第01章 细胞生物学的研究方法.ppt

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1、第二章第二章第二章第二章 细胞生物学的研究方法细胞生物学的研究方法细胞生物学的研究方法细胞生物学的研究方法Chapter 2 How cells are studiedChapter 2 How cells are studied第四类研究方法技术第四类研究方法技术第三类研究方法第三类研究方法第二类研究方法第二类研究方法CellV生化化学分析技术生化化学分析技术细胞工程技术细胞工程技术细胞生理学技术细胞生理学技术第一类研究方法第一类研究方法形态观察技术形态观察技术第一节第一节 形态观察技术形态观察技术普通光镜普通光镜普通光镜普通光镜特殊光镜特殊光镜特殊光镜特殊光镜形态观察形态观察扫描式电子显微

2、镜扫描式电子显微镜扫描式电子显微镜扫描式电子显微镜扫描隧道电子显微镜扫描隧道电子显微镜扫描隧道电子显微镜扫描隧道电子显微镜透射式电子显微镜透射式电子显微镜透射式电子显微镜透射式电子显微镜冰冻蚀刻技术冰冻蚀刻技术冰冻蚀刻技术冰冻蚀刻技术紫外光显微镜紫外光显微镜紫外光显微镜紫外光显微镜暗视野显微镜暗视野显微镜暗视野显微镜暗视野显微镜相差显微镜相差显微镜相差显微镜相差显微镜微分干涉差显微镜微分干涉差显微镜微分干涉差显微镜微分干涉差显微镜荧光显微镜荧光显微镜荧光显微镜荧光显微镜激光共聚焦显微镜激光共聚焦显微镜激光共聚焦显微镜激光共聚焦显微镜光学显微镜光学显微镜光学显微镜光学显微镜电子显微镜电子显微镜电

3、子显微镜电子显微镜一、光学显微镜一、光学显微镜第一节第一节 形态观察技术形态观察技术目镜物镜集光器载物台光源2 2 图像图像样品样品光线光线聚光器聚光器物镜物镜1.1.紫外光显微镜紫外光显微镜紫外光显微镜紫外光显微镜紫紫外外线线显显微微镜镜以以紫紫外外线线(波波长长介介于于400nm与与X射射线线之之间间)为为光光源源，分分辨辨率率可可提提高高1倍倍，可可以以看看到到许许多多在在普普通通光光学显微镜下看不到的胶体颗粒。学显微镜下看不到的胶体颗粒。此此外外，核核酸酸和和有有些些蛋蛋白白质质可可吸吸收收一一定定波波长长的的紫紫外外线线，因而这种显微镜可用来因而这种显微镜可用来测定细胞核中的核酸含量

4、测定细胞核中的核酸含量。第一节第一节 形态观察技术形态观察技术2.暗视野显微镜暗视野显微镜这这种种显显微微镜镜使使照照明明光光线线不不能能直直接接进进入入物物镜镜，只只允允许被标本反射和衍射的光线进入物镜。许被标本反射和衍射的光线进入物镜。第一节第一节 形态观察技术形态观察技术中央遮光板中央遮光板暗视野聚光器的暗视野聚光器的设计原理设计原理第一节第一节 形态观察技术形态观察技术视野的背景黑视野的背景黑物体的边缘亮物体的边缘亮利利用用这这种种显显微微镜镜能能见见到到小小至至5nm的的质质点点，分分辨辨率率比比普普通通显显微微镜镜高高了了40倍倍，有有一一些些细细胞胞器器，如如核、线粒体，均清晰可

5、见。核、线粒体，均清晰可见。3.相差显微镜相差显微镜荷荷兰兰物物理理学学家家F.Zernike(1932)：提提高高了了活活细细胞胞结结构的反差，从而解决了对活细胞观察的难题。构的反差，从而解决了对活细胞观察的难题。获诺贝尔物理奖获诺贝尔物理奖获诺贝尔物理奖获诺贝尔物理奖(1953)(1953)第一节第一节 形态观察技术形态观察技术(phase contrast microscope)特点：在在聚聚光光器器或或光光源源上上加加了了一一环环形形光光阑阑(annular diaphragm),在物镜中加了一在物镜中加了一环形相板环形相板(annular phase plate)。相差显微镜的构造相

