第12章缩略 基因工程2013.ppt

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1、第十二章 基因工程第第 1节节 基因工程概述基因工程概述第第 2节节 基因的分离基因的分离第第 3节节 外源基因导入受体外源基因导入受体第第 4节节 转基因生物的检测与鉴定转基因生物的检测与鉴定第第 5节节 基因工程的应用基因工程的应用遗传工程（遗传工程（genetic engineeringgenetic engineering），也称），也称生物工程，利用工程技术的方法改造和修饰生物工程，利用工程技术的方法改造和修饰生物体，使其产生新的性状或产品，从而改生物体，使其产生新的性状或产品，从而改良生物体的一种遗传学手段。良生物体的一种遗传学手段。核心是利用重组核心是利用重组DNADNA技术，在

2、分子水平上操技术，在分子水平上操作修饰改变生物体。作修饰改变生物体。细胞工程（细胞工程（cell engineeringcell engineering）基因工程（基因工程（gene engineeringgene engineering）酶工程（酶工程（enzyme engineeringenzyme engineering）发酵工程（发酵工程（fermentation engineeringfermentation engineering）第第 1节节 基因工程概述基因工程概述遗传工程广义：细胞工程、染色体工程遗传工程广义：细胞工程、染色体工程 细胞器工程、基因工程细胞器工程、基因工程 酶

3、工程、发酵工程酶工程、发酵工程 狭义：基因工程狭义：基因工程 细胞工程细胞工程酶工程酶工程发酵工程发酵工程基因工程（基因工程（gene engineeringgene engineering）l利用人工的方法把生物的遗传物质在体外进利用人工的方法把生物的遗传物质在体外进行切割、拼接和重组，获得重组行切割、拼接和重组，获得重组DNADNA分子，然分子，然后导入宿主细胞或个体，使受体的遗传特性后导入宿主细胞或个体，使受体的遗传特性得到修饰或改变的过程。得到修饰或改变的过程。l基因工程操作的对象是基因工程操作的对象是DNADNA分子，分子，首先首先把目把目标基因克隆出来插入到一定的载体中，标基因克隆

4、出来插入到一定的载体中，然后然后将重组将重组DNADNA分子导入到受体细胞，并使其保持分子导入到受体细胞，并使其保持和遗传下去。和遗传下去。基因工程概述基因工程概述基因工程大事记1971 美国史密斯美国史密斯 分离限制性内切酶分离限制性内切酶1972 博格博格 猿猴和噬菌体的猿猴和噬菌体的DNA连接连接1973 科恩外源科恩外源DNA和质粒的和质粒的DNA连接，并转化连接，并转化随后停止随后停止1973 Cohen第一例成功的克隆实验第一例成功的克隆实验1978 Genentech公司公司 人胰岛素人胰岛素 世界上第一种世界上第一种基因工程蛋白药物基因工程蛋白药物 1982 第一个基因工程药物

5、第一个基因工程药物-重组人胰岛素在英、美获重组人胰岛素在英、美获准使用准使用 1985 第一批转基因家畜（兔、猪和羊），中国第一批转基因家畜（兔、猪和羊），中国 转基转基因鱼因鱼 19931993 基因工程西红柿在美国上市基因工程西红柿在美国上市1997 英国罗斯林研究所英国罗斯林研究所 多莉羊多莉羊1999.9 中国获准加入人类基因组计划中国获准加入人类基因组计划.负责测定人类基因组全部序列的负责测定人类基因组全部序列的1%2000.6.26 科学家公布人类基因组工科学家公布人类基因组工作草图作草图2001.2.11 公布人类基因组基本信息公布人类基因组基本信息生物技术工程：生物技术工程：基

6、因工程、蛋白质工程、基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程酶工程、细胞工程胰岛素胰岛素人生长激素人生长激素干扰素干扰素白细胞介素白细胞介素2粒细胞集落刺激因子粒细胞集落刺激因子粒细胞巨噬细胞集落刺激因子粒细胞巨噬细胞集落刺激因子红细胞生成素红细胞生成素 EPO组织纤溶酶原激活剂组织纤溶酶原激活剂生长激素生长激素促生长素促生长素抗血友病因子抗血友病因子脱氧核糖核酸酶脱氧核糖核酸酶葡糖脑苷脂酶葡糖脑苷脂酶鼠单克隆抗体鼠单克隆抗体基因工程的基本步骤：工作量？基因工程的基本步骤：工作量？1.1.目的基因的分离或合成目的基因的分离或合成2.2.将目的基因与载体将目的基因与载体DNADNA连接，构建重组连

7、接，构建重组DNADNA分分 子子-表达载体表达载体3.3.将重组将重组DNADNA分子导入受体细胞，并获得具有分子导入受体细胞，并获得具有 外源基因的个体外源基因的个体4.4.转基因生物的检测与鉴定转基因生物的检测与鉴定5.5.转基因生物的安全性评价转基因生物的安全性评价 u获得目的基因的获得目的基因的u构建表达载体构建表达载体u目的基因导入受体细胞目的基因导入受体细胞u转化体的转基因检测转化体的转基因检测基因工程的内容 第第 1节节 基因工程概述基因工程概述第第 2节节 基因的分离基因的分离一一 工具酶工具酶二二 载体载体三三 基因分离方法基因分离方法 基因分离（克隆）包括基因分离（克隆）

