《酶的分离纯化》PPT课件.ppt

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1、第三章第三章 酶的分离纯化与保存酶的分离纯化与保存l酶的分离纯化是酶学研究的重要环节之一。酶的分离纯化是酶学研究的重要环节之一。l针对化学本质是蛋白质的酶而言，其分离纯化针对化学本质是蛋白质的酶而言，其分离纯化的方法主要沿用的方法主要沿用蛋白质分离提纯蛋白质分离提纯的方法。的方法。l酶的分离纯化又有其自身特点：酶的分离纯化又有其自身特点：难点：目标酶在细胞中含量少难点：目标酶在细胞中含量少优势：可通过测定酶活性的方法进行示踪优势：可通过测定酶活性的方法进行示踪l酶的分离纯化是一门实验科学酶的分离纯化是一门实验科学l酶的分离纯化酶的分离纯化，就是将，就是将酶从细胞或者其他含酶酶从细胞或者其他含酶

2、的原料中释放出来，再的原料中释放出来，再与杂质分开，而获得符与杂质分开，而获得符合研究和使用要求的酶合研究和使用要求的酶制品的过程制品的过程细胞结构与酶分布l胞内酶：在细胞中，酶在核糖体上合成后，即转运到胞内酶：在细胞中，酶在核糖体上合成后，即转运到各个作用部位，并不断补充和更新各个作用部位，并不断补充和更新l胞外酶：合成后穿过质膜，定域到质膜外表面、周质胞外酶：合成后穿过质膜，定域到质膜外表面、周质空间、外膜及细胞外环境中的酶空间、外膜及细胞外环境中的酶l不同的酶分离纯化的方法不同：胞内产物需经细胞破不同的酶分离纯化的方法不同：胞内产物需经细胞破碎，细胞碎片分离等步骤；胞外产物则将细胞去除后

3、，碎，细胞碎片分离等步骤；胞外产物则将细胞去除后，对余下的液体即可进行初步纯化对余下的液体即可进行初步纯化 选用技术前，需考虑：选用技术前，需考虑：l1.1.目标酶分子特性及其他物理、化学性质目标酶分子特性及其他物理、化学性质l2.2.酶分子和杂质的主要性质差异酶分子和杂质的主要性质差异l3.3.酶的使用目的和要求酶的使用目的和要求l4.4.技术实施的难易程度技术实施的难易程度l5.5.分离成本的高低分离成本的高低l6.6.是否造成环境污染是否造成环境污染不同酶的分离、提纯方法，主要根据不同酶的分离、提纯方法，主要根据：酶分子之间各种选择性的差异酶分子之间各种选择性的差异 分子大小和形状分子大

4、小和形状酸碱性质酸碱性质溶解度溶解度吸收性质吸收性质对其他分子的生物学亲和力对其他分子的生物学亲和力 等等等等酶的提取、分离纯化技术路线酶的提取、分离纯化技术路线细胞破碎细胞破碎酶提取酶提取酶分离纯化酶分离纯化酶浓缩酶浓缩酶贮存酶贮存动物、植物或微生物细胞动物、植物或微生物细胞发酵液发酵液离心分离，过滤分离，沉淀分离心分离，过滤分离，沉淀分离，层析分离，电泳分离，萃离，层析分离，电泳分离，萃取分离，结晶分离等。取分离，结晶分离等。酶的分离纯化可以分为三个阶段酶的分离纯化可以分为三个阶段1 1、粗蛋白：多使用盐析沉淀法，可以粗略去除蛋白质以、粗蛋白：多使用盐析沉淀法，可以粗略去除蛋白质以外的物质

5、；外的物质；2 2、部分纯化：使用各种层析法；、部分纯化：使用各种层析法；3 3、均质酶：目标酶的进一步精制纯化，常用电泳或者色、均质酶：目标酶的进一步精制纯化，常用电泳或者色谱法。谱法。l主要过程：主要过程：细胞破碎细胞破碎 酶的提取酶的提取 离心分离离心分离 过滤过滤 沉淀沉淀 层析层析 电泳电泳 萃取萃取浓缩浓缩干燥干燥 结结晶晶 保存。保存。一、酶分子制备的前处理一、酶分子制备的前处理 1 1、生物材料的选择、生物材料的选择l选择目的酶含量高的选择目的酶含量高的l选择容易取材的选择容易取材的l利用细胞培养技术和基因工程重组利用细胞培养技术和基因工程重组DNADNA技术。技术。l目前，酶