6、差显微镜的构造相差显微镜的构造相差显微镜的构造:上上有有一一环环形形区区，制制成成凹凹槽槽或或凸凸起起（亦亦可可涂涂上上特特殊殊物物质质）：环环形形区区的的设设计计深深度度（或或高高度度）恰恰好好可可使使通通过过此此区区的的光光线线提提前前或延后或延后1/41/4光程差光程差。环形光阑环形光阑环形相板环形相板使使透透过过聚聚光光器器的的光光线线形形成成空空心心光光锥锥，焦聚到标本上。焦聚到标本上。第一节第一节 形态观察技术形态观察技术相差显微镜相差显微镜相差显微镜相差显微镜的光路图解的光路图解的光路图解的光路图解第一节第一节 形态观察技术形态观察技术根根据据设设计计，只只有有未未透透过过标标本

7、本的的直直射射光光可可通通过过相相板板环环形形区区，而而透透过过标标本本的的偏偏折折光光则则由由相相板板其其他他部部分分通通过过。两两组组光光线线和和轴后发生干涉现象。轴后发生干涉现象。两两两两组组组组光光光光线线线线合合合合轴轴轴轴后后后后光光光光波波波波相相相相减减减减，振振振振幅幅幅幅变变变变小小小小，形形形形成成成成暗反差暗反差（正反差正反差正反差正反差）结构比周围介质更加变暗。结构比周围介质更加变暗。结构比周围介质更加变暗。结构比周围介质更加变暗。未未未未透透透透过过过过标标标标本本本本的的的的直直直直射射射射光光光光（通通通通过过过过相相相相板板板板环环环环形形形形区区区区）与与与

8、与透透透透过过过过标标标标本本本本的的的的偏折光偏折光偏折光偏折光（由相板其他部分通过）（由相板其他部分通过）（由相板其他部分通过）（由相板其他部分通过）和轴和轴和轴和轴后发生后发生后发生后发生干涉干涉干涉干涉：第一节第一节 形态观察技术形态观察技术S-DS-DS SD D如果为如果为如果为如果为凹形相板凹形相板：通过样品的光线延后通过样品的光线延后通过样品的光线延后通过样品的光线延后1/4 1/4 -1/4-1/4-1/4-1/4 则则则则两两两两组组组组光光光光波波波波相相相相加加加加，振振振振幅幅幅幅加加加加大大大大，形形形形成成成成亮反差亮反差（负反差负反差负反差负反差）标本结构比周围

9、介质更加变亮。标本结构比周围介质更加变亮。标本结构比周围介质更加变亮。标本结构比周围介质更加变亮。第一节第一节 形态观察技术形态观察技术S+DS+DS SD D如果为如果为如果为如果为凸性相板凸性相板：由由于于标标本本的的各各种种结结构构的的厚厚度度和和折折射射系系数数不不同同，在在相差显微镜下显示出不同的明暗度。相差显微镜下显示出不同的明暗度。-1/4-1/4+1/4+1/4 4.4.微分干涉差显微镜微分干涉差显微镜微分干涉差显微镜微分干涉差显微镜NomarskiNomarski (1952)(1952)在在在在相相相相差差差差显显显显微微微微镜镜镜镜原原原原理理理理的的的的基基基基础础础础

10、上上上上发发发发明明明明的的的的：又又又又称称称称NomarskiNomarski相相相相差差差差显显显显微微微微镜镜镜镜，其其其其优优优优点点点点是是是是能能能能显示结构的三维立体投影影像显示结构的三维立体投影影像显示结构的三维立体投影影像显示结构的三维立体投影影像。第一节第一节第一节第一节 形态观察技术形态观察技术形态观察技术形态观察技术(differential interference(differential interference contrast(DIC)contrast(DIC)microscope)microscope)与与与与相相相相差差差差显显显显微微微微镜镜镜镜相相相

11、相比比比比，其其其其标标标标本本本本可可可可略略略略厚厚厚厚一一一一点点点点，折折折折射射射射率差别更大。率差别更大。率差别更大。率差别更大。DICDIC显显显显微微微微镜镜镜镜首首首首先先先先DICDIC利利利利用用用用的的的的是是是是偏偏偏偏振振振振光光光光。此此此此外外外外，除除除除了了了了物物物物镜镜镜镜外外外外，还还还还增增增增加加加加了了了了四四四四个个个个光光光光学学学学组组组组件件件件：偏偏偏偏振振振振器器器器(polarizer)(polarizer)、DICDIC棱棱棱棱 镜镜镜镜、DICDIC滑滑滑滑 行行行行 器器器器 和和和和 检检检检 偏偏偏偏 器器器器(analy