8、包括3 3个步骤：个步骤：1.1.目标目标DNADNA片段（基因）的分离片段（基因）的分离2.2.目标基因克隆到载体上目标基因克隆到载体上3.3.载体导入宿主细胞并在其中大量载体导入宿主细胞并在其中大量 复制复制 一、工具酶一、工具酶1 1、限制性内切核酸酶、限制性内切核酸酶 限制酶限制酶：作用于特定（异）核苷酸序列：作用于特定（异）核苷酸序列 的磷酸二脂酶的磷酸二脂酶型酶型酶：仅：仅EcoEcoB B和和EcoEcoK K两种，催化限制两种，催化限制 性切割和修饰核苷酸性切割和修饰核苷酸2 2种功能种功能型酶型酶：基因工程中应用最广泛：基因工程中应用最广泛 型酶型酶：具有特异的识别位点，识别

9、位：具有特异的识别位点，识别位 点是非对称的点是非对称的 型限制性酶的基本特性：型限制性酶的基本特性：有特异识别和切割的序列部位有特异识别和切割的序列部位 DNADNA分子上两个单链断裂的部位通分子上两个单链断裂的部位通 常不是直接相对的常不是直接相对的 断裂所形成的断裂所形成的DNADNA片段常具有碱基片段常具有碱基 互补的单链尾巴（粘性末端）互补的单链尾巴（粘性末端）内切酶的切割和修饰功能由两个内切酶的切割和修饰功能由两个 不同的酶催化所完成，即内切酶不同的酶催化所完成，即内切酶 活性和甲基化作用活性是分开的活性和甲基化作用活性是分开的 限制性内切酶限制性内切酶EcoEcoRIRI的酶切位

10、点及酶切产物连接的酶切位点及酶切产物连接 回纹序列通过用相同通过用相同的限制性内的限制性内切核酸酶切切核酸酶切割形成一个割形成一个重组重组DNA分分子子（一）（一）限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶（二）（二）DNA连接酶（连接酶（ligase）在分子克隆中使用在分子克隆中使用的的DNA连接酶有两种：连接酶有两种：大肠杆菌大肠杆菌DNA连接酶连接酶和和T4 DNA连接酶。连接酶。催化催化DNA中相邻的中相邻的3 OH和和5 磷酸基磷酸基末端之间形成磷酸二末端之间形成磷酸二酯键并把两段酯键并把两段DNA连连接起来。接起来。（三）（三）反转录酶反转录酶（reverse transcriptase）反

11、转录酶是一类以反转录酶是一类以RNA为模板来指导为模板来指导DNA合成的合成的DNA聚合酶，所聚合酶，所以又称为依赖于以又称为依赖于RNA的的DNA聚合酶。聚合酶。反转录酶在遗传工程反转录酶在遗传工程中的主要用途是以中的主要用途是以mRNA为模板合成为模板合成cDNA。PCRPCR是体外快速扩增是体外快速扩增DNADNA的方法的方法,由美国的由美国的Mullis(1986)Mullis(1986)发明发明,19931993年诺贝尔化学奖年诺贝尔化学奖 PCRPCR可对特定可对特定DNADNA片段进行扩增，且可用痕量片段进行扩增，且可用痕量DNADNA作模板，对作模板，对DNADNA纯度要求也不

12、高纯度要求也不高,可在几可在几小时内使目的基因片段扩增到数百万个拷贝小时内使目的基因片段扩增到数百万个拷贝PCRPCR反应在一种混合液中进行，该混合液包反应在一种混合液中进行，该混合液包括括四种主要成分四种主要成分：两个引物（一般为：两个引物（一般为20 20 bpbp）、模板）、模板DNADNA、热稳定的、热稳定的DNADNA聚合酶（聚合酶（TaqTaq酶，在酶，在9595甚至更高的温度下活性稳定）和甚至更高的温度下活性稳定）和四种脱氧核苷酸。四种脱氧核苷酸。PCRPCR反应在反应在PCRPCR仪上自动进仪上自动进行行（四）（四）PCR：链式聚合酶反应：链式聚合酶反应PCRPCR反应从启动到

13、结束称为一个循环，每个反应从启动到结束称为一个循环，每个循环包括三个步骤：循环包括三个步骤：1 1）变性：）变性：9595，DNADNA 双链分离成单链双链分离成单链2 2）退火）退火(复性复性)：5555 左右，引物与单链的左右，引物与单链的 模板模板DNADNA序列互补结合序列互补结合3 3）延伸：）延伸：7272左右，左右，TaqTaq酶通过在引物酶通过在引物 的的3 3-OH-OH端增加碱基的端增加碱基的 办法使引物延伸办法使引物延伸表12-2 PCR循环数与PCR产物的拷贝数之间的关系循环数PCR产物拷贝数121252532102101024152153276820220104857