6、的来源大都为来自微生物目前，酶的来源大都为来自微生物 l材料选定后要尽可能保持新鲜，尽快材料选定后要尽可能保持新鲜，尽快加工处理，如暂不提取，应冰冻保存，加工处理，如暂不提取，应冰冻保存，且动物材料则需深度冷冻保存：且动物材料则需深度冷冻保存：l动物组织要先除去结缔组织、脂肪等，绞碎动物组织要先除去结缔组织、脂肪等，绞碎后在适当的溶剂中提取。如果所要求的成分后在适当的溶剂中提取。如果所要求的成分在细胞内，则要先破碎细胞。在细胞内，则要先破碎细胞。l植物要先去壳、除脂。植物要先去壳、除脂。l微生物材料要及时将菌体与发酵液分开。微生物材料要及时将菌体与发酵液分开。2 2、细胞的破碎细胞的破碎l将细

7、胞和组织破碎，使酶分子（胞内酶）充分释将细胞和组织破碎，使酶分子（胞内酶）充分释放到溶液中，并不丢失生物活性。放到溶液中，并不丢失生物活性。l不同的生物体或同一生物体的不同部位的组织，不同的生物体或同一生物体的不同部位的组织，其细胞破碎的难易不一，使用的方法也不相同其细胞破碎的难易不一，使用的方法也不相同如动物脏器的细胞膜较脆弱，容易破碎，植物和微生如动物脏器的细胞膜较脆弱，容易破碎，植物和微生物由于具有较坚固的纤维素、半纤维素组成的细胞物由于具有较坚固的纤维素、半纤维素组成的细胞壁，要采取专门的细胞破碎方法。壁，要采取专门的细胞破碎方法。机械破碎捣碎法研磨法匀浆法 物理破碎温度差破碎法压力差

8、破碎法超声波破碎法 化学破碎有机溶剂：甲苯、丙酮丁醇、氯仿表面活性剂：Triton、Tween酶促破碎（酶解破碎）自溶法外加酶制剂法通过机械运动产生的剪切通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。力，使组织、细胞破碎。通过各种物理因素的作用，通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。坏，而使细胞破碎。通过各种化学试剂对细胞通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎膜的作用，而使细胞破碎通过细胞本身的酶系或外通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎而达到细胞破碎

9、细细胞破碎方法及其原理胞破碎方法及其原理机械法（注意预冷）：机械法（注意预冷）：l捣碎法：捣碎法：10000rpm10000rpml研磨法：研磨法：l匀浆法：研杆和管壁匀浆法：研杆和管壁间只有几百微米间只有几百微米DY89-I型型 电动玻璃匀玻璃匀浆机机物理法：物理法：l反复冻融法：时间长，需加蛋反复冻融法：时间长，需加蛋白酶抑制剂（白酶抑制剂（PMSFPMSF、EDTAEDTA等）等）l超声波处理法：处理时间尽量超声波处理法：处理时间尽量短，避免局部过热使得酶失活短，避免局部过热使得酶失活 l渗透压法：渗透压法：l冷热交替法：冷热交替法：JY92-II D超声波超声波细胞粉碎机胞粉碎机高压细

10、胞破碎机高压细胞破碎机 动物动物 细菌细菌 植物植物研磨研磨超声波超声波 纤维素酶纤维素酶 匀浆匀浆溶菌酶溶菌酶 捣碎机捣碎机化学溶剂化学溶剂 (甲苯甲苯)提取液提取液 3.3.生物大分子的提取（抽提）生物大分子的提取（抽提）l“提取提取”是在分离纯化之前将经过预处理或破碎是在分离纯化之前将经过预处理或破碎的细胞置于溶剂中，使被分离的生物大分子充分的细胞置于溶剂中，使被分离的生物大分子充分地释放到溶剂中，并尽可能保持原来的天然状态地释放到溶剂中，并尽可能保持原来的天然状态不丢失生物活性的过程。不丢失生物活性的过程。l酶的定位不同，其提纯难度也不相同酶的定位不同，其提纯难度也不相同l“固相转入液

