因。鸟枪法克隆目的基因的基本战略鸟枪法克隆目的基因的基本战略鸟枪法克隆目的基因的基本战略鸟枪法克隆目的基因的基本战略 随机克隆供体细胞的全基因组随机克隆供体细胞的全基因组随机克隆供体细胞的全基因组随机克隆供体细胞的全基因组DNADNADNADNA片段，然后通过快速有效片段，然后通过快速有效片段，然后通过快速有效片段，然后通过快速有效的筛选程序从众多克隆中分离出的筛选程序从众多克隆中分离出的筛选程序从众多克隆中分离出的筛选程序从众多克隆中分离出含有目的基因的目的重组子，进含有目的基因的目的重组子，进含有目的基因的目的重组子，进含有目的基因的目的重

22、组子，进而获得目的基因。而获得目的基因。而获得目的基因。而获得目的基因。鸟枪法适用于原核细菌目的基鸟枪法适用于原核细菌目的基鸟枪法适用于原核细菌目的基鸟枪法适用于原核细菌目的基因的克隆分离。因的克隆分离。因的克隆分离。因的克隆分离。2 2、克隆抗生素生物合成基、克隆抗生素生物合成基因的策略和方法因的策略和方法阻断变株法阻断变株法阻断变株法阻断变株法 检测一系列有关某种抗生素生物合成检测一系列有关某种抗生素生物合成检测一系列有关某种抗生素生物合成检测一系列有关某种抗生素生物合成的阻断变异株之间的遗传互补关系，确定被克隆的的阻断变异株之间的遗传互补关系，确定被克隆的的阻断变异株之间的遗传互补关系，

23、确定被克隆的的阻断变异株之间的遗传互补关系，确定被克隆的DNADNADNADNA片段的性质。片段的性质。片段的性质。片段的性质。放线紫红素放线紫红素(actinorhodin)(actinorhodin)是由天蓝链霉菌合成的多酮肽是由天蓝链霉菌合成的多酮肽抗菌素抗菌素,大约通过大约通过16个步骤合成；个步骤合成；对对76个阻断突变体个阻断突变体(act-)进行互补测验研究，进行互补测验研究，Rudd和和Hopwood将它们分成将它们分成7个组，每组代表在不同的生物合个组，每组代表在不同的生物合成步骤发生损伤。成步骤发生损伤。Act和和act 不能与其它突变株互补，说明这两个突变不能与其它突变株

24、互补，说明这两个突变发生在放线紫红素生物合成的最早期的步骤中；发生在放线紫红素生物合成的最早期的步骤中；2 2、克隆抗生素生物合成、克隆抗生素生物合成基因的策略和方法基因的策略和方法阻断变株法阻断变株法阻断变株法阻断变株法 检测一系列有关某种抗生素生物合成的阻断变检测一系列有关某种抗生素生物合成的阻断变检测一系列有关某种抗生素生物合成的阻断变检测一系列有关某种抗生素生物合成的阻断变异株之间的遗传互补关系，确定被克隆的异株之间的遗传互补关系，确定被克隆的异株之间的遗传互补关系，确定被克隆的异株之间的遗传互补关系，确定被克隆的DNADNADNADNA片段的性质。片段的性质。片段的性质。片段的性质。

25、用用pIJ922质粒从质粒从act+菌株中克隆了一个菌株中克隆了一个 BamH25 bp片片段，可以与除段，可以与除act 外的其它阻断株互补；外的其它阻断株互补；用基因克隆的方法，将用基因克隆的方法，将act+菌株中相当大的菌株中相当大的DNA片段片段(1530 kb)克隆到载体克隆到载体pJJ922上，组建成重组质粒上，组建成重组质粒pJJ2303，它能互补所有，它能互补所有7组组act-突变株，并能使不产突变株，并能使不产生任何一类多酮肽抗菌素的小小链霉菌合成放线紫红生任何一类多酮肽抗菌素的小小链霉菌合成放线紫红素。这个片段显然是放线紫红素生物合成全部基因组素。这个片段显然是放线紫红素生