14、62522533554432302301073741824（四）（四）PCR PCR产物可以通过产物可以通过电泳检测电泳检测琼脂糖电泳琼脂糖电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳复习题复习题1.什么是遗传工程，它主要包括哪些方面。什么是遗传工程，它主要包括哪些方面。2.基因工程常用的工具酶有哪些，它们的工作原基因工程常用的工具酶有哪些，它们的工作原理是什么。理是什么。3.重组重组DNA技术包括哪些主要步骤，基因克隆技术包括哪些主要步骤，基因克隆对载体有什么要求。对载体有什么要求。二、载体二、载体 重组重组DNADNA技术技术重组重组DNADNA：指利用不同生物来源的指利用不同生物来源的DNA

15、DNA分子拼接的杂种分子拼接的杂种 DNADNA分子，是自然界中不存在的分子，是自然界中不存在的DNADNA分子分子载体载体 载体（载体（vectorvector）是将外源基因送入受体细胞的）是将外源基因送入受体细胞的工具。工具。作为载体作为载体DNADNA分子，分子，需要具备需要具备：复制起始位点复制起始位点；限制酶切位点限制酶切位点选择标记选择标记分子量小，多拷贝，易于操作。分子量小，多拷贝，易于操作。除了上述特点外，一般还要求载体载荷外源除了上述特点外，一般还要求载体载荷外源DNADNA的幅度的幅度要宽，具有安全性等。要宽，具有安全性等。1.质粒载体质粒载体 质粒质粒(plasmid)是

16、细菌染色体外存在的一种是细菌染色体外存在的一种能够自我复制的双链闭合环状能够自我复制的双链闭合环状DNA分子，大分子，大小小1kb200kb。有一些特殊的基因，如致死基因，抗抗生素的基有一些特殊的基因，如致死基因，抗抗生素的基因等等。因等等。含有一个复制起始区含有一个复制起始区分为分为“严谨型严谨型”和和“松弛型松弛型”一般质粒通过改造后才能用于遗传工程。一般质粒通过改造后才能用于遗传工程。pUC18可以克隆可以克隆比较大的比较大的DNA片段片段，在细胞，在细胞中产生中产生500个拷贝个拷贝左右。左右。有一个有一个多克隆位点多克隆位点，位于大肠杆菌的，位于大肠杆菌的lacZ基因基因之内，有利于

17、筛选和分离转化细胞。之内，有利于筛选和分离转化细胞。筛选的原理是：筛选的原理是：野野生质粒，含有生质粒，含有X-gal（5-溴溴-氯吲哚氯吲哚-半半乳糖苷）的培养基上乳糖苷）的培养基上培养时产生培养时产生兰色菌斑兰色菌斑；插入克隆片段后，插入克隆片段后，lacZ基因失去功能，基因失去功能，不能代谢不能代谢X-gal，从，从而产生而产生白色菌斑。白色菌斑。2.病毒载体病毒载体噬菌体噬菌体 噬菌体载体噬菌体载体可接受可接受15 kb-23 kb的外源的外源DNA片片段，它既可作为段，它既可作为克隆载体，也可克隆载体，也可作为表达载体，作为表达载体，广泛用于各类广泛用于各类基基因库因库的构建。的构建

18、。(三三)克隆大片段载体克隆大片段载体粘粒载体、细菌人工染色体和酵母人工染色体载体等。粘粒载体、细菌人工染色体和酵母人工染色体载体等。u粘粒载体（粘粒载体（cosmid）是一类含有是一类含有cos位点的位点的质粒载体质粒载体.由于由于cosmid载体的大片段克隆能力，多用载体的大片段克隆能力，多用于基因组文库的构建，而于基因组文库的构建，而噬菌体载体多用噬菌体载体多用于于cDNA文库的构建。已有多种粘粒载体可文库的构建。已有多种粘粒载体可用于基因克隆，用于基因克隆，pJB8是最常用的粘粒载体是最常用的粘粒载体之一之一细菌人工染色体细菌人工染色体（bacterial artificial chr

19、omosome，BAC）BAC载体是基于细菌的载体是基于细菌的性因子性因子(F因子因子)质粒质粒的的一些特点构建的。一些特点构建的。F因子在细菌接合时转移因子在细菌接合时转移1Mb的细菌染色体片段。将的细菌染色体片段。将F因子经基因工程改良构因子经基因工程改良构成的成的BAC载体，可用于克隆载体，可用于克隆100 kb以上的以上的DNA片段。片段。酵母人工染色体酵母人工染色体（yeast artificial chromosome，YAC）酵母人工染色体酵母人工染色体是另一类酵母穿梭载体。是另一类酵母穿梭载体。具有自主复制序列、克隆位点以及可在细菌具有自主复制序列、克隆位点以及可在细菌和酵母菌

