核酶与抗体酶精选文档.ppt

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1、核酶与抗体酶本讲稿第一页，共四十五页核 酶（Ribozyme)l一、概述l二、剪接型核酶l三、剪切型核酶l四、核酶的应用l五、核酶技术面临的问题l六、脱氧核酶（deoxyribozyme)本讲稿第二页，共四十五页1、对酶及生物催化剂的认识的发展对酶及生物催化剂的认识的发展一、概 述生物催化剂生物催化剂（Biocatalyst）蛋白质类：天然酶蛋白质类：天然酶 enzyme 极端酶极端酶 extremozyme 抗体酶抗体酶 abzyme 生物工程酶生物工程酶其它：模拟酶其它：模拟酶核酸类核酸类:克隆酶克隆酶遗传修饰酶遗传修饰酶蛋白质工程新酶蛋白质工程新酶、RibozymeDeoxyribozy

2、me本讲稿第三页，共四十五页2、长期以来，人们认为只有某些蛋白质才有生物催化功能。但近些年研究发现，某些RNA分子也具有生物催化功能，被称为Ribozyme。1982年Cech等发现四膜虫细胞大核期间26SrRNA前体具有自我剪接功能，并于1986年证明其内含子L-19IVS具有多种催化功能。1984年Altman等发现RNaseP的核酸组分M1RNA具有该酶的活性，而该酶的蛋白质部分C5蛋白并无酶活性。Cech和Altman因发现Ribozyme而获得1989年度诺贝尔化学奖。本讲稿第四页，共四十五页l3、核酶作用的特点l 化学本质 RNAl 底物 RNA 肽键 -葡聚糖分支酶l 反应特异性

3、(专一性）碱基l 催化效率 低l 产物本讲稿第五页，共四十五页剪切型核酶剪接型核酶根据催化反应锤头核酶I内含子II内含子发夹核酶丁型肝炎病毒（HDV)核酶RNaseP4.核酶的分类本讲稿第六页，共四十五页二、剪接型核酶l剪接型核酶的作用机制是通过既剪有接的方式除去内含子（Intron).l剪接型核酶分类l1、I类内含子 2、II类内含子本讲稿第七页，共四十五页1.I类内含子的自我剪接(Self-splicing)l剪接机制剪接机制lL-19IVS在体外的多种酶活性在体外的多种酶活性l核酶是一种金属依赖酶核酶是一种金属依赖酶l结构与功能的关系结构与功能的关系l 引导序列：引导序列：IVS中的中的

4、6个嘌呤核苷酸序列个嘌呤核苷酸序列l 5CUCUCU3l 3GGGAGG5l G结合位点结合位点:IVS 中的中的 P7茎区茎区l 空间结构空间结构本讲稿第八页，共四十五页核酶是一种金属依赖酶l金属离子的作用金属离子的作用：l1、特异的结构作用，或参与活性部位的、特异的结构作用，或参与活性部位的 化学过程化学过程l2、促进、促进RNA的总体折叠的总体折叠l3、二价金属离子（如、二价金属离子（如Mg 2+）与底物活）与底物活性部位直接相互作用，参与过渡中间复性部位直接相互作用，参与过渡中间复合物的形成合物的形成本讲稿第九页，共四十五页2、类内含子的自我剪接l剪接机制l结构与功能的关系本讲稿第十页

5、，共四十五页三、剪切型核酶l1、自身催化剪切型RNAl 1、1 剪切机制l 1、2 结构与功能的关系l 锤头结构(Hammerhead)l 发夹结构(Hairpin)l 斧头结构(Axehead)l 假结样结构(Pseudoknot-like)l 1、3 影响核酶活性的因素本讲稿第十一页，共四十五页l2、异体催化剪切型RNAl 核糖核酸酶P(RNaseP)是内切核酸酶，是核糖核蛋白体复合物，能剪切所有tRNA前体的5端，除去多余的序列，形成3-OH 和 5-磷酸末端。l RNaseP由M1RNA和蛋白质亚基组成。l体外：M1RNA具催化作用l 蛋白质作为辅助因子 l体内：M1RNA和蛋白质对酶

6、活性都是必需的。l 2、1剪切机制 Mg 2+l 2、2结构与功能的关系 M1RNA 5端完整结构对维持催化活性是必需的。本讲稿第十二页，共四十五页 RNaseP可剪切前可剪切前体体5端端41nt,5端成熟。端成熟。不同不同tRNA的的 5 端没端没有顺序共同性，剪切有顺序共同性，剪切的准确性与剪切部位的准确性与剪切部位周围的核苷酸顺序无周围的核苷酸顺序无关，表明在关，表明在RNaseP的的组分内没有引导序组分内没有引导序列，列，RNaseP所识别所识别的是底物的的是底物的高级结构高级结构。RNaseP底物的二级结构底物的二级结构剪切位点剪切位点本讲稿第十三页，共四十五页本讲稿第十四页，共四十

