《动物细胞工程》课件.ppt

《《动物细胞工程》课件.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《《动物细胞工程》课件.ppt（35页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、2.2 动物细胞工程动物细胞工程细胞工程的基本技术植物植物细胞工程细胞工程动物动物细胞工程细胞工程植物组织培养技术植物体细胞杂交技术动物细胞核移植技术动物细胞融合技术单克隆抗体技术动物细胞培养技术(基础)从动物机体中取出相关组织，将它们分散成单从动物机体中取出相关组织，将它们分散成单个细胞，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞生个细胞，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。长和增殖。一、动物细胞培养一、动物细胞培养1 1、动物细胞培养的概念、动物细胞培养的概念动动物物细细胞胞培培养养技技术术动动物物细细胞胞培培养养技技术术思 考1、动物细胞培养取材时，一般是取胚胎组织或幼龄动物的组织或器

2、官，请解释原因？2、为什么动物细胞培养过程需将组织分散成单个细胞？3、如何将动物组织分散成单个的细胞呢？4、如何理解原代培养和传代培养？5、传代培养的细胞能一直传代下去吗？为什么？6、动物细胞培养需满足哪些条件？7、动物细胞培养有哪些应用？动物细胞培养过程动物细胞培养过程1、选材：、选材：动物胚胎或幼龄动物的组织、器官动物胚胎或幼龄动物的组织、器官它们细胞增殖能力强，分裂旺盛，分化它们细胞增殖能力强，分裂旺盛，分化程度低，容易培养。程度低，容易培养。2.2.将组织细胞分散成单个细胞将组织细胞分散成单个细胞v将组织块剪碎，用胰蛋白酶或胶原蛋白酶将组织块剪碎，用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理一段时间，这

3、样组织就会分三成单个细处理一段时间，这样组织就会分三成单个细胞。胞。思考：为什么培养前要将组织细胞分散成单思考：为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？个细胞？单个细胞容易和周围环境进行物质交换单个细胞容易和周围环境进行物质交换获得获得营养物质、氧气等，排出代谢废物；营养物质、氧气等，排出代谢废物；分散成单个细胞培养能使细胞水平操作的其他技分散成单个细胞培养能使细胞水平操作的其他技术得以实现术得以实现 。1.1.进行动物细胞传代培养时用胰蛋白酶分进行动物细胞传代培养时用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要是什么成分？散细胞，说明细胞间的物质主要是什么成分？用胃蛋白酶行吗？用胃蛋白酶行吗？用胰

4、蛋白酶分散细胞用胰蛋白酶分散细胞，说明说明细胞间的物质主要是细胞间的物质主要是蛋白质。蛋白质。不能用胃蛋白代替不能用胃蛋白代替因为两者的最适因为两者的最适pHpH不同，动物细胞培养适宜的不同，动物细胞培养适宜的pHpH为为，此环境下胃蛋白酶（，此环境下胃蛋白酶（最适最适pH）没有活性，）没有活性，而胰蛋白酶而胰蛋白酶(最适最适pH 7.2-8.4)7.2-8.4)的活性较高。的活性较高。胰蛋白酶真的不会把细胞消化掉吗？为什么？胰蛋白酶真的不会把细胞消化掉吗？为什么？胰蛋白酶除了可以消化细胞间的蛋白外，长时间的胰蛋白酶除了可以消化细胞间的蛋白外，长时间的作用也会消化细胞膜蛋白，对细胞有损伤作用，

5、因作用也会消化细胞膜蛋白，对细胞有损伤作用，因此此必须控制好胰蛋白酶的消化时间必须控制好胰蛋白酶的消化时间。动动动动物物物物组组组组织织织织单单单单个个个个细细细细胞胞胞胞细细细细胞胞胞胞悬悬悬悬液液液液贴贴贴贴壁壁壁壁生生生生长长长长分分分分瓶瓶瓶瓶培培培培养养养养10代代细细胞胞50代代细细胞胞不不死死细细胞胞原代培养原代培养原代培养原代培养传代培养传代培养传代培养传代培养胰蛋白酶胰蛋白酶胰蛋白酶胰蛋白酶剪碎剪碎剪碎剪碎加培养液加培养液加培养液加培养液接触抑制接触抑制接触抑制接触抑制少数癌变少数癌变少数癌变少数癌变少数少数少数少数3.3.配制细胞悬液，进行原代培养及传代培养配制细胞悬液，进