20、中选择的标记基因。和酵母菌中选择的标记基因。复习题复习题1.什么是遗传工程，它主要包括哪些方面。什么是遗传工程，它主要包括哪些方面。2.基因工程常用的工具酶有哪些，它们的工作原理是什基因工程常用的工具酶有哪些，它们的工作原理是什么。么。3.重组重组DNA技术包括哪些主要步骤，基因克隆对载体有技术包括哪些主要步骤，基因克隆对载体有什么要求。什么要求。4.简述简述cDNA文库构建的原理和过程。文库构建的原理和过程。5.简述简述T-DNA标签克隆基因的原理与技术流程。标签克隆基因的原理与技术流程。6.农杆菌介导的遗传转化需要具备哪些条件？其技术流农杆菌介导的遗传转化需要具备哪些条件？其技术流程如何？

21、影响转化效率的因素有哪些？程如何？影响转化效率的因素有哪些？7.简述转基因生物检测与鉴定的方法和工作原理。简述转基因生物检测与鉴定的方法和工作原理。8.结合所学知识，谈一下基因工程有哪些应用价值。结合所学知识，谈一下基因工程有哪些应用价值。三三 基因分离方法基因分离方法基于基因库的分离基因方法基于基因库的分离基因方法 T-DNA标签克隆基因标签克隆基因基于基于PCR的基因克隆的基因克隆人工合成基因人工合成基因1 构建基因库构建基因库 基因文库基因文库(library)是一组是一组DNA和和cDNA序序列克隆的集合体。从基因库中分离基因，列克隆的集合体。从基因库中分离基因，首先要构建基因库。只有

22、利用合乎要求的首先要构建基因库。只有利用合乎要求的基因库才有可能筛选出所需要的基因，很基因库才有可能筛选出所需要的基因，很多分子遗传学工作才能继续深入下去。多分子遗传学工作才能继续深入下去。基因组文库基因组文库(genomic library或或genomic bank)cDNA文库文库（一）（一）基于基因库的分离基因方法基于基因库的分离基因方法 2 筛选基因库筛选基因库 从基因库中筛选、分离基因，可据对待选从基因库中筛选、分离基因，可据对待选基因相关信息的了解程度，确定筛选方法和基因相关信息的了解程度，确定筛选方法和条件。条件。常用方法是利用一段核苷酸序列常用方法是利用一段核苷酸序列(DNA

23、，cDNA或寡核苷酸或寡核苷酸)作探针作探针(probe)，用放射性，用放射性同位素或非放射性同位素标记探针，也可用同位素或非放射性同位素标记探针，也可用抗体作探针，筛选基因库。抗体作探针，筛选基因库。菌落杂交技术寻找目标菌落杂交技术寻找目标DNA克隆克隆从文库中筛选获得目标克隆后，只有进行从文库中筛选获得目标克隆后，只有进行测序才能进行生物信息分析和功能预测。测序才能进行生物信息分析和功能预测。（三）序列测定和分析（三）序列测定和分析复习题复习题1.什么是遗传工程，它主要包括哪些方面。什么是遗传工程，它主要包括哪些方面。2.基因工程常用的工具酶有哪些，它们的工作原理是什基因工程常用的工具酶有

24、哪些，它们的工作原理是什么。么。3.重组重组DNA技术包括哪些主要步骤，基因克隆对载体有技术包括哪些主要步骤，基因克隆对载体有什么要求。什么要求。4.简述简述cDNA文库构建的原理和过程。文库构建的原理和过程。5.简述简述T-DNA标签克隆基因的原理与技术流程。标签克隆基因的原理与技术流程。6.农杆菌介导的遗传转化需要具备哪些条件？其技术流农杆菌介导的遗传转化需要具备哪些条件？其技术流程如何？影响转化效率的因素有哪些？程如何？影响转化效率的因素有哪些？7.简述转基因生物检测与鉴定的方法和工作原理。简述转基因生物检测与鉴定的方法和工作原理。8.结合所学知识，谈一下基因工程有哪些应用价值。结合所学

25、知识，谈一下基因工程有哪些应用价值。（二）（二）T-DNA标签克隆基因标签克隆基因基本原理：基本原理：利用利用T-DNA插入突变创造突变体，获得各插入突变创造突变体，获得各突变体的纯合材料；突变体的纯合材料；然后分析突变性状与然后分析突变性状与T-DNA的共分离关系，的共分离关系，存在共分离的材料用适当的存在共分离的材料用适当的PCR克隆技术克隆技术获得获得T-DNA的侧翼基因组序列；的侧翼基因组序列；用其作探针筛选基因文库，获取目标基因用其作探针筛选基因文库，获取目标基因或克隆，再进行下一步的分析或克隆，再进行下一步的分析。T-DNA 载体构建载体构建转化植物（转化植物（T1，T-DNA杂合