7、五页1、转核苷酸作用转核苷酸作用 2CpCpCpCpC CpCpCpCpCpC +CpCpCpC2、水解作用水解作用 CpCpCpCpC CpCpCpC+pC3、转磷酸作用转磷酸作用CpCpCpCpCpCp+UpCpU CpCpCpCpCpC+UpCpUp4、去磷酸作用去磷酸作用 CpCpCpCpCp CpCpCpCpC+Pi5、限制性内切酶作用限制性内切酶作用 CpUpCpUpN +G CpUpCpU +GpN 本讲稿第十五页，共四十五页核酶在医学上的应用1、核酶抗肝炎病毒的研究 目前人们已进行了核酶抗甲型肝炎病毒（HAV)、乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）以及HDV作用的研究

8、。人工设计核酶多为锤头状结构，少部分是采用发夹状核酶。2、抗人类免疫缺陷病毒型（HIV-)核酶 1998年，美国加利福尼亚大学Wong-Staal等利用发夹核酶抑制HIV-基因表达，并率先进入临床期。3、抗肿瘤治疗 核酶能在特定位点准确有效地识别和切割肿瘤细胞的mRNA,抑制肿瘤基因的表达，达到治疗肿瘤的目的。本讲稿第十六页，共四十五页 五、核酶技术面临的问题五、核酶技术面临的问题1、核酶催化切割反应的可 逆性问题2、提高催化效率3、寻找合适载体将核酶高效、特异地导入靶细胞4、使核酶在细胞内有调控地高效表达5、增强核酶在细胞内的稳定性6、对宿主的损伤问题有待进一步考察本讲稿第十七页，共四十五页

9、六、脱氧核酶的研究1、体外选择技术筛选脱氧核酶分子脱氧核酶分子的体外选择是通过优先扩增事先固定在固相载体上的具有自我裂解功能的活性分子来实现的。通过这一技术已有两种具有RNA裂解活性的脱氧核酶被筛选出来。8-17，10-23。2、脱氧核酶催化特征 10-23裂解位点为嘌呤、嘧啶连接 双链稳定性越高，酶活性越高 结合臂的长度影响酶催化转换性 RNA-DNA 比 RNA-RNA 稳定性差。对Mg 2+,Zn 2+,Ca 2+,Mn 2+有依赖性 组氨酸，精氨酸促进催化活性 极强的切割特异性（单碱基错配即可大幅降低切割活性）本讲稿第十八页，共四十五页10-23型脱氧核酶作用机理型脱氧核酶作用机理RY

10、 RRNA substrate切割点切割点R=A or GY=C or Udeoxyribozyme 5 3 本讲稿第十九页，共四十五页手枪型脱氧核酶自我剪切作用机理手枪型脱氧核酶自我剪切作用机理茎茎II(催化部位催化部位)茎茎I(结合部位结合部位)53 3 C A切割点切割点102030 40本讲稿第二十页，共四十五页p 3 HO-Gp3 pP-GOHp P-G3HO 类内含子的剪接机制Mg 2+或Mn 2+GMP,GDP,GTP外显子外显子 内含子或居间序列内含子或居间序列（Intervening sequence,IVS)5本讲稿第二十一页，共四十五页p 2 HO-Ap p-A p3OH

11、pP-AHO 3类内含子的剪接机制Mg 2+套环的形成套环的形成53外显子连接外显子连接本讲稿第二十二页，共四十五页BAA5BBABAPCRPCR555StreptavidinColumnNaOHcofactor体外选择技术筛选具有自我裂解功能的DNA分子N50(DNA分子库）本讲稿第二十三页，共四十五页 类内含子二级结构通式类内含子二级结构通式保守序列保守序列G结合位点结合位点剪接部位剪接部位引导序列引导序列本讲稿第二十四页，共四十五页类内含子有一个保守的类内含子有一个保守的二级结构：二级结构：结构域结构域：两个保守内：两个保守内含子结构序列含子结构序列EBS1,EBS2与两个外显与两个外显

12、子结构序列子结构序列IBS1,IBS2互互相配对。相配对。结构域结构域：高度保守，：高度保守，催化活性必需。催化活性必需。结构域结构域：A 提供提供2-OH 类内含子二级结构模式类内含子二级结构模式5 3本讲稿第二十五页，共四十五页5个环和4个螺旋形成两个结构域剪切反应发生在底物识别序列GUC的5端两个内部环中的碱基及在螺旋区的G11和底物中的G+1都是酶发挥作用所必需的。53 发夹二级结构模型剪切位点本讲稿第二十六页，共四十五页HDV RNA斧头结构模式 三个碱基对的茎三个碱基对的茎需要二价阳离子，需要二价阳离子，产生产生5-OH和和 2,3-环磷酸环磷酸剪切部位剪切部位剪切部位剪切部位本讲