6、行原代培养及传代培养l1 1、细胞贴壁：、细胞贴壁：悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。称为细胞贴壁。要求：要求：培养瓶或培养皿的内表面光滑、无毒、培养瓶或培养皿的内表面光滑、无毒、易于贴附。易于贴附。2 2、细胞的接触抑制：、细胞的接触抑制：当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制的接触抑制。细胞细胞悬浮悬浮液液1010代代细胞细胞5050代代细胞细胞无限传无限传代代原代培养原代培养传代培养传代培养4.4.如何界定原代培养和传

7、代培养？如何界定原代培养和传代培养？随细胞增多，细胞就会停止分裂增殖随细胞增多，细胞就会停止分裂增殖原代培养原代培养原代培养原代培养:将动物组织消化后的初次培养。将动物组织消化后的初次培养。将动物组织消化后的初次培养。将动物组织消化后的初次培养。传代培养传代培养传代培养传代培养:对贴满瓶壁的细胞用胰蛋白酶处理，然后再分瓶继对贴满瓶壁的细胞用胰蛋白酶处理，然后再分瓶继对贴满瓶壁的细胞用胰蛋白酶处理，然后再分瓶继对贴满瓶壁的细胞用胰蛋白酶处理，然后再分瓶继续培养。续培养。续培养。续培养。传代培养传代培养动物胚胎或幼龄动动物胚胎或幼龄动物的组织、器官物的组织、器官细胞悬浮液细胞悬浮液胰蛋白酶胰蛋白酶

8、（分解弹性纤维）（分解弹性纤维）10代细胞代细胞原代培养原代培养50代细胞代细胞细胞株细胞株无限传代无限传代细胞系细胞系遗传物质遗传物质未改变未改变遗传物质遗传物质改变改变动物细胞培养过程动物细胞培养过程 多细胞动物和人体的细胞都生活在内环境中，多细胞动物和人体的细胞都生活在内环境中，根据你所学的内环境的知识，思考以下问题：根据你所学的内环境的知识，思考以下问题：1.1.体外培养细胞时需要提供哪些物质？体外培养细胞时需要提供哪些物质？2.2.体外培养的细胞需要什么样的环境条件？体外培养的细胞需要什么样的环境条件？充足营养（糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元充足营养（糖、氨基酸、促生长因子、

9、无机盐、微量元素等合成成分及血清、血浆等天然成分。）素等合成成分及血清、血浆等天然成分。）适宜温度、适宜温度、PHPH和气体环境；无菌无毒环境和气体环境；无菌无毒环境4、动物细胞培养的条件（抗生素，更换培养液）无菌、无毒营养：与体内基本相同温度和PH气体环境（95%空气+5%CO2），7.2-7.4）（合成培养基）l1 1、大规模的生产生物制品。、大规模的生产生物制品。l2 2、培养的动物细胞作为基因工程的受体、培养的动物细胞作为基因工程的受体细胞。细胞。l3 3、检测判断物质的毒性。、检测判断物质的毒性。l4 4、培养正常或各种病变的细胞，用于生、培养正常或各种病变的细胞，用于生理、病理、药

10、理等方面的研究，如用于理、病理、药理等方面的研究，如用于 等，为等，为 及其及其他疾病提供理论依据。他疾病提供理论依据。5.5.动物细胞培养动物细胞培养应用：应用：筛选抗癌药物筛选抗癌药物治疗和预防癌症治疗和预防癌症植物组织培养和动物细胞培养的比较植物组织培养和动物细胞培养的比较比较项目比较项目植物组织培养植物组织培养动物细胞培养动物细胞培养原理原理细胞的全能性细胞的全能性细胞增殖细胞增殖培养基性质培养基性质固体培养基固体培养基液体培养基液体培养基培养基特有成分培养基特有成分蔗糖蔗糖 植物激素植物激素葡萄糖葡萄糖 动物血清动物血清培养结果培养结果植物体植物体细胞细胞培养目的培养目的快速繁殖、快