26、子杂合子)收获收获T2种子种子筛选筛选T2，获突变子，应为，获突变子，应为3:1分离分离确定确定T-DNA与突变型共分离的个体与突变型共分离的个体产生纯合后代产生纯合后代克隆克隆T-DNA两侧的植物两侧的植物DNA利用侧翼利用侧翼DNA序列作探针从该植物的序列作探针从该植物的cDNA文库中钓取基因文库中钓取基因基因功能的验证基因功能的验证（三）基于（三）基于PCR的基因克隆的基因克隆基于基于PCR的的DNA克隆与基于载体的克隆技克隆与基于载体的克隆技术相比具有一定优越性。术相比具有一定优越性。PCR反应速度很快，可以在几个小时内完反应速度很快，可以在几个小时内完成，而载体克隆需要几周时间。成，

27、而载体克隆需要几周时间。PCR反应非常灵敏，可以用来扩增痕量样反应非常灵敏，可以用来扩增痕量样品的品的DNA。对于部分降解、甚至污染，用载体克隆无对于部分降解、甚至污染，用载体克隆无法进行的法进行的DNA样品，样品，PCR扩增仍可获得目扩增仍可获得目的基因克隆的基因克隆（四）（四）人工合成基因人工合成基因 根据已知的基因或氨基酸序列，将化学合成寡核苷根据已知的基因或氨基酸序列，将化学合成寡核苷酸的方法与酶促合成酸的方法与酶促合成DNA的方法结合起来，可以很的方法结合起来，可以很快地人工合成基因。快地人工合成基因。第第 3 节节 外源基因导入受体外源基因导入受体 一、重组一、重组DNA技术技术二

28、、植物表达载体二、植物表达载体三、外源基因导入植物三、外源基因导入植物一、重组一、重组DNADNA技术技术重组重组DNADNA：指利用不同生物来源的指利用不同生物来源的DNADNA分子拼接的杂种分子拼接的杂种 DNADNA分子，是自然界中不存在的分子，是自然界中不存在的DNADNA分子分子重组重组DNADNA技术是基因克隆的关键技术，其技术是基因克隆的关键技术，其主要步骤主要步骤为：为：1)1)从细胞或组织获得从细胞或组织获得DNADNA并纯化并纯化2)2)用限制酶切割用限制酶切割DNADNA3)3)将所得限制片段连接到载体上将所得限制片段连接到载体上,形成重组形成重组DNADNA分子分子4)

29、4)重组重组DNADNA导入宿主细胞，在宿主细胞内复制，导入宿主细胞，在宿主细胞内复制，产生大量相同拷贝的重组产生大量相同拷贝的重组DNADNA分子分子-克隆克隆5)5)克隆的克隆的DNADNA分子可以从宿主细胞中回收，纯化分子可以从宿主细胞中回收，纯化 6)6)克隆的克隆的DNADNA可以转录和翻译，其产品可以被分可以转录和翻译，其产品可以被分 离出来用于研究或商业开发。离出来用于研究或商业开发。（一）重组（一）重组DNA导入原核生物（细菌）导入原核生物（细菌）CaCl2处理转化处理转化电激转化电激转化结合（结合（conjugation）二、植物表达载体二、植物表达载体（二）植物表达载体（二

30、）植物表达载体 Ti质粒，细菌质粒，土壤农杆菌，感染大多数双子质粒，细菌质粒，土壤农杆菌，感染大多数双子叶植物，产生冠瘿瘤叶植物，产生冠瘿瘤(grown gall tumors)。Ti 质粒。质粒。转移转移DNA（T-DNA根癌农杆菌引起的植物病 Agrobacterium tumefaciens（1）T-DNA区（区（transferred-DNA regions）T-DNA是农杆菌侵染植物细胞时，从是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒质粒上导入植物细胞的一段上导入植物细胞的一段DNA。Ti质粒改造后才能应用于植物的基因工程。质粒改造后才能应用于植物的基因工程。保留保留T-DNA两端的末端序列

31、，然后用外源两端的末端序列，然后用外源DNA插入或直插入或直接取代野生型接取代野生型T-DNA的部分基因，使转化的植物细的部分基因，使转化的植物细胞不具有成瘤能力。胞不具有成瘤能力。（2）Vir区（区（virolence region）毒性区毒性区（3）Con区区(regions encoding conjugations)调控调控TiTi质粒在农杆菌之间的转移质粒在农杆菌之间的转移。（4）Ori区区(origin of replication)复制起始区复制起始区。发根发根农杆农杆菌对菌对植物植物Ri质质粒的粒的转化转化与表与表达达 有一种农杆菌中存在另一种质粒，有一种农杆菌中存在另一种质粒

32、，Ri质粒，质粒，这种农杆菌即发根农杆菌。这种农杆菌即发根农杆菌。Ri质粒也可完质粒也可完成外源基因向植物的转移工作。发根农杆成外源基因向植物的转移工作。发根农杆菌侵染后植物细胞产生许多不定根，这种菌侵染后植物细胞产生许多不定根，这种不定根生长迅速，不断分枝成毛状，故称不定根生长迅速，不断分枝成毛状，故称之为毛状根，也称为发状根，分别简称为之为毛状根，也称为发状根，分别简称为毛根或发根。毛根或发根。Ri质粒质粒Ri质粒为根诱导质粒质粒为根诱导质粒。Ri质粒的结构与质粒的结构与Ti质粒的结构很相似，可以分为质粒的结构很相似，可以分为T区、区、vir区、区、ori区和其它区域等几个部分。区和其它区