13、稿第二十七页，共四十五页 这类这类RNA进行自身进行自身催化的反应是只切不接。催化的反应是只切不接。特点特点：在：在 Mg 2+或其他二或其他二价金属离子存在下，在特价金属离子存在下，在特定的位点，自我剪切，产定的位点，自我剪切，产生生5-OH 和和2，3-环磷酸环磷酸二酯末端二酯末端。剪剪 切切 机机 制制核酶自身剪切反应核酶自身剪切反应本讲稿第二十八页，共四十五页 mRNA剪接过程剪接过程 mRNA剪接反应是在剪接反应是在剪接体（剪接体（splicesome)上上进行的进行的.5种种snRNA 剪剪接体接体 50多蛋白质多蛋白质本讲稿第二十九页，共四十五页锤头结构的锤头结构的 五种类型五种

14、类型R示酶，示酶，S示底物，箭头示剪切位点示底物，箭头示剪切位点本讲稿第三十页，共四十五页 建议的建议的L19 RNA催化机理催化机理本讲稿第三十一页，共四十五页锤头型核酶对切割位点的识别位锤头型核酶对切割位点的识别位点遵守点遵守NHH规则（规则（N代表任意核代表任意核苷酸，苷酸，H代表代表A,U或或C）。）。催化过催化过程需要二价金属离子参与。程需要二价金属离子参与。单金属离子催化单金属离子催化双金属离子催化双金属离子催化 本讲稿第三十二页，共四十五页本讲稿第三十三页，共四十五页锤头型核酶的二级结构 和空间立体结构示意图三个双螺旋区13个核苷酸残基保守序列剪切反应在右上方GUX序列的3端自动

15、发生本讲稿第三十四页，共四十五页UCUAAAIVSGUAAPre-rRNAUCU A AAGUAAUCUoH35GAAAGUAAUCUUAA5GAAAGOH 3 G-IVSL-19IVS19nt53rRNA535pGOH353四膜虫rRNA前体自我剪接反应本讲稿第三十五页，共四十五页CCCUCUOP+HOG 3OAoooCCCUCUOPOAoO GCCCUCUOH+P-oGoAoo 过渡态本讲稿第三十六页，共四十五页CCCUCUOPOAoO GoCCCUCUOPOAoO GMg 2+Mg 2+o过渡态 金属离子催化本讲稿第三十七页，共四十五页本讲稿第三十八页，共四十五页锤头（Hammerhea

16、d)结构l二级结构模型l锤头二级结构编号l锤头结构的类型l锤头核酶的催化反应机制本讲稿第三十九页，共四十五页17位（位（X）的核苷酸残基的核苷酸残基多数是多数是C,不能是不能是U,G.7位核苷酸残基的置换不会位核苷酸残基的置换不会对酶活性产生很大影响对酶活性产生很大影响锤头二级结构编号锤头二级结构编号7位核苷酸位核苷酸17位核苷酸本讲稿第四十页，共四十五页发夹（hairpin）结构l 发夹核酶发现于三种不同植物RNA病毒，即烟草环点病毒，菊苣黄色斑点病毒型和筷子芥花叶病毒。三种发夹核酶分别是这些RNA病毒卫星RNA的负链，英文缩写分别是sTRSV,sCYMVT,sARMV,均为单链RNA。l

17、发夹核酶结构模型l 发夹核酶催化机制 金属离子在催化反应 中起结构作用，其剪切活性比锤头结构核酶高。本讲稿第四十一页，共四十五页GUACGGCCGGUGCCGGCUGGGGCAUUCCGAGGGGAC CAAGUAAUGGCUCCCCUGcCGGGUCCAGCCU U C C G C C UCAGGUAAGCG35剪切位点 HDV 核酶假结样结构L3L4J1/2 J1/4J2/4四个螺旋区，三个连接区，两个环活性中心区：J1/4,J2/4,L3剪切位点：688/689本讲稿第四十二页，共四十五页影响核酶活性的因素l1、pH值对活性的影响值对活性的影响 pH70 -7 5 时核酶活性最高。时核酶

18、活性最高。l2、二价金属阳离子对活性的影响、二价金属阳离子对活性的影响 Mg 2+Mn 2+l3、抗生素对活性的影响、抗生素对活性的影响 大多大多数为抑制效应数为抑制效应l4、变形剂对活性的影响、变形剂对活性的影响l5、温度对活性的影响、温度对活性的影响 在在65范围内随温度升高而增加，范围内随温度升高而增加，37 时均有适宜的时均有适宜的活性。活性。本讲稿第四十三页，共四十五页本讲稿第四十四页，共四十五页四、核酶的应用一、在医学领域中的应用：2.免疫源性低，很少引起免疫反应。3.针对锤头核酶而言，催化结构域小，既可作为转基因表达产物，也可以直接以人工合成的寡核苷酸形式在体内转运。1.通过识别特定位点而抑制目标基因的表达，抑制效率高，专一性强。二、在其他领域的应用防治动、植物 病毒侵害：马铃薯纺锤形块茎类病毒负链的多价核酶构建，马铃薯卷叶病毒复制酶基因负链的突变核酶的克隆等本讲稿第四十五页，共四十五页