11、速繁殖、培育无病毒植株培育无病毒植株获得细胞获得细胞或细胞分泌蛋白或细胞分泌蛋白二二.动物细胞动物细胞核移植技术和克隆动物核移植技术和克隆动物 将动物的一个细胞核，移入一个已经去掉细胞将动物的一个细胞核，移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成为一个新的胚核的卵母细胞中，使其重组并发育成为一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育为动物个体胎，这个新的胚胎最终发育为动物个体（克隆动物）（克隆动物）。分分类类胚胎细胞核移植胚胎细胞核移植：体细胞核移植体细胞核移植：细胞分化程度低，细胞分化程度低，恢复全能性容易；恢复全能性容易；细胞分化程度细胞分化程度高，高，恢复全能性不容易恢复全能性不容易1

12、.1.动物细胞动物细胞核移植概念：核移植概念：（难度高难度高）(二二)、体细胞核移植的过程：、体细胞核移植的过程：请看教材请看教材P48P48图图2-212-21思考：思考：1.1.核移植的受体细胞是什么？处在什么时期？用此细核移植的受体细胞是什么？处在什么时期？用此细胞作为受体细胞有什么好处？胞作为受体细胞有什么好处？2.2.通过什么手段激活受体细胞，构建重组胚胎？通过什么手段激活受体细胞，构建重组胚胎？M M中期卵母细胞中期卵母细胞诱导方法：物理或化学方法激活受体细胞，完成诱导方法：物理或化学方法激活受体细胞，完成细胞分裂和发育进程。细胞分裂和发育进程。卵母细胞体积大，便于操作；含有营养物

13、质丰富，卵母细胞体积大，便于操作；含有营养物质丰富，提供早期胚胎发育所需的营养；含有激活细胞核体提供早期胚胎发育所需的营养；含有激活细胞核体现全能性的物质。现全能性的物质。电电激激激激处处理使供理使供理使供理使供体核体核体核体核进进入受体入受体入受体入受体卵母卵母卵母卵母细细胞构建胞构建胞构建胞构建重重重重组组胚胎胚胎胚胎胚胎卵母卵母卵母卵母细细胞采集、培养胞采集、培养胞采集、培养胞采集、培养MM期期期期卵母卵母卵母卵母细细胞胞胞胞供体牛供体牛供体牛供体牛供体供体供体供体细细胞注入胞注入胞注入胞注入去核卵母去核卵母去核卵母去核卵母细细胞胞胞胞代孕母牛代孕母牛代孕母牛代孕母牛克隆牛克隆牛克隆牛克

14、隆牛体体体体细细胞培养胞培养胞培养胞培养去核卵母去核卵母去核卵母去核卵母细细胞胞胞胞去核去核去核去核胚胎胚胎胚胎胚胎移植移植移植移植体细胞核移植过程体细胞核移植过程（体细胞克隆动物）（体细胞克隆动物）、在体细胞的细胞核移植到受体卵母细胞之、在体细胞的细胞核移植到受体卵母细胞之前，为什么必须先去掉受体卵母细胞的核？前，为什么必须先去掉受体卵母细胞的核？为使核移植使核移植动物的物的遗传物物质全部来自有利用全部来自有利用价价值的的动物提供的物提供的细胞。胞。、用于核移植的供体细胞一般都选用传代、用于核移植的供体细胞一般都选用传代1010代以内的细胞，为什么？代以内的细胞，为什么？10代以内的代以内的

15、细胞一般保持正常二倍体的核型，胞一般保持正常二倍体的核型，未未发生突生突变思考题思考题3 3、体细胞核移植方法生产的克隆动物是对体细、体细胞核移植方法生产的克隆动物是对体细胞供体动物进行了胞供体动物进行了100%的复制吗？为什么？的复制吗？为什么？不是，克隆不是，克隆动物物绝大部分大部分DNA来自供体来自供体细胞胞核，但核外核，但核外还有少部分有少部分DNA（如（如线粒体粒体DNA）来自受体卵母）来自受体卵母细胞胞思考题思考题 1996 1996年，英国人年，英国人Ian Ian WilmutWilmut成功获得成功获得体细胞克隆体细胞克隆羊羊“多利多利”，这是世界上这是世界上第第一例利用成年