33、域等几个部分。复习题复习题1.什么是遗传工程，它主要包括哪些方面。什么是遗传工程，它主要包括哪些方面。2.基因工程常用的工具酶有哪些，它们的工作原理是什基因工程常用的工具酶有哪些，它们的工作原理是什么。么。3.重组重组DNA技术包括哪些主要步骤，基因克隆对载体有技术包括哪些主要步骤，基因克隆对载体有什么要求。什么要求。4.简述简述cDNA文库构建的原理和过程。文库构建的原理和过程。5.简述简述T-DNA标签克隆基因的原理与技术流程。标签克隆基因的原理与技术流程。6.农杆菌介导的遗传转化需要具备哪些条件？其技术流农杆菌介导的遗传转化需要具备哪些条件？其技术流程如何？影响转化效率的因素有哪些？程如

34、何？影响转化效率的因素有哪些？7.简述转基因生物检测与鉴定的方法和工作原理。简述转基因生物检测与鉴定的方法和工作原理。8.结合所学知识，谈一下基因工程有哪些应用价值。结合所学知识，谈一下基因工程有哪些应用价值。高等植物基因遗传转化的方法为两类：高等植物基因遗传转化的方法为两类：三、遗传转化方法三、遗传转化方法非生物载体介导的遗传转化非生物载体介导的遗传转化u生物载体介导的遗传转化。生物载体介导的遗传转化。1.需要具备如下条件：需要具备如下条件：高效的植株再生体系。高效的植株再生体系。受体植物细胞对农杆菌要有很高的亲和力。受体植物细胞对农杆菌要有很高的亲和力。具有有效的选择系统。具有有效的选择系

35、统。稳定的转化技术和基因表达。稳定的转化技术和基因表达。（一）农杆菌法（一）农杆菌法2.转化方法：一般技术程序转化方法：一般技术程序（一）农杆菌法（一）农杆菌法农杆菌农杆菌侵染侵染植物细胞、细菌与植物细胞植物细胞、细菌与植物细胞共培养、在筛选培养基上筛选、获得转化共培养、在筛选培养基上筛选、获得转化细胞克隆、转化细胞分化并再生植株。细胞克隆、转化细胞分化并再生植株。叶圆盘转化法。带有伤口的植物叶片的叶圆盘转化法。带有伤口的植物叶片的圆盘。使用的外植体可以是叶圆盘、下胚圆盘。使用的外植体可以是叶圆盘、下胚轴、胚性愈伤组织等。轴、胚性愈伤组织等。F1.共培养2.在选择培养基上筛选3.筛选获得的抗性

36、愈伤 5.胚萌发成苗6.转基因植株移栽大田4.抗性愈伤分化成胚状体选择是为了将转化细胞与非转化细胞区分选择是为了将转化细胞与非转化细胞区分开，使转化细胞具有生长优势。在构建载开，使转化细胞具有生长优势。在构建载体时，往往在目的基因上连上一个选择标体时，往往在目的基因上连上一个选择标记基因。记基因。3.选择系统选择系统（一）农杆菌法（一）农杆菌法通常使用的是抗生素抗性基因，如通常使用的是抗生素抗性基因，如NPTNPTIIII基因基因新霉素磷酸转移酶基因，能分解新霉素磷酸转移酶基因，能分解卡那霉素等抗生素。卡那霉素等抗生素。其它选择标记基因，如抗除草剂基因，报其它选择标记基因，如抗除草剂基因，报告

37、基因（如：告基因（如：GUSGUS基因、基因、GFPGFP基因等）等。基因等）等。F1.共培养2.在选择培养基上筛选3.筛选获得的抗性愈伤 5.胚萌发成苗6.转基因植株移栽大田4.抗性愈伤分化成胚状体4.影响因素影响因素u基因枪法（基因枪法（gene gun）是依赖高速的）是依赖高速的金属微粒将外源基因金属微粒将外源基因导入活细胞的一种转导入活细胞的一种转化技术。化技术。（二）基因枪介法（二）基因枪介法优点优点：（：（1 1）无宿主限制。无宿主限制。（2 2）易于操作。）易于操作。（二）基因枪法（二）基因枪法缺点：如转化频率低、嵌合体较多、结果的缺点：如转化频率低、嵌合体较多、结果的重复性差，

38、转化的外源基因以多拷贝居多，易重复性差，转化的外源基因以多拷贝居多，易导致基因沉默，实验成本较高等。导致基因沉默，实验成本较高等。还有很多将外源基因引入植物基因组的方法，还有很多将外源基因引入植物基因组的方法，如电激法、花粉管通道法、超声波法等，它们如电激法、花粉管通道法、超声波法等，它们都在不同程度上得到应用。都在不同程度上得到应用。复习题复习题1.什么是遗传工程，它主要包括哪些方面。什么是遗传工程，它主要包括哪些方面。2.基因工程常用的工具酶有哪些，它们的工作原理是什基因工程常用的工具酶有哪些，它们的工作原理是什么。么。3.重组重组DNA技术包括哪些主要步骤，基因克隆对载体有技术包括哪些主