12、zer)(analyzer)。DICDIC显显显显微微微微镜镜镜镜使使使使细细细细胞胞胞胞的的的的细细细细微微微微结结结结构构构构立立立立体体体体感感感感特特特特别别别别强强强强，适适适适合合合合于于于于显显显显微微微微操操操操作作作作。目目目目前前前前像像像像基基基基因因因因注注注注入入入入、核核核核移移移移植植植植等等等等生生生生物物物物工程的显微操作常在这种显微镜下进行。工程的显微操作常在这种显微镜下进行。工程的显微操作常在这种显微镜下进行。工程的显微操作常在这种显微镜下进行。第一节第一节 形态观察技术形态观察技术DIC显微镜显微镜暗视野显微镜暗视野显微镜相差显微镜相差显微镜普通显微镜普

13、通显微镜5.荧光显微镜荧光显微镜第一节第一节 形态观察技术形态观察技术荧光显微镜的成象原理荧光显微镜的成象原理荧光显微镜的成象原理荧光显微镜的成象原理分裂细胞的分裂细胞的分裂细胞的分裂细胞的免疫荧光图像免疫荧光图像免疫荧光图像免疫荧光图像不同荧光染料不同荧光染料不同荧光染料不同荧光染料标记标记标记标记抗抗抗抗 体体体体抗原抗原抗原抗原(细胞的蛋白质成分细胞的蛋白质成分细胞的蛋白质成分细胞的蛋白质成分)特异性结合特异性结合特异性结合特异性结合6.激光共聚焦显微镜激光共聚焦显微镜第一节第一节 形态观察技术形态观察技术(Laser(Laser ConfocalConfocal Microscope,

14、LCM)Microscope,LCM)光源：光源：光源：光源：通过共聚焦可进行光学切片通过共聚焦可进行光学切片通过共聚焦可进行光学切片通过共聚焦可进行光学切片对固相、液相物体均可进行观察对固相、液相物体均可进行观察对固相、液相物体均可进行观察对固相、液相物体均可进行观察特点：特点：特点：特点：激光激光激光激光4.4.冰冻蚀刻技术冰冻蚀刻技术2.2.扫描式电子显微镜扫描式电子显微镜3.3.扫描隧道电子显微镜扫描隧道电子显微镜1.1.透射式电子显微镜透射式电子显微镜二、电子显微镜二、电子显微镜第一节第一节 形态观察技术形态观察技术第二节第二节 生物化学分析技术生物化学分析技术二、免疫细胞化学二、免

15、疫细胞化学二、免疫细胞化学二、免疫细胞化学三、显微光谱分析技术三、显微光谱分析技术三、显微光谱分析技术三、显微光谱分析技术四、放射自显影术四、放射自显影术四、放射自显影术四、放射自显影术五、超离心技术五、超离心技术五、超离心技术五、超离心技术六、分子杂交技术六、分子杂交技术六、分子杂交技术六、分子杂交技术七、七、七、七、PCRPCR技术技术技术技术一、组织化学与细胞化学技术一、组织化学与细胞化学技术一、组织化学与细胞化学技术一、组织化学与细胞化学技术八、层析技术八、层析技术八、层析技术八、层析技术免免免免疫疫疫疫细细细细胞胞胞胞化化化化学学学学是是是是根根根根据据据据免免免免疫疫疫疫学学学学原

16、原原原理理理理，利利利利用用用用抗抗体体同同同同特特特特定定定定抗原抗原结合，对抗原进行专一定位测定的技术。结合，对抗原进行专一定位测定的技术。结合，对抗原进行专一定位测定的技术。结合，对抗原进行专一定位测定的技术。如如如如果果果果将将将将抗抗抗抗体体体体结结结结合合合合上上上上标标标标记记记记物物物物，再再再再与与与与组组组组织织织织中中中中的的的的抗抗抗抗原原原原发发发发生生生生反反反反应应应应，即即即即可可可可在在在在光光光光镜镜镜镜或或或或电电电电镜镜镜镜下下下下显显显显示示示示出出出出该该该该抗抗抗抗原原原原存存存存在在在在于于于于组组组组织织织织中的部位。中的部位。中的部位。中的部