16、体细胞核获得一例利用成年体细胞核获得的克隆动物的克隆动物.277277次次乳乳腺腺细细胞胞核核移植实验；移植实验；获获得得2929个个发发育育为为8 8细胞的细胞的“胚胚”；1313头代孕母亲；头代孕母亲；19961996年年7 7月月5 5日日，羊羊羔羔6LL36LL3，被被命命名为名为“多莉多莉”。多多莉莉羊羊的的培培育育过过程程“多多莉莉羊羊”是是雄雄还还是是雌雌？是是否否符符合合孟孟德德尔尔遗遗传传？问题卵细卵细胞胞C母绵羊子宫母绵羊子宫母绵羊母绵羊母绵羊母绵羊乳腺细胞乳腺细胞卵细胞质卵细胞质细胞核细胞核细胞核移植胚胎移植胚胎移植早期胚胎早期胚胎多莉羊多莉羊分娩分娩卵裂卵裂融合后的卵细

17、胞融合后的卵细胞妊娠妊娠3.3.体细胞核移植技术的应用前景：体细胞核移植技术的应用前景：1.1.加速家畜遗传改良的加速家畜遗传改良的进程进程2.2.保护濒危物种保护濒危物种3.3.生产医用蛋白质及生产医用蛋白质及组织器官的移植组织器官的移植4.4.了解胚胎发育和衰老了解胚胎发育和衰老过程；过程；追踪研究疾病的发追踪研究疾病的发展过程和治疗疾病展过程和治疗疾病3 3、体细胞核移植技术存在的问题、体细胞核移植技术存在的问题 P50（1 1）成功率非常低）成功率非常低（2 2）克隆动物以表现早衰、生理缺陷等健康问）克隆动物以表现早衰、生理缺陷等健康问题题 成功率低，绝大多数克隆动物存在健康问成功率低

18、，绝大多数克隆动物存在健康问题并表现出遗传和生理缺陷：如体型过大，异题并表现出遗传和生理缺陷：如体型过大，异常肥胖，发育困难，脏器缺陷，免疫失调等。常肥胖，发育困难，脏器缺陷，免疫失调等。思考与探究思考与探究1.1.幼龄与老龄动物的组织细胞比较，分化程度低的幼龄与老龄动物的组织细胞比较，分化程度低的与分化程度高的组织细胞比较，哪一种更易于培养与分化程度高的组织细胞比较，哪一种更易于培养？思考一下，这是什么道理？思考一下，这是什么道理？细胞的衰老与动物机体的衰老有着密切的关细胞的衰老与动物机体的衰老有着密切的关系，细胞的增殖能力与供体的年龄有关，幼龄动系，细胞的增殖能力与供体的年龄有关，幼龄动物

19、细胞增殖能力强，有丝分裂旺盛，老龄动物则物细胞增殖能力强，有丝分裂旺盛，老龄动物则相反。相反。所以，所以，一般来说幼年动物的组织细胞比老年一般来说幼年动物的组织细胞比老年动物的组织细胞易于培养。动物的组织细胞易于培养。同样，同样，组织细胞的分化程度越低，则增殖能组织细胞的分化程度越低，则增殖能力越强，所以更容易培养力越强，所以更容易培养。思考与探究思考与探究2.2.动物细胞培养要经过脱分化的过程吗？为什么？动物细胞培养要经过脱分化的过程吗？为什么？动物细胞培养动物细胞培养不需不需经过脱分化过程。经过脱分化过程。因高度分化的动物细胞发育潜能变窄，失因高度分化的动物细胞发育潜能变窄，失去了发育成完