39、要步骤，基因克隆对载体有什么要求。什么要求。4.简述简述cDNA文库构建的原理和过程。文库构建的原理和过程。5.简述简述T-DNA标签克隆基因的原理与技术流程。标签克隆基因的原理与技术流程。6.农杆菌介导的遗传转化需要具备哪些条件？其技术流农杆菌介导的遗传转化需要具备哪些条件？其技术流程如何？影响转化效率的因素有哪些？程如何？影响转化效率的因素有哪些？7.简述转基因生物检测与鉴定的方法和工作原理。简述转基因生物检测与鉴定的方法和工作原理。8.结合所学知识，谈一下基因工程有哪些应用价值。结合所学知识，谈一下基因工程有哪些应用价值。第第4节节 转基因生物的检测与鉴定转基因生物的检测与鉴定一、分子检

40、测一、分子检测二、二、生物学性状鉴定生物学性状鉴定PCRSouthern杂交杂交Northern杂交杂交Western杂交杂交常用的转基因生物分子检测手段有常用的转基因生物分子检测手段有一、分子检测一、分子检测PCR检测检测转基因棉花选择标记基因转基因棉花选择标记基因NPTII编码区段的编码区段的PCR扩增结果（扩增结果（M为分子量标准，为分子量标准，C为非转基为非转基因植株，因植株，P为质粒对照，为质粒对照，1-20为转基因植株）为转基因植株）Southern杂交杂交(Southern blotting)将将DNA用限制性酶酶切用限制性酶酶切酶切酶切DNA电泳电泳变性变性转移到膜上转移到膜上

41、经过标记的经过标记的DNA探针与探针与膜上的膜上的DNA片段杂交片段杂交洗去膜上非特异性结洗去膜上非特异性结合的探针合的探针检测杂交信号检测杂交信号。如果转移的膜上具有与杂交探针相同或部如果转移的膜上具有与杂交探针相同或部分同源的序列，就会检测到杂交带信号。分同源的序列，就会检测到杂交带信号。Southern blottingM 1 2 3 4 5 6 7 8 9kb23.1-9.4-6.6-4.4-2.3-2.0-转基因棉花的转基因棉花的Southern杂交检测（杂交检测（M为分子为分子量标准，量标准，1为阳性对照，为阳性对照，2为阴性对照，为阴性对照，3-8为转基因植株）为转基因植株）No

42、rthernNorthern杂交是一种杂交是一种RNA-DNARNA-DNA杂交。杂交。Northern杂交杂交Western杂交杂交二二 生物学性状鉴定生物学性状鉴定转基因棉花饲喂棉铃虫时被食用情况（左图为转转基因棉花饲喂棉铃虫时被食用情况（左图为转基因抗虫棉，右图为非转基因棉）基因抗虫棉，右图为非转基因棉）抗性鉴定抗性鉴定第第 5节节 基因工程的应用基因工程的应用及安全性评价及安全性评价 一些重要的发现是借助基因工程技术完成的，如基一些重要的发现是借助基因工程技术完成的，如基因结构的重叠现因结构的重叠现1.基因工程是生物科学基础研究的重要手段基因工程是生物科学基础研究的重要手段功能基因研究

43、是生物科学研究的一大热点领域，分功能基因研究是生物科学研究的一大热点领域，分离和克隆基因并验证其功能，对于阐明基因的调控、离和克隆基因并验证其功能，对于阐明基因的调控、作用方式等十分重要。作用方式等十分重要。基因工程在细胞分化、胚胎发育、细胞识别、癌变基因工程在细胞分化、胚胎发育、细胞识别、癌变产生、免疫机制、生物进化、形态建成、产量和品产生、免疫机制、生物进化、形态建成、产量和品质的形成规律、生物与环境的信号识别等方面的研质的形成规律、生物与环境的信号识别等方面的研究中具有重要用途。究中具有重要用途。u利用转基因技术改良植物已取得很大进展并利用转基因技术改良植物已取得很大进展并在生产上应用在

44、生产上应用。2.利用基因工程改良植物利用基因工程改良植物19961996年转基因作物在生产上使用。年转基因作物在生产上使用。20032003年转基因抗年转基因抗虫和抗除草剂的作物分别达到虫和抗除草剂的作物分别达到10001000万和万和50005000万公顷万公顷左右。美国的转基因棉花达到总播种面积的左右。美国的转基因棉花达到总播种面积的80%80%左右，左右，全球的转基因棉花已达到全球的转基因棉花已达到50%50%的面积。的面积。目前的转基因作物主要是转基因的大豆、玉米、油目前的转基因作物主要是转基因的大豆、玉米、油菜和棉花。种植区域主要分布在美洲。作物的抗逆、菜和棉花。种植区域主要分布在美