26、物合成全部基因组成的基因簇。成的基因簇。放线紫红素阻断突变株之间的互补测验放线紫红素阻断突变株之间的互补测验放线紫红素阻断突变株之间的互补测验放线紫红素阻断突变株之间的互补测验前体 中间产物2中间产物14中间产物15中间产物1放线紫红素actactact act actact 无中间产物无中间产物无中间产物无中间产物 2 2 2 2act act act act act act 无无无无15151515无紫红素无紫红素无紫红素无紫红素2 2、克隆抗生素生物合成基、克隆抗生素生物合成基因的策略和方法因的策略和方法 突变克隆法突变克隆法突变克隆法突变克隆法 如果生物合成基因簇如果生物合成基因簇如果

27、生物合成基因簇如果生物合成基因簇DNADNADNADNA的酶切片段通过同源的酶切片段通过同源的酶切片段通过同源的酶切片段通过同源重组插入诱发基因簇相关合成步骤的阻断突变，这个酶切片段一定重组插入诱发基因簇相关合成步骤的阻断突变，这个酶切片段一定重组插入诱发基因簇相关合成步骤的阻断突变，这个酶切片段一定重组插入诱发基因簇相关合成步骤的阻断突变，这个酶切片段一定含有这个合成步骤的相关基因。含有这个合成步骤的相关基因。含有这个合成步骤的相关基因。含有这个合成步骤的相关基因。小小链霉菌小小链霉菌小小链霉菌小小链霉菌(S.parvullusS.parvullus)菌株菌株菌株菌株ATCC12434ATC

28、C12434的质粒的质粒的质粒的质粒SCP1SCP1(含次甲霉含次甲霉含次甲霉含次甲霉素素素素A A生物合成基因簇生物合成基因簇生物合成基因簇生物合成基因簇)的的的的DNADNA的的的的Pst Pst 片段插入到片段插入到片段插入到片段插入到 C31KC400 C31KC400(attP attP)中，形成质粒中，形成质粒中，形成质粒中，形成质粒SCP1SCP1的的的的gDNAgDNA文库；文库；文库；文库；转染变青链霉菌转染变青链霉菌转染变青链霉菌转染变青链霉菌66(66(S.lividans S.lividans)，把噬菌斑影印到变青链霉菌，把噬菌斑影印到变青链霉菌，把噬菌斑影印到变青链霉

29、菌，把噬菌斑影印到变青链霉菌(SCP1(SCP1+)的菌膜上，用的菌膜上，用的菌膜上，用的菌膜上，用 C31KC400C31KC400的的的的紫霉素抗性选择溶源菌；紫霉素抗性选择溶源菌；紫霉素抗性选择溶源菌；紫霉素抗性选择溶源菌；从溶源菌中选择次甲霉素生物合成阻断突变株，分析表明这些从溶源菌中选择次甲霉素生物合成阻断突变株，分析表明这些从溶源菌中选择次甲霉素生物合成阻断突变株，分析表明这些从溶源菌中选择次甲霉素生物合成阻断突变株，分析表明这些阻断突变株都含有来自阻断突变株都含有来自阻断突变株都含有来自阻断突变株都含有来自 C31KC400C31KC400的的的的PstPstDNADNA片段片段

30、片段片段;突变分析结果：突变分析结果：突变分析结果：突变分析结果：SCP1SCP1上至少有上至少有上至少有上至少有17 kb DNA17 kb DNA参与次甲霉素生物合参与次甲霉素生物合参与次甲霉素生物合参与次甲霉素生物合成，其中两个转录单位分别至少有两个次甲霉素生物合成基因成，其中两个转录单位分别至少有两个次甲霉素生物合成基因成，其中两个转录单位分别至少有两个次甲霉素生物合成基因成，其中两个转录单位分别至少有两个次甲霉素生物合成基因簇成员；簇成员；簇成员；簇成员；【突变克隆法原理图解突变克隆法原理图解】1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6片段克隆到噬菌体或片段克隆到噬菌体或片段克隆