20、整个体的能力去了发育成完整个体的能力 要想使培养的动物细胞定向分化，通要想使培养的动物细胞定向分化，通常采用常采用定向诱导动物干细胞定向诱导动物干细胞，使其分化成，使其分化成所需要的组织或器官。所需要的组织或器官。年，美国威斯康星州的一个奶牛场有一头年，美国威斯康星州的一个奶牛场有一头名叫卢辛达（名叫卢辛达（LucindaLucinda）的奶牛，年产奶量为）的奶牛，年产奶量为30.8 t30.8 t，创造了世界奶牛产奶量最高新纪录。目，创造了世界奶牛产奶量最高新纪录。目前世界各国高产奶牛场奶牛，年平均产奶量一般前世界各国高产奶牛场奶牛，年平均产奶量一般为十几吨，而我国奶牛产奶量年平均水平仅为为

21、十几吨，而我国奶牛产奶量年平均水平仅为3 34 4 t t。（1 1）能利用体细胞核移植技术克隆高产奶牛卢辛）能利用体细胞核移植技术克隆高产奶牛卢辛达吗？请说明理由。达吗？请说明理由。可以。卢辛达的产奶量很高，有高产奶的遗传基础，可以。卢辛达的产奶量很高，有高产奶的遗传基础，利用卢辛达的体细胞克隆的奶牛其遗传物质基本上利用卢辛达的体细胞克隆的奶牛其遗传物质基本上全部来自该奶牛，其克隆牛具有高产的遗传基础，全部来自该奶牛，其克隆牛具有高产的遗传基础，如果精心培育和饲养，有可能在世界范围内推广，如果精心培育和饲养，有可能在世界范围内推广，克隆牛再与高产的公牛自然繁殖，可得到很多高产克隆牛再与高产的

22、公牛自然繁殖，可得到很多高产的后代，从而加快奶牛改良进程。的后代，从而加快奶牛改良进程。（2 2）如果将克隆高产奶牛卢辛达的任务交）如果将克隆高产奶牛卢辛达的任务交给你，你将如何对它进行克隆？给你，你将如何对它进行克隆？从卢辛达耳朵（也可用别的组织、器官，耳朵从卢辛达耳朵（也可用别的组织、器官，耳朵在活体上容易取）上剪取一小块组织，在体外在活体上容易取）上剪取一小块组织，在体外培养获得该组织（如软骨组织）的细胞。从屠培养获得该组织（如软骨组织）的细胞。从屠宰场取废弃的牛卵巢，抽取卵母细胞体外培养宰场取废弃的牛卵巢，抽取卵母细胞体外培养成熟。用显微针去除卵母细胞的核，再将耳细成熟。用显微针去除卵

23、母细胞的核，再将耳细胞注入卵母细胞，用电刺激方法使卵母细胞与胞注入卵母细胞，用电刺激方法使卵母细胞与体细胞融合，这时供体核就进入了受体卵母细体细胞融合，这时供体核就进入了受体卵母细胞，再用电刺激或化学物质激活注入了体细胞胞，再用电刺激或化学物质激活注入了体细胞核的卵母细胞，使其完成细胞分裂和发育过程。核的卵母细胞，使其完成细胞分裂和发育过程。核移植胚胎在体外短时间培养后，挑选正常卵核移植胚胎在体外短时间培养后，挑选正常卵裂的胚胎植入经同期发情处理的受体母牛体内。裂的胚胎植入经同期发情处理的受体母牛体内。4.4.体细胞核移植技术在研究和应用上还存体细胞核移植技术在研究和应用上还存在什么问题？请你

24、查阅资料，了解这方面在什么问题？请你查阅资料，了解这方面的前沿动态。的前沿动态。研究方面研究方面：克隆动物基因组重新编程的机制：克隆动物基因组重新编程的机制尚不清楚，克隆技术效率低，克隆动物畸形尚不清楚，克隆技术效率低，克隆动物畸形率高、死亡率高、易出现早衰等问题。这些率高、死亡率高、易出现早衰等问题。这些问题尚在研究中。问题尚在研究中。应用上：生产克隆动物费用昂贵，距大规模应用上：生产克隆动物费用昂贵，距大规模应用还有一定距离。应用还有一定距离。知识拓展知识拓展2 2.为什么动物细胞要分散成单个细胞培养？用酶消化的为什么动物细胞要分散成单个细胞培养？用酶消化的是什么物质？是什么物质？细胞原代