17、位。二、免疫细胞化学二、免疫细胞化学二、免疫细胞化学二、免疫细胞化学(immunocytochemistryimmunocytochemistry)第二节第二节 生物化学分析技术生物化学分析技术常用的标记物有常用的标记物有常用的标记物有常用的标记物有荧光素荧光素和和和和酶酶：标标标标记记记记荧荧荧荧光光光光素素素素的的的的称称称称为为为为免免疫疫荧荧光光法法(immunofluorescentimmunofluorescent technique)technique)，常常常常用用用用的的的的萤萤萤萤光光光光素素素素有有有有异异异异硫硫硫硫氰氰氰氰酸酸酸酸荧荧荧荧光光光光素素素素(FITCFI

18、TC)、罗罗罗罗丹明丹明丹明丹明(rhodaminerhodamine)等。等。等。等。标标标标记记记记酶酶酶酶的的的的称称称称为为为为酶酶标标免免疫疫法法(enzyme-(enzyme-labelledlabelled antibody antibody method)method)，常常常常 用用用用 的的的的 酶酶酶酶 有有有有 辣辣辣辣 根根根根 过过过过 氧氧氧氧 化化化化 物物物物 酶酶酶酶(horseradish(horseradish peroxidaseperoxidase)等等等等，酶酶酶酶与与与与底底底底物物物物发发发发生生生生反反反反应应应应后后后后形形形形成成成成不不

19、不不透透透透明明明明的的的的沉沉沉沉积积积积物物物物或或或或有色物有色物有色物有色物，从而显示出抗原的存在部位。，从而显示出抗原的存在部位。，从而显示出抗原的存在部位。，从而显示出抗原的存在部位。第二节第二节 生物化学分析技术生物化学分析技术抗体与抗原的结合方法可分为抗体与抗原的结合方法可分为抗体与抗原的结合方法可分为抗体与抗原的结合方法可分为以下以下以下以下两种：两种：两种：两种：第二节第二节 生物化学分析技术生物化学分析技术直接法直接法直接法直接法间接法间接法间接法间接法将将将将带带带带有有有有标标标标记记记记的的的的抗抗抗抗体体体体与与与与抗抗抗抗原原原原反反反反应应应应，显显显显示示示

20、示出出出出抗抗抗抗原存在的部位原存在的部位原存在的部位原存在的部位在在在在抗抗抗抗体体体体抗抗抗抗原原原原初初初初级级级级反反反反应应应应的的的的基基基基础础础础上上上上，再再再再用用用用带带带带标标标标记记记记的的的的次次次次级级级级抗抗抗抗体体体体与与与与初初初初级级级级抗抗抗抗体体体体反反反反应应应应，从从从从而而而而使使使使初初初初级级级级反反反反应应应应得得得得到到到到放放放放大，增强显示效果大，增强显示效果大，增强显示效果大，增强显示效果间间间间接接接接免免免免疫疫疫疫细细细细胞胞胞胞化化化化学学学学法法法法的的的的原原原原理理理理示示示示意意意意图图图图次级次级抗体抗体初级初级抗

21、体抗体标记物标记物第二节第二节 生物化学分析技术生物化学分析技术第一抗体（一抗）第一抗体（一抗）第一抗体（一抗）第一抗体（一抗）第二抗体（二抗）第二抗体（二抗）第二抗体（二抗）第二抗体（二抗）用荧光素标记抗体所显示出的细胞中几种蛋白质的分布状态用荧光素标记抗体所显示出的细胞中几种蛋白质的分布状态用荧光素标记抗体所显示出的细胞中几种蛋白质的分布状态用荧光素标记抗体所显示出的细胞中几种蛋白质的分布状态第二节第二节 生物化学分析技术生物化学分析技术I R S-1I R S-1IRS-1+Bcl-2IRS-1+Bcl-2Bcl-2Bcl-2放放放放射射射射性性性性同同同同位位位位素素素素发发发发射射射

22、射出出出出的的的的各各各各种种种种射射射射线线线线能能能能使使使使照照照照相相相相乳乳乳乳胶胶胶胶中中中中的的的的溴溴溴溴化化化化银银银银晶晶晶晶体体体体还还还还原原原原(感感感感光光光光)。利利利利用用用用放放放放射射射射性性性性物物物物质质质质使使使使照照照照相相相相乳乳乳乳胶胶胶胶膜膜膜膜产生该物质自身影像的技术，称为产生该物质自身影像的技术，称为产生该物质自身影像的技术，称为产生该物质自身影像的技术，称为放射自显影术放射自显影术放射自显影术放射自显影术。放放放放射射射射自自自自显显显显影影影影的的的的切切切切片片片片用用用用染染染染料料料料染染染染色色色色后后后后，便便便便可可可可在在