45、洲。作物的抗逆、抗病、品质改良、风味的改变都将成为作物基因工抗病、品质改良、风味的改变都将成为作物基因工程研究的重要方向。程研究的重要方向。3.利用基因工程改良动物利用基因工程改良动物将人的将人的抗胰蛋白酶抗胰蛋白酶-1基因基因克隆在羊奶产克隆在羊奶产生相关基因启动子的下游，这种启动子仅在生相关基因启动子的下游，这种启动子仅在乳腺细胞中表达。将这个嵌合基因注射到已乳腺细胞中表达。将这个嵌合基因注射到已授精的羊的合子中，再放植到母羊体内，产授精的羊的合子中，再放植到母羊体内，产下的转基因羊发育正常。交配后产生的羊奶下的转基因羊发育正常。交配后产生的羊奶中含有大量有功能的人类抗胰蛋白酶中含有大量有

46、功能的人类抗胰蛋白酶(每升每升35克克)，这一结果说明可利用家禽作为，这一结果说明可利用家禽作为生物生物反应器反应器，生产人类大量需要的重要蛋白质。，生产人类大量需要的重要蛋白质。真正将基因工程工业在实际中应用，需要解决很多真正将基因工程工业在实际中应用，需要解决很多实际问题，如筛选宿主系统。细菌、真菌、植物、实际问题，如筛选宿主系统。细菌、真菌、植物、哺乳动物和昆虫细胞培养系统都可以成为合适的宿哺乳动物和昆虫细胞培养系统都可以成为合适的宿主系统。另外一个重要的问题就是克隆到所需要的主系统。另外一个重要的问题就是克隆到所需要的基因和构建高效的表达载体。最后是产品的收集、基因和构建高效的表达载体

47、。最后是产品的收集、纯化技术。纯化技术。4.基因工程工业基因工程工业生产所需要的蛋白质。生产所需要的蛋白质。花卉工业。改变花卉的花色或外观。花卉工业。改变花卉的花色或外观。生物采矿、药物生产、工业原料生产方面。生物采矿、药物生产、工业原料生产方面。在动物体内胰岛素是在动物体内胰岛素是胰腺细胞先形成一种前胰腺细胞先形成一种前体胰岛素，再加工成两体胰岛素，再加工成两条不同的成熟胰岛素原条不同的成熟胰岛素原分子，分子，A链含链含21个氨基酸个氨基酸残基，残基，B链含链含30个氨基酸个氨基酸残基，经两对二硫键连残基，经两对二硫键连接形成成熟的胰岛素。接形成成熟的胰岛素。利用植物生产重组蛋白。包括抗体、

48、疫苗、利用植物生产重组蛋白。包括抗体、疫苗、调节蛋白和酶等。调节蛋白和酶等。1988年第一个利用烟草生年第一个利用烟草生产重组抗体获得成功。产重组抗体获得成功。5.疾病诊断与基因治疗。疾病诊断与基因治疗。利用植物生产药物具有如下优点：栽培费用利用植物生产药物具有如下优点：栽培费用低、产量高；从基因到蛋白所需用的时间相低、产量高；从基因到蛋白所需用的时间相对较短；需要资金少；治疗风险小。对较短；需要资金少；治疗风险小。遗传疾病诊断遗传疾病诊断RFLP 法法生物治疗生物治疗：利用微生物降解环境中的毒素和危险化：利用微生物降解环境中的毒素和危险化合物。合物。6.生物工程与环境保护。生物工程与环境保护

49、。废物处理：废物处理：也是利用微生物降解废物，使之转化为也是利用微生物降解废物，使之转化为二氧化碳和甲烷，后者可以用作生物能源燃料。二氧化碳和甲烷，后者可以用作生物能源燃料。制作诊断工具：制作诊断工具：研制人类、动植物主要流行性疾病研制人类、动植物主要流行性疾病的早期探测试剂盒，做到疾病的早期预防和控制。的早期探测试剂盒，做到疾病的早期预防和控制。植物诊断：植物诊断：利用植物消除环境中的污染或使其转化利用植物消除环境中的污染或使其转化为无害的物质。比如，利用某些植物吸收土壤中的重为无害的物质。比如，利用某些植物吸收土壤中的重金属，可以缓解土壤中的重金属污染。利用生物工程金属，可以缓解土壤中的重

50、金属污染。利用生物工程技术生产工程菌，用作肥料，提高肥料的利用率，降技术生产工程菌，用作肥料，提高肥料的利用率，降低化学肥料使用量，从而降低肥料对地下水的污染低化学肥料使用量，从而降低肥料对地下水的污染 1.外源基因的毒性2.潜在的过敏反应3.抗生素抗性风险4.营养品质的改变5.“超级杂草”与生物多样性二、转基因植物的全性评价二、转基因植物的全性评价三、转基因食物的全性评价三、转基因食物的全性评价本章重点本章重点基因工程的一般步骤基因工程的一般步骤限制酶和载体限制酶和载体基因分离（基因分离（PCR）转基因（转基因（southern）作业作业复习题复习题1.什么是遗传工程，它主要包括哪些方面。什