25、培养时可以分散成单个细胞培养，也可以用细胞细胞原代培养时可以分散成单个细胞培养，也可以用细胞群（团）、组织块培养，经传代培养后，最终都为细胞培群（团）、组织块培养，经传代培养后，最终都为细胞培养。养。分散成单个细胞、细胞群（团）后容易培养，细胞所需的分散成单个细胞、细胞群（团）后容易培养，细胞所需的营养容易供应，其代谢废物容易排出；而用大块组织培养营养容易供应，其代谢废物容易排出；而用大块组织培养时，内部细胞的营养供应和代谢废物的排出都较困难，因时，内部细胞的营养供应和代谢废物的排出都较困难，因此，这些细胞在体外长时间的生存和生长就较困难。同时，此，这些细胞在体外长时间的生存和生长就较困难。同

26、时，分散成单个细胞培养，可使得在细胞水平操作的其他技术分散成单个细胞培养，可使得在细胞水平操作的其他技术得以实现。得以实现。用酶消化的是细胞间基质，细胞间基质主要成分有胶原蛋用酶消化的是细胞间基质，细胞间基质主要成分有胶原蛋白、层粘连蛋白、纤粘连蛋白、弹性蛋白等成分。用蛋白白、层粘连蛋白、纤粘连蛋白、弹性蛋白等成分。用蛋白酶可使其消化，从而使细胞相互分离。酶可使其消化，从而使细胞相互分离。知识拓展知识拓展3 3.体细胞核移植技术为什么要选择体细胞核移植技术为什么要选择MM期的卵母细期的卵母细胞做受体细胞？胞做受体细胞？细胞核移植技术中能用作受体细胞的通常有细胞核移植技术中能用作受体细胞的通常有

27、MM期卵母细胞期卵母细胞和受精卵（合子）。早期核移植技术中常用受精卵，后来和受精卵（合子）。早期核移植技术中常用受精卵，后来基本上用基本上用MM期卵母细胞取代了受精卵，主要因为两者的细期卵母细胞取代了受精卵，主要因为两者的细胞质环境不同。有人认为重组需要的因子存在于胞质环境不同。有人认为重组需要的因子存在于MM期卵母期卵母细胞的胞质中，而在原核形成时这些因子已被降解或用光，细胞的胞质中，而在原核形成时这些因子已被降解或用光，因此，原核扩张后受精卵去核可引起胞质中重组因子缺乏。因此，原核扩张后受精卵去核可引起胞质中重组因子缺乏。成熟促进因子（成熟促进因子（MPFMPF）是卵母细胞细胞质中重要的胞

28、质影响）是卵母细胞细胞质中重要的胞质影响因子，因子，MPFMPF的活性在卵母细胞减数分裂的的活性在卵母细胞减数分裂的MIMI期和期和MM期达到期达到最高，受精或激活后，最高，受精或激活后，MPFMPF迅速灭活，因此，迅速灭活，因此，MM期卵母细期卵母细胞中胞中MPFMPF活性高，而受精卵中活性高，而受精卵中MPFMPF活性低。活性低。MPFMPF水平的高低可水平的高低可影响供体核染色质的状态和复制。影响供体核染色质的状态和复制。MM期卵母细胞细胞核、期卵母细胞细胞核、细胞质已成熟，而细胞质已成熟，而MIMI卵母细胞细胞核、细胞质尚未成熟，卵母细胞细胞核、细胞质尚未成熟，其细胞质不能支持胚胎的全程发育，因此，尽管其细胞质不能支持胚胎的全程发育，因此，尽管MIMI期卵母期卵母细胞细胞MPFMPF活性也高，但不能用作受体卵母细胞。活性也高，但不能用作受体卵母细胞。也有人认为用去核合子做受体时，可能由于合子去核时一也有人认为用去核合子做受体时，可能由于合子去核时一些早期发育必需的因子随原核的去除而被去掉了，而使去些早期发育必需的因子随原核的去除而被去掉了，而使去核受精卵缺乏发育能力。因此，目前广泛采用核受精卵缺乏发育能力。因此，目前广泛采用M M期卵母细期卵母细胞做受体。胞做受体。