11、相固相转入液相”，或，或“从细胞内的生理状况转从细胞内的生理状况转入外界特定的溶液中入外界特定的溶液中”。相似相溶相似相溶l酶提取时首先应根据酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂。适当的溶剂。l一般说来，极性物质易溶于极性溶剂中一般说来，极性物质易溶于极性溶剂中（水、稀（水、稀酸、稀碱、稀盐溶液等）酸、稀碱、稀盐溶液等），非极性物质易溶于非，非极性物质易溶于非极性的有机溶剂中，酸性物质易溶于碱性溶剂中，极性的有机溶剂中，酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶剂中碱性物质易溶于酸性溶剂中l提高温度，降低溶液粘度、增加扩散面积、縮短提高温度，降低溶液

12、粘度、增加扩散面积、縮短扩散距离，增大浓度差等都有利于提高酶分子的扩散距离，增大浓度差等都有利于提高酶分子的扩散速度，从而增大提取效果。扩散速度，从而增大提取效果。l为了提高酶的提取率并防止酶的变性失活，在为了提高酶的提取率并防止酶的变性失活，在提取过程中还要注意控制好温度、提取过程中还要注意控制好温度、pHpH值等提取值等提取条件。条件。盐溶液提取：盐溶液提取：l一般以一般以低盐溶液低盐溶液(0.05-0.2mol/L)(0.05-0.2mol/L)为主。稀盐溶为主。稀盐溶液和缓冲液对蛋白质的稳定性好，溶解度大，液和缓冲液对蛋白质的稳定性好，溶解度大，是提取蛋白质和酶最常用的溶剂。是提取蛋白

13、质和酶最常用的溶剂。盐溶：在低盐浓度条件下，酶的溶解度随盐溶：在低盐浓度条件下，酶的溶解度随盐浓度增大而增大盐浓度增大而增大盐析：当盐浓度达到一定界限后，酶的溶盐析：当盐浓度达到一定界限后，酶的溶解度随着盐浓度增大而降低解度随着盐浓度增大而降低l大多数蛋白类酶都溶于水，而且在低浓大多数蛋白类酶都溶于水，而且在低浓度的盐存在的条件下，酶的溶解度随盐度的盐存在的条件下，酶的溶解度随盐浓度的升高而增加，这称为盐溶现象。浓度的升高而增加，这称为盐溶现象。(2)(2)稀酸（碱）溶液提取稀酸（碱）溶液提取l在偏离等电点左右，溶解度增大在偏离等电点左右，溶解度增大l根据等电点，选择合适的根据等电点，选择合适

14、的pHpHl注意，不能采用极端注意，不能采用极端pHpH值，操作时要注意避免值，操作时要注意避免局部过酸或过碱局部过酸或过碱(3)(3)变性剂的使用变性剂的使用如：脲、胍等如：脲、胍等l膜（蛋白）酶，包涵体形式的酶等膜（蛋白）酶，包涵体形式的酶等l有变性剂，蛋白结构松散，易于溶解有变性剂，蛋白结构松散，易于溶解l去除变性剂，又可恢复原来构象去除变性剂，又可恢复原来构象典型的抽提液组成典型的抽提液组成l离子强度调节剂：蔗糖、离子强度调节剂：蔗糖、KClKCl、NaClNaCl等等lpHpH缓冲剂：各种缓冲液缓冲剂：各种缓冲液l温度效应剂：温度效应剂：DMSODMSO、甘油、甘油l蛋白酶抑制剂：蛋

15、白酶抑制剂：PMSFPMSF、亮肽素、亮肽素l抗氧化剂抗氧化剂:DTT,:DTT,巯基乙醇巯基乙醇l重金属络合剂：重金属络合剂：EDTAEDTAl增溶剂：增溶剂：Triton-100Triton-100（4 4）有机溶剂提取有机溶剂提取l一些和脂类结合比较牢固或分子中非极性侧链较一些和脂类结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶。多的蛋白质和酶。l常用的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、正丁酮常用的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、正丁酮等，这些溶剂可以与水互溶或部分互溶，同时具等，这些溶剂可以与水互溶或部分互溶，同时具有亲水性和亲脂性，因此常用来提取与脂结合较有亲水性和亲脂性，因此常用来提取与

16、脂结合较牢或含非极性侧链较多的蛋白质、酶和脂类。牢或含非极性侧链较多的蛋白质、酶和脂类。酶酶的主要提取方法的主要提取方法提取方法提取方法使用的溶使用的溶剂剂或溶液或溶液提取提取对对象象盐盐溶液溶液0.020.020.5mol/L0.5mol/L的的盐盐溶液溶液用于提取在低用于提取在低浓浓度度盐盐溶液中溶解度溶液中溶解度较较大的大的酶酶酸溶液酸溶液PH2PH26 6的水溶液的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大，用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且且稳稳定性定性较较好的好的酶酶碱溶液碱溶液PH8PH81212的水溶液的水溶液用于提取在稀碱溶液中溶解度大且用于提取在稀碱溶液中溶解度大且稳稳定性定性较较好