23、在在显显显显微微微微镜镜镜镜下下下下对标记上放射性的化合物进行定位或定量测定。对标记上放射性的化合物进行定位或定量测定。对标记上放射性的化合物进行定位或定量测定。对标记上放射性的化合物进行定位或定量测定。四、放射自显影术四、放射自显影术四、放射自显影术四、放射自显影术第二节第二节 生物化学分析技术生物化学分析技术(autoradiography)由由由由于于于于有有有有机机机机大大大大分分分分子子子子均均均均含含含含有有有有碳碳碳碳、氢氢氢氢原原原原子子子子，故故故故实实实实验验验验室室室室一一一一般般般般常常常常选选选选用用用用1414CC和和和和33HH标标标标记记记记(1414CC和和和

24、和33HH均均均均为为为为弱弱弱弱 放放放放射射射射性性性性同同同同位位位位素素素素，半半半半衰期长衰期长衰期长衰期长:1414CC为为为为57305730年年年年;33HH为为为为12.2612.26年年年年)。一一一一般般般般常常常常用用用用33HH胸胸胸胸腺腺腺腺嘧嘧嘧嘧啶啶啶啶脱脱脱脱氧氧氧氧核核核核苷苷苷苷来来来来显显显显示示示示DNADNA，用用用用33H-H-尿尿尿尿嘧嘧嘧嘧啶啶啶啶核核核核苷苷苷苷显显显显示示示示RNARNA。在在在在研研研研究究究究蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质和和和和粘粘粘粘多多多多糖糖糖糖时时时时，则则则则分分分分别选用别选用别选用别选用33H-H-氨基酸氨基酸

25、氨基酸氨基酸和和和和33H-H-甘露糖甘露糖甘露糖甘露糖、33H-H-岩藻糖岩藻糖岩藻糖岩藻糖等。等。等。等。第二节第二节 生物化学分析技术生物化学分析技术常用常用常用常用3 3HH胸腺嘧啶脱氧核苷显示胸腺嘧啶脱氧核苷显示胸腺嘧啶脱氧核苷显示胸腺嘧啶脱氧核苷显示DNADNA的放射自显影图像的放射自显影图像的放射自显影图像的放射自显影图像第二节第二节 生物化学分析技术生物化学分析技术放射自显影技术与电镜技术结合，也可进行放射自显影技术与电镜技术结合，也可进行放射自显影技术与电镜技术结合，也可进行放射自显影技术与电镜技术结合，也可进行电镜电镜自显影自显影（electron-microscopic

26、autoradiographyelectron-microscopic autoradiography）。）。）。）。电镜自显影照片电镜自显影照片电镜自显影照片电镜自显影照片六、分子杂交技术六、分子杂交技术六、分子杂交技术六、分子杂交技术原原理理：具具具具有有有有互互互互补补补补核核核核苷苷苷苷酸酸酸酸序序序序列列列列的的的的两两两两条条条条单单单单链链链链核核核核苷苷苷苷酸酸酸酸分分分分子子子子片片片片段段段段，在在在在适适适适当当当当条条条条件件件件下下下下，通通通通过过过过氢氢氢氢键键键键结结结结合合合合，形形形形成成成成DNA-DNADNA-DNA、DNA-RNADNA-RNA或或或或

27、RNA-RNARNA-RNA杂杂杂杂交交交交的的的的双双双双链链链链分分分分子。子。子。子。这这这这种种种种技技技技术术术术可可可可用用用用来来来来测测测测定定定定单单单单链链链链分分分分子子子子核核核核苷苷苷苷酸酸酸酸序序序序列列列列间间间间是是是是否具有否具有否具有否具有互补关系互补关系互补关系互补关系。第二节第二节 生物化学分析技术生物化学分析技术(molecular hybridization)荧光原位杂交荧光原位杂交荧光原位杂交荧光原位杂交 (fluorescence in situ hybridization,(fluorescence in situ hybridization,