31、到噬菌体或片段克隆到噬菌体或整合性质粒中，以同整合性质粒中，以同整合性质粒中，以同整合性质粒中，以同源性重组方式插入相源性重组方式插入相源性重组方式插入相源性重组方式插入相应的基因中。应的基因中。应的基因中。应的基因中。2255无阻断无阻断无阻断无阻断?阻断阻断阻断阻断2 2、克隆抗生素生物合成、克隆抗生素生物合成基因的策略和方法基因的策略和方法 直接克隆法直接克隆法直接克隆法直接克隆法 抗生素生物合成基因成簇存在，总长度抗生素生物合成基因成簇存在，总长度抗生素生物合成基因成簇存在，总长度抗生素生物合成基因成簇存在，总长度30 kb30 kb30 kb30 kb，成套克隆基因簇是可能的。，成套

32、克隆基因簇是可能的。，成套克隆基因簇是可能的。，成套克隆基因簇是可能的。头霉素头霉素头霉素头霉素C C C C(Cephamycin C)(Cephamycin C)(Cephamycin C)(Cephamycin C)是牲畜链霉菌表达的是牲畜链霉菌表达的是牲畜链霉菌表达的是牲畜链霉菌表达的 -内内内内酰胺类酰胺类酰胺类酰胺类抗生素；抗生素；抗生素；抗生素；PanlabsPanlabs公司公司公司公司将牲畜链霉菌总将牲畜链霉菌总将牲畜链霉菌总将牲畜链霉菌总DNADNADNADNA的的的的2020202040 kb40 kb40 kb40 kb的的的的Bgl Bgl Bgl Bgl 部分消化片

33、段克隆到质粒部分消化片段克隆到质粒部分消化片段克隆到质粒部分消化片段克隆到质粒 pIJ943 pIJ943 pIJ943 pIJ943中，转化中，转化中，转化中，转化变青链霉菌变青链霉菌变青链霉菌变青链霉菌1326132613261326；以不产黑色素、有硫链丝菌素以不产黑色素、有硫链丝菌素以不产黑色素、有硫链丝菌素以不产黑色素、有硫链丝菌素(Thiostrepton)(Thiostrepton)(Thiostrepton)(Thiostrepton)抗性抗性抗性抗性(ts ts ts ts r r r r 为为为为pIJ943pIJ943pIJ943pIJ943的选择标记的选择标记的选择标记

34、的选择标记)确定转化子；确定转化子；确定转化子；确定转化子；直接克隆法直接克隆法直接克隆法直接克隆法 抗生素生物合成基因成簇存在，总长度抗生素生物合成基因成簇存在，总长度抗生素生物合成基因成簇存在，总长度抗生素生物合成基因成簇存在，总长度30 kb30 kb30 kb30 kb，成套克隆基因簇是可能的。，成套克隆基因簇是可能的。，成套克隆基因簇是可能的。，成套克隆基因簇是可能的。在固体培养基上用在固体培养基上用在固体培养基上用在固体培养基上用Comamonas terrigena Comamonas terrigena(土生丛毛土生丛毛土生丛毛土生丛毛单胞菌单胞菌单胞菌单胞菌)直接筛选抗菌活性

35、直接筛选抗菌活性直接筛选抗菌活性直接筛选抗菌活性(头霉素头霉素头霉素头霉素C C表达表达表达表达)；从从从从30,00030,000多个转化子中得到一个有抗菌活性的转化多个转化子中得到一个有抗菌活性的转化多个转化子中得到一个有抗菌活性的转化多个转化子中得到一个有抗菌活性的转化子子子子PF15-1PF15-1，多项分析表明：抗菌活性来自头霉素，多项分析表明：抗菌活性来自头霉素，多项分析表明：抗菌活性来自头霉素，多项分析表明：抗菌活性来自头霉素C C；把把把把PF15-1PF15-1中的中的中的中的29.3 kb29.3 kb片段插入质粒片段插入质粒片段插入质粒片段插入质粒pIF900pIF900