17、的好的酶酶有机溶有机溶剂剂可与水混溶的有机溶可与水混溶的有机溶剂剂用于提取那些与脂用于提取那些与脂质结质结合牢固或含合牢固或含有有较较多非极性基多非极性基团团的的酶酶二、酶分离纯化的基本技术（简介）二、酶分离纯化的基本技术（简介）l溶解度：盐析、沉淀溶解度：盐析、沉淀l分子大小：离心、凝胶层析、过滤分子大小：离心、凝胶层析、过滤l电荷：离子交换层析、电泳电荷：离子交换层析、电泳l亲和性：亲和层析亲和性：亲和层析l萃取萃取l结晶结晶l等等等等(一一)沉淀沉淀 根据不同物质在溶剂中的根据不同物质在溶剂中的 溶解度不同而分离溶解度不同而分离沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程沉淀是溶液中的溶质

18、由液相变成固相析出的过程溶解度的大小与溶质和溶剂的化学性质及结构有溶解度的大小与溶质和溶剂的化学性质及结构有关，溶剂组分的改变或加入某些沉淀剂以及改变关，溶剂组分的改变或加入某些沉淀剂以及改变溶液的溶液的pHpH值、离子强度和极性都会使溶质的溶解值、离子强度和极性都会使溶质的溶解度产生明显的改变。度产生明显的改变。+带正电荷的蛋白质带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质在等电点的蛋白质水化膜水化膜+带正电荷的蛋白质带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗粒不稳定的蛋白质颗粒酸酸碱碱酸酸碱碱酸酸碱碱脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用

19、溶液中蛋白质的聚沉溶液中蛋白质的聚沉酶分子制备中最常用的几种沉淀方法酶分子制备中最常用的几种沉淀方法 中性盐沉淀（盐析法）：中性盐沉淀（盐析法）：有机溶剂沉淀：有机溶剂沉淀：选择性沉淀选择性沉淀 等电点沉淀：等电点沉淀：有机聚合物沉淀：有机聚合物沉淀：聚乙二醇聚乙二醇中性盐的亲水性大于蛋白质和酶分子的亲水性，所中性盐的亲水性大于蛋白质和酶分子的亲水性，所以加入大量中性盐后，夺走了水分子，以加入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水膜破坏了水膜，暴露出疏水区域，同时又暴露出疏水区域，同时又中和了电荷中和了电荷，破坏了亲水，破坏了亲水胶体，蛋白质分子即形成沉淀。胶体，蛋白质分子即形成沉淀。优点是：优

20、点是：成本低，不需要特别昂贵的设备。成本低，不需要特别昂贵的设备。操操作简单、安全。作简单、安全。对许多生物活性物质具有稳定作对许多生物活性物质具有稳定作用。用。1 1、中性盐沉淀、中性盐沉淀在盐浓度达到某一界限后，酶的溶解在盐浓度达到某一界限后，酶的溶解度随盐浓度升高而降低，这称为盐析度随盐浓度升高而降低，这称为盐析现象。现象。中性盐的选择中性盐的选择 常用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫常用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠、磷酸钠等，其中最重要的是酸镁、氯化钠、磷酸钠等，其中最重要的是（NHNH4 4）2 2SOSO4 4：溶解度大：溶解度大：尤其是在低温时仍有相当高的

21、溶解尤其是在低温时仍有相当高的溶解度（酶和各种蛋白质通常是在低温下稳定，盐度（酶和各种蛋白质通常是在低温下稳定，盐析操作也要求在低温下（析操作也要求在低温下（0 044）进行）进行）0020208080100 100（NHNH4 4）2 2SOSO4 470.670.675.475.495.395.3103103NaNa2 2SOSO4 44.94.918.918.943.343.342.242.2NaHNaH2 2POPO4 41.61.67.87.893.893.8101101 分离效果好：分离效果好：有的提取液加入适量硫酸铵盐析，有的提取液加入适量硫酸铵盐析，一步就可以除去一步就可以除去