28、FISHFISH):):FISHFISH技术的原理图解技术的原理图解技术的原理图解技术的原理图解主主主主要要要要介介介介绍绍绍绍几几几几种种种种对对对对细细细细胞胞胞胞进进进进行行行行整整整整体体体体或或或或局局局局部部部部进进进进行行行行手手手手术术术术处处处处理理理理的的的的技技技技术术术术，这这这这些些些些技技技技术术术术在在在在细细细细胞胞胞胞工工工工程程程程领领领领域域域域中中中中有有有有很很很很重重重重要要要要的应用价值。的应用价值。的应用价值。的应用价值。一、细胞培养技术一、细胞培养技术一、细胞培养技术一、细胞培养技术二、显微操作术二、显微操作术二、显微操作术二、显微操作术三、细

29、胞融合三、细胞融合三、细胞融合三、细胞融合技术技术技术技术第四节第四节 细胞工程技术细胞工程技术一、细胞培养一、细胞培养细细细细胞胞胞胞培培培培养养养养技技技技术术术术(cell(cell culture)culture)或或或或称称称称组组组组织织织织培培培培养养养养技技技技术术术术即即即即是是是是选选选选用各种最佳生存条件对活细胞进行培养和研究的技术。用各种最佳生存条件对活细胞进行培养和研究的技术。用各种最佳生存条件对活细胞进行培养和研究的技术。用各种最佳生存条件对活细胞进行培养和研究的技术。第四节第四节 其它实验性操作技术其它实验性操作技术 细胞培养在细胞生物学中是一项极为重要的实验技术

30、，细胞培养在细胞生物学中是一项极为重要的实验技术，也是生物工程中不可缺少的重要手段。细胞生物学中有大也是生物工程中不可缺少的重要手段。细胞生物学中有大量的生理生化方面的研究成果，都是通过细胞培养再结合量的生理生化方面的研究成果，都是通过细胞培养再结合其他技术取得的。其他技术取得的。群群群群体体体体培培培培养养养养：将将将将含含含含有有有有一一一一定定定定数数数数量量量量细细细细胞胞胞胞的的的的悬悬悬悬液液液液置置置置于于于于培培培培养养养养瓶中，让细胞贴壁生长，汇合后形成均匀的单细胞层；瓶中，让细胞贴壁生长，汇合后形成均匀的单细胞层；瓶中，让细胞贴壁生长，汇合后形成均匀的单细胞层；瓶中，让细胞

31、贴壁生长，汇合后形成均匀的单细胞层；克克克克隆隆隆隆培培培培养养养养：将将将将高高高高度度度度稀稀稀稀释释释释的的的的游游游游离离离离细细细细胞胞胞胞悬悬悬悬液液液液加加加加入入入入培培培培养养养养瓶瓶瓶瓶中中中中，经经经经过过过过生生生生长长长长增增增增殖殖殖殖每每每每一一一一个个个个细细细细胞胞胞胞形形形形成成成成一一一一个个个个细细细细胞胞胞胞集集集集落落落落，此此此此种种种种集集集集落落落落即即即即称称称称为为为为克克隆隆(clone)(clone)。一一一一个个个个细细细细胞胞胞胞克克克克隆隆隆隆中中中中的的的的所所所所有有有有细胞均来源于同一个祖先细胞。细胞均来源于同一个祖先细胞。

32、细胞均来源于同一个祖先细胞。细胞均来源于同一个祖先细胞。此此此此外外外外，为为为为了了了了制制制制取取取取细细细细胞胞胞胞产产产产品品品品而而而而设设设设计计计计了了了了规规规规模模模模培培培培养养养养法法法法，如如如如转鼓培养法转鼓培养法转鼓培养法转鼓培养法、发酵罐培养发酵罐培养发酵罐培养发酵罐培养。细胞培养方式大致可分为两种：细胞培养方式大致可分为两种：细胞培养方式大致可分为两种：细胞培养方式大致可分为两种：第四节第四节 其它实验性操作技术其它实验性操作技术1.1.1.1.动物细胞培养动物细胞培养动物细胞培养动物细胞培养针针针针对对对对不不不不同同同同种种种种类类类类的的的的细细细细胞胞胞