36、，转化，转化，转化，转化变青链霉菌变青链霉菌变青链霉菌变青链霉菌13261326，转化子同样产生了头霉素，转化子同样产生了头霉素，转化子同样产生了头霉素，转化子同样产生了头霉素C C：29.3 29.3 kbkb含有头霉素含有头霉素含有头霉素含有头霉素C C生物合成基因簇。生物合成基因簇。生物合成基因簇。生物合成基因簇。2 2、克隆抗生素生物合成、克隆抗生素生物合成基因的策略和方法基因的策略和方法 抗生素抗性基因克隆法抗生素抗性基因克隆法抗生素抗性基因克隆法抗生素抗性基因克隆法 抗性基因常常是抗生素生抗性基因常常是抗生素生抗性基因常常是抗生素生抗性基因常常是抗生素生物合成基因簇的成员，可以做为

37、一个标记基因用于物合成基因簇的成员，可以做为一个标记基因用于物合成基因簇的成员，可以做为一个标记基因用于物合成基因簇的成员，可以做为一个标记基因用于克隆基因簇。克隆基因簇。克隆基因簇。克隆基因簇。抗生素抗性基因可能是抗生素合成基因簇的一部分。抗生素抗性基因可能是抗生素合成基因簇的一部分。抗生素抗性基因可能是抗生素合成基因簇的一部分。抗生素抗性基因可能是抗生素合成基因簇的一部分。在吸在吸在吸在吸水链霉菌水链霉菌水链霉菌水链霉菌(S S S SHydroscopicusHydroscopicusHydroscopicusHydroscopicus)中，与双丙氨磷中，与双丙氨磷中，与双丙氨磷中，与双

38、丙氨磷(bialaphos)(bialaphos)(bialaphos)(bialaphos)合成合成合成合成基因紧密连锁的抗性基因基因紧密连锁的抗性基因基因紧密连锁的抗性基因基因紧密连锁的抗性基因bar bar bar bar 所编码的产物与所编码的产物与所编码的产物与所编码的产物与bialaphosbialaphosbialaphosbialaphos生物生物生物生物合成途径第合成途径第合成途径第合成途径第10101010步所需的乙酸基转移酶相同，步所需的乙酸基转移酶相同，步所需的乙酸基转移酶相同，步所需的乙酸基转移酶相同，bar bar bar bar 可能是可能是可能是可能是biala

39、phosbialaphosbialaphosbialaphos生物合成途径的一部分。生物合成途径的一部分。生物合成途径的一部分。生物合成途径的一部分。在非抗生素产生菌中，抗生素耐药基因的表达主在非抗生素产生菌中，抗生素耐药基因的表达主在非抗生素产生菌中，抗生素耐药基因的表达主在非抗生素产生菌中，抗生素耐药基因的表达主要是为了应对环境的抗生素压力，可以存在于质要是为了应对环境的抗生素压力，可以存在于质要是为了应对环境的抗生素压力，可以存在于质要是为了应对环境的抗生素压力，可以存在于质粒上。粒上。粒上。粒上。2 2 2 2、克隆抗生素生物合成基因的策略和方法、克隆抗生素生物合成基因的策略和方法、克

40、隆抗生素生物合成基因的策略和方法、克隆抗生素生物合成基因的策略和方法 抗生素抗性基因克隆法抗生素抗性基因克隆法抗生素抗性基因克隆法抗生素抗性基因克隆法 抗性基因常常是抗性基因常常是抗性基因常常是抗性基因常常是抗生素生物合成基因簇的成员，可以做为一抗生素生物合成基因簇的成员，可以做为一抗生素生物合成基因簇的成员，可以做为一抗生素生物合成基因簇的成员，可以做为一个标记基因用于克隆基因簇。个标记基因用于克隆基因簇。个标记基因用于克隆基因簇。个标记基因用于克隆基因簇。红霉素红霉素红霉素红霉素是红色糖多孢菌是红色糖多孢菌是红色糖多孢菌是红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea

41、Saccharopolyspora erythraea)产生的抗生素；产生的抗生素；产生的抗生素；产生的抗生素；用用用用MboMbo处理红色糖多孢菌处理红色糖多孢菌处理红色糖多孢菌处理红色糖多孢菌NRRLC2338NRRLC2338菌株菌株菌株菌株DNADNA，与穿梭往复粘粒与穿梭往复粘粒与穿梭往复粘粒与穿梭往复粘粒pKC462apKC462a重组，转导重组，转导重组，转导重组，转导E.coli E.coli SF8SF8；以含有以含有以含有以含有ery ery r r的质粒的质粒的质粒的质粒pIJ43pIJ43为探针，与转导子原位杂交；为探针，与转导子原位杂交；为探针，与转导子原位杂交；为探

42、针，与转导子原位杂交；分析表明：阳性转导子的分析表明：阳性转导子的分析表明：阳性转导子的分析表明：阳性转导子的pKC462apKC462a中携带中携带中携带中携带35 kb35 kb的插的插的插的插入片段；入片段；入片段；入片段；用这个片段转化变青链霉菌，转化子产红霉素。用这个片段转化变青链霉菌，转化子产红霉素。用这个片段转化变青链霉菌，转化子产红霉素。用这个片段转化变青链霉菌，转化子产红霉素。2 2、克隆抗生素生物合成、克隆抗生素生物合成基因的策略和方法基因的策略和方法 寡核苷酸探针法寡核苷酸探针法 链霉菌编码抗生素生物链霉菌编码抗生素生物链霉菌编码抗生素生物链霉菌编码抗生素生物合成基因合成

43、基因合成基因合成基因ORFORFORFORF顺序的密码子的第顺序的密码子的第顺序的密码子的第顺序的密码子的第3 3 3 3位碱基多位碱基多位碱基多位碱基多达达达达90909090为为为为G GG G或或或或C C C C，是探针设计的根据。，是探针设计的根据。，是探针设计的根据。，是探针设计的根据。泰乐星泰乐星(tylosin)(tylosin)是由弗氏链霉菌是由弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)产生的一种大环内酯产生的一种大环内酯类抗生素，临床上主要作为治疗鸡慢性呼类抗生素，临床上主要作为治疗鸡慢性呼吸道感染和鸡霍乱等常见病，对由病毒引吸道感染和鸡霍乱等常见病，对由病毒引

44、起的猪气喘和猪肺炎有特效。起的猪气喘和猪肺炎有特效。Eli LillyEli Lilly公司首先根据催化泰乐星生物合成的最后一公司首先根据催化泰乐星生物合成的最后一公司首先根据催化泰乐星生物合成的最后一公司首先根据催化泰乐星生物合成的最后一个步骤的个步骤的个步骤的个步骤的 大环菌素大环菌素大环菌素大环菌素-O-O-甲基转移酶甲基转移酶甲基转移酶甲基转移酶(Macrocin-0-(Macrocin-0-methyltransferase)methyltransferase)氨基端氨基端氨基端氨基端3535个氨基酸顺序，按照密码个氨基酸顺序，按照密码个氨基酸顺序，按照密码个氨基酸顺序，按照密码子偏

45、爱原则合成了子偏爱原则合成了子偏爱原则合成了子偏爱原则合成了44 bp44 bp的寡核苷酸探针；的寡核苷酸探针；的寡核苷酸探针；的寡核苷酸探针；用用用用 Charon4Charon4构建弗氏链霉菌的构建弗氏链霉菌的构建弗氏链霉菌的构建弗氏链霉菌的gDNAgDNA文库，与探针逐文库，与探针逐文库，与探针逐文库，与探针逐一杂交，一杂交，一杂交，一杂交，1010个重叠克隆共涉及个重叠克隆共涉及个重叠克隆共涉及个重叠克隆共涉及27 kb DNA27 kb DNA；与用粘粒与用粘粒与用粘粒与用粘粒pKC462apKC462a构建的构建的构建的构建的弗氏链霉菌的弗氏链霉菌的弗氏链霉菌的弗氏链霉菌的gDNA