22、7575的杂蛋白，纯度提高了四倍。的杂蛋白，纯度提高了四倍。不易引起变性不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的作用，有稳定酶与蛋白质结构的作用。有的酶或蛋白质用有的酶或蛋白质用2 23mol/L3mol/L的的(NH(NH4 4)2 2SOSO4 4保存可达数保存可达数年之久。年之久。可以分级可以分级沉淀沉淀:半饱和硫酸铵溶液可沉淀血浆球蛋半饱和硫酸铵溶液可沉淀血浆球蛋白，而饱和硫酸铵溶液可沉淀血浆清蛋白白，而饱和硫酸铵溶液可沉淀血浆清蛋白。价格便宜，废液不污染环境。价格便宜，废液不污染环境。影响盐析的因素影响盐析的因素盐饱和度的影响盐饱和度的影响 不同的蛋白质，所需的饱和度不同不同的蛋白质，所

23、需的饱和度不同蛋白质浓度的影响蛋白质浓度的影响 在相同的盐析条件下，蛋白质浓度越大越易沉在相同的盐析条件下，蛋白质浓度越大越易沉淀淀蛋白质的浓度愈高，其它蛋白质的共沉作用也蛋白质的浓度愈高，其它蛋白质的共沉作用也愈强，分辨率降低，一般常将蛋白质浓度控制愈强，分辨率降低，一般常将蛋白质浓度控制在在2 23 3 为宜为宜pHpH的影响的影响但硫酸铵具腐蚀性且缓冲能力差，但硫酸铵具腐蚀性且缓冲能力差，饱和溶液的饱和溶液的pHpH值在值在之间，使用时多用浓氨水调整到之间，使用时多用浓氨水调整到pH7pH7左右。进行盐析时的左右。进行盐析时的pHpH，要选择在被盐析的蛋白质，要选择在被盐析的蛋白质的的p

24、IpI附近附近温度的影响温度的影响 在高盐浓度下，它们的溶解度随在高盐浓度下，它们的溶解度随温度的升高反而降低。另外，高温还易导致蛋白质变温度的升高反而降低。另外，高温还易导致蛋白质变性。蛋白质的盐析一般在室温下进行。性。蛋白质的盐析一般在室温下进行。注意事项：注意事项：l添加固体时，要加粉末状的盐添加固体时，要加粉末状的盐l并且缓慢分批添加并且缓慢分批添加l并缓缓搅拌，避免局部浓度过高并缓缓搅拌，避免局部浓度过高l且注意不要产生泡沫且注意不要产生泡沫2 2、有机溶剂沉淀、有机溶剂沉淀 有机溶剂对于许多蛋白质（酶）、核酸、多有机溶剂对于许多蛋白质（酶）、核酸、多糖和小分子生化物质都能发生沉淀作

25、用，是较早糖和小分子生化物质都能发生沉淀作用，是较早使用的沉淀方法之一。使用的沉淀方法之一。有机溶剂之所以能使酶沉淀析出。主要是由于有机溶剂的存在会使溶液的介电常数降低。例如，20时水的介电常数为80，而82乙醇水溶液的介电常数为40。溶液的介电常数降低，就使溶质分子间溶液的介电常数降低，就使溶质分子间的静电引力增大，互相吸引而易于凝集，同时，对于具有水膜的分的静电引力增大，互相吸引而易于凝集，同时，对于具有水膜的分子来说，有机溶剂与水互相作用，使溶质分子表面的水膜破坏，也子来说，有机溶剂与水互相作用，使溶质分子表面的水膜破坏，也使其溶解度降低而沉淀析出。使其溶解度降低而沉淀析出。常用于酶的沉

26、淀分离的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等常用于酶的沉淀分离的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等 基本原理基本原理有机溶剂沉淀主要是有机溶剂沉淀主要是降低水溶液的介电常数降低水溶液的介电常数，减小溶剂的极，减小溶剂的极性，削弱溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，增加了蛋性，削弱溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，增加了蛋白质分子间的相互作用，导致蛋白质溶解度降低而沉淀。白质分子间的相互作用，导致蛋白质溶解度降低而沉淀。由于使用的有机溶剂与水互溶，它们在溶解于水的同时从蛋由于使用的有机溶剂与水互溶，它们在溶解于水的同时从蛋白质分子周围的水化层中夺走了水分子，白质分子周围的水化层中夺走了水分子