33、胞，学学学学者者者者们们们们设设设设计计计计出出出出了了了了许许许许多多多多细细细细胞胞胞胞培培培培养养养养 基基基基 配配配配 方方方方，目目目目 前前前前 使使使使 用用用用 比比比比 较较较较 广广广广 泛泛泛泛 的的的的 化化化化 学学学学 合合合合 成成成成 培培培培 养养养养 基基基基(chemically(chemically defined defined medium)medium)有有有有 TC-199TC-199、MEMMEM、L-15L-15和和和和RPMI-1640RPMI-1640等。等。等。等。但但但但是是是是在在在在工工工工作作作作中中中中要要要要针针针针对对对

34、对不不不不同同同同的的的的培培培培养养养养对对对对象象象象来来来来选选选选择择择择最最最最适适适适培培培培养基，养基，养基，养基，培养基选择恰当与否是细胞培养是否成功的关键培养基选择恰当与否是细胞培养是否成功的关键培养基选择恰当与否是细胞培养是否成功的关键培养基选择恰当与否是细胞培养是否成功的关键。第四节第四节 其它实验性操作技术其它实验性操作技术正正正正常常常常组组组组织织织织的的的的初初初初级级级级培培培培养养养养物物物物，细细细细胞胞胞胞传传传传代代代代培培培培养养养养均均均均有有有有一一一一定定定定的的的的限限限限度，度，度，度，只有癌细胞和发生转化的细胞才能无限生长下去只有癌细胞和发

35、生转化的细胞才能无限生长下去只有癌细胞和发生转化的细胞才能无限生长下去只有癌细胞和发生转化的细胞才能无限生长下去。所所所所谓谓谓谓转转转转化化化化(transformation)(transformation)即即即即是是是是指指指指正正正正常常常常细细细细胞胞胞胞在在在在某某某某种种种种因因因因子子子子的的的的作作作作用用用用下下下下发发发发生生生生突突突突变变变变而而而而具具具具有有有有癌癌癌癌性性性性的的的的细细细细胞胞胞胞。如如如如HeLaHeLa细细细细胞胞胞胞系系系系（19511951年从年从年从年从HeHenrietta nrietta LaLackscks的宫颈癌细胞培养而成）

36、。的宫颈癌细胞培养而成）。的宫颈癌细胞培养而成）。的宫颈癌细胞培养而成）。迄迄迄迄今今今今我我我我国国国国业业业业已已已已建建建建立立立立了了了了上上上上百百百百个个个个细细细细胞胞胞胞系系系系，为为为为细细细细胞胞胞胞生生生生物物物物学学学学和和和和医学做出了重大贡献。医学做出了重大贡献。医学做出了重大贡献。医学做出了重大贡献。通过细胞培养，世界上已建立了大量细胞株或细胞系。通过细胞培养，世界上已建立了大量细胞株或细胞系。通过细胞培养，世界上已建立了大量细胞株或细胞系。通过细胞培养，世界上已建立了大量细胞株或细胞系。第四节第四节 其它实验性操作技术其它实验性操作技术(1)(1)外外外外植植植

37、植体体体体培培培培养养养养，诱诱诱诱发发发发产产产产生生生生愈愈愈愈伤伤伤伤组组组组织织织织：如如如如果果果果条条条条件件件件适适适适宜宜宜宜，尚尚尚尚可可可可培养出再生植株。培养出再生植株。培养出再生植株。培养出再生植株。(2)(2)悬悬悬悬浮浮浮浮细细细细胞胞胞胞培培培培养养养养：在在在在愈愈愈愈伤伤伤伤组组组组织织织织培培培培养养养养技技技技术术术术基基基基础础础础上上上上发发发发展展展展起起起起来来来来的的的的一种培养技术。一种培养技术。一种培养技术。一种培养技术。植物细胞培养大体有如下几种技术植物细胞培养大体有如下几种技术植物细胞培养大体有如下几种技术植物细胞培养大体有如下几种技术:

38、(3)(3)原生质体培养：原生质体培养：原生质体培养：原生质体培养：细胞杂交，转基因等细胞杂交，转基因等细胞杂交，转基因等细胞杂交，转基因等(4)(4)单倍体培养：单倍体培养：单倍体培养：单倍体培养：通过通过通过通过花药花药或或或或花粉花粉培养获得单倍体植株。培养获得单倍体植株。培养获得单倍体植株。培养获得单倍体植株。第四节第四节 其它实验性操作技术其它实验性操作技术2.植物细胞培养植物细胞培养二、显微操作术二、显微操作术所所所所谓谓谓谓显显显显微微微微操操操操作作作作术术术术(micromanipulation)(micromanipulation)就就就就是是是是在在在在显显显显微微微微镜