46、gDNA文库杂文库杂文库杂文库杂交，有交，有交，有交，有4 4个重叠克隆共包含个重叠克隆共包含个重叠克隆共包含个重叠克隆共包含58 kb58 kb片段，其中包括前面的片段，其中包括前面的片段，其中包括前面的片段，其中包括前面的27 kb27 kb片段；片段；片段；片段；进一步分析表明，进一步分析表明，进一步分析表明，进一步分析表明，58 kb DNA58 kb DNA中编码中编码中编码中编码TylosinTylosin生物合成生物合成生物合成生物合成全部基因。全部基因。全部基因。全部基因。2 2 2 2、克隆抗生素生物合成基因的策略和方法、克隆抗生素生物合成基因的策略和方法、克隆抗生素生物合成

47、基因的策略和方法、克隆抗生素生物合成基因的策略和方法 寡核苷酸探针法寡核苷酸探针法寡核苷酸探针法寡核苷酸探针法 链霉菌编码抗生素生物合成基因链霉菌编码抗生素生物合成基因链霉菌编码抗生素生物合成基因链霉菌编码抗生素生物合成基因ORFORFORFORF顺序的顺序的顺序的顺序的密码子的第密码子的第密码子的第密码子的第3 3 3 3位碱基多达位碱基多达位碱基多达位碱基多达90909090为为为为G GG G或或或或C C C C，是探针设计的根据，是探针设计的根据，是探针设计的根据，是探针设计的根据。2 2、克隆抗生素生物合成、克隆抗生素生物合成基因的策略和方法基因的策略和方法 同源基因杂交法同源基因

48、杂交法同源基因杂交法同源基因杂交法 以已克隆的抗生素生物合成基因以已克隆的抗生素生物合成基因以已克隆的抗生素生物合成基因以已克隆的抗生素生物合成基因片段顺序为探针，探察同源性基因。片段顺序为探针，探察同源性基因。片段顺序为探针，探察同源性基因。片段顺序为探针，探察同源性基因。-内酰胺类内酰胺类内酰胺类内酰胺类：分子结构中含有：分子结构中含有：分子结构中含有：分子结构中含有-内酰胺，包括青霉素类内酰胺，包括青霉素类内酰胺，包括青霉素类内酰胺，包括青霉素类和头孢菌素类。和头孢菌素类。和头孢菌素类。和头孢菌素类。氨基糖甙类氨基糖甙类氨基糖甙类氨基糖甙类：由氨基己糖的衍生物组成，包括链霉素、：由氨基己

49、糖的衍生物组成，包括链霉素、：由氨基己糖的衍生物组成，包括链霉素、：由氨基己糖的衍生物组成，包括链霉素、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、小诺霉素等。庆大霉素、卡那霉素、新霉素、小诺霉素等。庆大霉素、卡那霉素、新霉素、小诺霉素等。庆大霉素、卡那霉素、新霉素、小诺霉素等。四环类四环类四环类四环类：都具有四个缩合苯环，包括四环素、土霉素、：都具有四个缩合苯环，包括四环素、土霉素、：都具有四个缩合苯环，包括四环素、土霉素、：都具有四个缩合苯环，包括四环素、土霉素、金霉素及强力霉素等。金霉素及强力霉素等。金霉素及强力霉素等。金霉素及强力霉素等。氯霉素类氯霉素类氯霉素类氯霉素类：含二氯乙酰胺，包括氯霉素、甲砜

50、霉素等。：含二氯乙酰胺，包括氯霉素、甲砜霉素等。：含二氯乙酰胺，包括氯霉素、甲砜霉素等。：含二氯乙酰胺，包括氯霉素、甲砜霉素等。大环内脂类大环内脂类大环内脂类大环内脂类：由一个或多个单糖组成并与碳链一起形成：由一个或多个单糖组成并与碳链一起形成：由一个或多个单糖组成并与碳链一起形成：由一个或多个单糖组成并与碳链一起形成一个巨大的芳香内酯环化合物，有红霉素、麦迪霉素等。一个巨大的芳香内酯环化合物，有红霉素、麦迪霉素等。一个巨大的芳香内酯环化合物，有红霉素、麦迪霉素等。一个巨大的芳香内酯环化合物，有红霉素、麦迪霉素等。化学结构类似的抗生素，其生物合成途径和每个合成环节化学结构类似的抗生素，其生物合