27、，破坏了蛋白质分子破坏了蛋白质分子的水膜的水膜，因而发生沉淀作用，因而发生沉淀作用溶液介电常数的减少就意味着溶质分子异性电荷库仑引力的溶液介电常数的减少就意味着溶质分子异性电荷库仑引力的增加，使增加，使带电溶质分子更易互相吸引而凝集带电溶质分子更易互相吸引而凝集，从而发生沉淀。，从而发生沉淀。优点：优点：分辨能力比盐析法高，即一种蛋白质或其他溶分辨能力比盐析法高，即一种蛋白质或其他溶质质 只在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉淀。只在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉淀。沉淀不用脱盐，过滤比较容易（如有必要，可沉淀不用脱盐，过滤比较容易（如有必要，可用透析袋脱有机溶剂）。用透析袋脱有机溶剂）。缺点

28、：对某些具有生物活性的大分子容易引起变性缺点：对某些具有生物活性的大分子容易引起变性失活，操作需在低温下进行。失活，操作需在低温下进行。3 3、选择性变性沉淀法、选择性变性沉淀法 利用蛋白质、酶与核酸等生物大分子与非目的利用蛋白质、酶与核酸等生物大分子与非目的生物大分子在生物大分子在物理化学性质物理化学性质等方面的差异，选等方面的差异，选择一定的条件使杂蛋白等择一定的条件使杂蛋白等非目的物变性沉淀非目的物变性沉淀而而得到分离提纯，称为选择性变性沉淀法。得到分离提纯，称为选择性变性沉淀法。l方法：加热、大幅度改变方法：加热、大幅度改变pHpH，加有机溶剂（丙，加有机溶剂（丙酮、乙醇等）、加重金属

29、离子如酮、乙醇等）、加重金属离子如AgAg+、CuCu2 2 、PbPb2 2 等、加有机酸如三氯乙酸、水杨酸、等、加有机酸如三氯乙酸、水杨酸、苦味酸、鞣酸、过氯酸等及表面活性剂。苦味酸、鞣酸、过氯酸等及表面活性剂。4 4、等电点沉淀法、等电点沉淀法等电点沉淀法是利用具有不同等电点的两性电解等电点沉淀法是利用具有不同等电点的两性电解质，在达到电中性时溶解度最低，易发生沉淀，质，在达到电中性时溶解度最低，易发生沉淀，从而实现分离的方法。从而实现分离的方法。此法主要用于在分离纯化流程中去除杂蛋白，而此法主要用于在分离纯化流程中去除杂蛋白，而不用于沉淀目的物不用于沉淀目的物氨基酸、蛋白质、酶和核酸都

30、是两性电解质氨基酸、蛋白质、酶和核酸都是两性电解质由于许多蛋白质的等电点十分接近，而且带有水膜的蛋由于许多蛋白质的等电点十分接近，而且带有水膜的蛋白质等生物大分子仍有一定的溶解度，不能完全沉淀析白质等生物大分子仍有一定的溶解度，不能完全沉淀析出，因此，单独使用此法分辨率较低，效果不理想出，因此，单独使用此法分辨率较低，效果不理想因而此法常与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀剂一因而此法常与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀剂一起配合使用，以提高沉淀能力和分离效果。起配合使用，以提高沉淀能力和分离效果。5 5、有机聚合物沉淀法有机聚合物沉淀法l有机聚合物是六十年代发展起来的一类重要的沉淀有机聚合物是

31、六十年代发展起来的一类重要的沉淀剂，最早应用于提纯免疫球蛋白和沉淀一些细菌和剂，最早应用于提纯免疫球蛋白和沉淀一些细菌和病毒。近年来广泛用于核酸和酶的纯化。病毒。近年来广泛用于核酸和酶的纯化。l应用最多的是聚乙二醇应用最多的是聚乙二醇(PEG)(PEG)，它的亲水性强，溶干，它的亲水性强，溶干水和许多有机溶剂，对热稳定，有广泛围的分子量，水和许多有机溶剂，对热稳定，有广泛围的分子量，在生物大分子制备中，用的较多的是分子量为在生物大分子制备中，用的较多的是分子量为600060002000020000的的 PEGPEG。作用机制不明。作用机制不明。优点：优点：操作条件温和，不易引起生物大分子变性。