39、镜镜镜下下下下，用用用用显显显显微微微微操操操操作作作作装装装装置置置置对对对对细细细细胞胞胞胞进进进进行行行行解解解解剖剖剖剖手手手手术术术术和和和和微微微微量量量量注射的技术注射的技术注射的技术注射的技术。第四节第四节 其它实验性操作技术其它实验性操作技术现在显微操作装置的设计越来越精密，已经有可能对现在显微操作装置的设计越来越精密，已经有可能对现在显微操作装置的设计越来越精密，已经有可能对现在显微操作装置的设计越来越精密，已经有可能对细胞核进行解剖和注入微量物质（如核酸分子片段）。细胞核进行解剖和注入微量物质（如核酸分子片段）。细胞核进行解剖和注入微量物质（如核酸分子片段）。细胞核进行解

40、剖和注入微量物质（如核酸分子片段）。NT-88NE-NNT-88NE-N型显微操纵仪型显微操纵仪型显微操纵仪型显微操纵仪 (日本日本日本日本Nikon)Nikon)第四节第四节 其它实验性操作技术其它实验性操作技术 注射吸管注射吸管固定吸管固定吸管细细细细胞胞胞胞显显显显微微微微解解解解剖剖剖剖手手手手术术术术图图图图解解解解第四节第四节 其它实验性操作技术其它实验性操作技术三、细胞融合三、细胞融合真真真真核核核核细细细细胞胞胞胞通通通通过过过过介介介介导导导导和和和和培培培培养养养养，两两两两个个个个或或或或多多多多个个个个细细细细胞胞胞胞合合合合并并并并成成成成一一一一个个个个双双双双核核

41、核核或或或或多多多多核核核核细细细细胞胞胞胞的的的的过过过过程程程程称称称称为为为为细细胞胞融融合合(cell fusion)(cell fusion)或或或或细胞杂交细胞杂交(cell hybridization)(cell hybridization)。基基基基因因因因型型型型相相相相同同同同的的的的细细细细胞胞胞胞融融融融合合合合成成成成的的的的杂杂杂杂交交交交细细细细胞胞胞胞称称称称为为为为同同同同核核核核体体体体(homokaryonhomokaryon)；来来来来自自自自不不不不同同同同基基基基因因因因型型型型的的的的杂杂杂杂交交交交细细细细胞胞胞胞则则则则称称称称为为为为异核体异

42、核体异核体异核体(heterokaryonheterokaryon)。第四节第四节 其它实验性操作技术其它实验性操作技术目前诱导细胞融合的方法有三种：目前诱导细胞融合的方法有三种：目前诱导细胞融合的方法有三种：目前诱导细胞融合的方法有三种：1.1.病毒介导的细胞融合（如仙台病毒）病毒介导的细胞融合（如仙台病毒）病毒介导的细胞融合（如仙台病毒）病毒介导的细胞融合（如仙台病毒）2.2.化学介导的细胞融合（如化学介导的细胞融合（如化学介导的细胞融合（如化学介导的细胞融合（如PEGPEG）3.3.电激介导的细胞融合电激介导的细胞融合电激介导的细胞融合电激介导的细胞融合第四节第四节 其它实验性操作技术其

43、它实验性操作技术细细细细胞胞胞胞融融融融合合合合不不不不仅仅仅仅可可可可用用用用于于于于基基基基础础础础研研研研究究究究，而而而而且且且且还还还还有有有有重重重重要要要要的应用价值，如的应用价值，如的应用价值，如的应用价值，如动植物育种动植物育种动植物育种动植物育种和和和和制取单克隆抗体制取单克隆抗体制取单克隆抗体制取单克隆抗体等。等。等。等。ABAB杂交细胞杂交细胞低低 产产抗倒伏抗倒伏高高 产产易倒伏易倒伏高产高产抗倒伏抗倒伏长长 命命无分泌物无分泌物短短 命命分泌抗体分泌抗体长长 命命分泌抗体分泌抗体细胞细胞 融合融合(杂交杂交)第四节第四节 其它实验性操作技术其它实验性操作技术本章内容到此结束本章内容到此结束本章内容到此结束本章内容到此结束谢谢大家！谢谢大家！