32、操作条件温和，不易引起生物大分子变性。沉淀效能高，使用很少量的沉淀效能高，使用很少量的PEGPEG即可以沉淀相当即可以沉淀相当多的生物大分子。多的生物大分子。沉淀后有机聚合物容易去除。沉淀后有机聚合物容易去除。（二）（二）透析透析l利用透析袋把大分子蛋白质与小分利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。子化合物分开的方法。l袋内：大分子量的生物大分子袋内：大分子量的生物大分子l袋外：盐和小分子物质袋外：盐和小分子物质l不断扩散透析到，直到袋内外两边不断扩散透析到，直到袋内外两边的浓度达到平衡为止。的浓度达到平衡为止。（三）（三）过滤过滤过滤过滤的分的分类类及其特性及其特性(根据过滤介质

33、截留的物质颗粒大小不同根据过滤介质截留的物质颗粒大小不同)类别类别截留截留颗颗粒大小粒大小截留的主要物截留的主要物质质过滤过滤介介质质粗滤 2m 2m酵母、霉菌、酵母、霉菌、动动物物细细胞、植胞、植物物细细胞、固形物等胞、固形物等滤纸滤纸、滤滤布、布、纤维纤维多多孔陶瓷、孔陶瓷、烧结烧结金属等金属等微滤0.20.22m2m细细菌、灰菌、灰尘尘等等微微滤滤膜、微孔陶瓷膜、微孔陶瓷超滤20200.2m0.2m病毒、生物大分子等病毒、生物大分子等超超滤滤膜膜反渗透 20 20生物小分子、生物小分子、盐盐、离子、离子反渗透膜反渗透膜四种常用膜分离四种常用膜分离过过程的截留特性程的截留特性超滤超滤 超过

34、滤即超滤，超滤是一超过滤即超滤，超滤是一种加压膜分离技术，即在一种加压膜分离技术，即在一定的压力下，使小分子溶质定的压力下，使小分子溶质和溶剂穿过一定孔径的特制和溶剂穿过一定孔径的特制的薄膜，而使大分子溶质不的薄膜，而使大分子溶质不能透过，留在膜的一边，从能透过，留在膜的一边，从而使大分子物质得到了部分而使大分子物质得到了部分的纯化。的纯化。加压加压酶溶液酶溶液超滤膜超滤膜支持栅板支持栅板超滤液超滤液 优点：优点：操作简便，成本低廉，不需增加任何化操作简便，成本低廉，不需增加任何化学试剂，尤其是超滤技术的实验条件温和，与学试剂，尤其是超滤技术的实验条件温和，与蒸发、冰冻干燥相比没有相的变化，而

35、且不引蒸发、冰冻干燥相比没有相的变化，而且不引起温度、起温度、pHpH的变化，因而可以防止生物大分子的变化，因而可以防止生物大分子的变性、失活和自溶。的变性、失活和自溶。缺点：缺点：不能直接得到干粉制剂。对于蛋白质溶液，不能直接得到干粉制剂。对于蛋白质溶液，一般只能得到一般只能得到10105050的浓度。的浓度。超滤技术的关键是超滤技术的关键是膜膜。在生物大分子的制备技术中，超滤主要用于生物在生物大分子的制备技术中，超滤主要用于生物大分子的脱盐、脱水和浓缩等。大分子的脱盐、脱水和浓缩等。（四）电泳（四）电泳电泳是指在电场的作用下，这些带电颗粒向着与其电泳是指在电场的作用下，这些带电颗粒向着与其

36、所带电荷性质相反的电极方向移动。所带电荷性质相反的电极方向移动。电泳技术就是利用在电场的作用下，由于待分离样电泳技术就是利用在电场的作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳1 1、聚丙烯酰胺凝胶电泳（、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE)PA

37、GE)l 聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGEPAGE（Polyacrylamide gel electrophoresisPolyacrylamide gel electrophoresis），），是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质。聚丙烯酰胺凝是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质。聚丙烯酰胺凝胶是由单体的丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，胶是由单体的丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，这一聚合过程需要有自由基催化完成。这一聚合过程需要有自由基催化完成。SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSSDSPAGEPAGE）SDS(SDS(十二烷基磺酸钠十二烷基磺酸钠)-)

38、-阴离子表面活性剂即去阴离子表面活性剂即去污剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏污剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构，使蛋白质舒展。蛋白质分子的二级和三级结构，使蛋白质舒展。并且每并且每2 2个氨基酸与一个个氨基酸与一个SDSSDS结合，结合，使得每个蛋白使得每个蛋白质分子所带电荷基本相同。质分子所带电荷基本相同。这样就消除了各种蛋这样就消除了各种蛋白质本身电荷上的差异，白质本身电荷上的差异，电泳迁移率只与蛋白质电泳迁移率只与蛋白质分子量大小有关分子量大小有关制备式电泳通常以不含制备式电泳通常以不含 SDS SDS 的原态的原态 disc-PAGEdisc-

39、PAGE 进行，以便回收进行，以便回收具有活性的蛋白质；蛋白质样本要先经过部分纯化，否则效果不具有活性的蛋白质；蛋白质样本要先经过部分纯化，否则效果不佳，并先以分析式电泳确定所要色帶的位置。佳，并先以分析式电泳确定所要色帶的位置。有几个方法可以鉴定蛋白质的位置：(1)Coomassie Blue 染色法;(2)活性染色;(3)UV 照射呈像。定位后要把含有目标酶的凝胶切出來，进行电泳分离，获得酶（五）离心（五）离心 离心技术主要用于各种生物样品的分离和制备，生离心技术主要用于各种生物样品的分离和制备，生物样品悬浮液在高速旋转下，由于巨大的离心力作物样品悬浮液在高速旋转下，由于巨大的离心力作用，

40、使悬浮的微小颗粒（细胞器、生物大分子的沉用，使悬浮的微小颗粒（细胞器、生物大分子的沉淀等）以一定的速度沉降，从而与溶液得以分离，淀等）以一定的速度沉降，从而与溶液得以分离，而沉降速度取决于颗粒的质量、大小和密度。而沉降速度取决于颗粒的质量、大小和密度。密度梯度区带离心法（简称区带离心法）密度梯度区带离心法（简称区带离心法）差速离心法差速离心法（六）层析（六）层析l层析法又称色谱法（层析法又称色谱法（ChromatographyChromatography），是一），是一种基于被分离物质的物理、化学及生物学特性种基于被分离物质的物理、化学及生物学特性的不同，使各组分以不同程度分布在两个相中，的不

41、同，使各组分以不同程度分布在两个相中，其中一个相为固定的其中一个相为固定的(称为固定相称为固定相)，另一个相，另一个相则流过此固定相则流过此固定相(称为流动相称为流动相)并使各组分以不并使各组分以不同速度移动，从而达到分离同速度移动，从而达到分离。层层析分离方法析分离方法 层层析方法析方法分离依据分离依据吸附吸附层层析析利用吸附利用吸附剂对剂对不同物不同物质质的的吸附力吸附力不同而使混合物中不同而使混合物中各各组组分分离分分离分配分配层层析析利用各利用各组组分在两相中的分在两相中的分配系数分配系数不同，而使各不同，而使各组组分分分离分离离子交离子交换层换层析析利用离子交利用离子交换剂换剂上的可

42、解离基上的可解离基团团（活性基（活性基团团）对对各各种离子的种离子的亲亲和力和力不同而达到分离目的不同而达到分离目的凝胶凝胶层层析析以各种多孔凝胶以各种多孔凝胶为为固定相，利用流固定相，利用流动动相中所含各种相中所含各种组组分的分的相相对对分子分子质质量量不同而达到物不同而达到物质质分离分离亲亲和和层层析析利用生物分子与配基之利用生物分子与配基之间间所具有的所具有的专专一而又可逆的一而又可逆的亲亲和力和力，使生物分子分离，使生物分子分离纯纯化化层层析聚焦析聚焦将将酶酶等两性物等两性物质质的的等等电电点特性点特性与离子交与离子交换层换层析的特析的特性性结结合在一起，合在一起，实现组实现组分分离分

43、分离离子交换层析离子交换层析凝胶渗透层析凝胶渗透层析亲和层析亲和层析l-利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，而使生物分子分离纯化的技术亲和力，而使生物分子分离纯化的技术u酶与底物酶与底物u酶与竞争性抑制剂酶与竞争性抑制剂u酶与辅助因子酶与辅助因子u抗原与抗体抗原与抗体u酶酶RNARNA与互补的与互补的RNARNA分子或片段分子或片段uRNARNA与互补的与互补的DNADNA分子或片段分子或片段（七）浓缩、干燥和结晶（七）浓缩、干燥和结晶l浓缩：低浓度浓缩：低浓度 高浓度高浓度离心、沉淀、吸水剂（离心、沉淀、吸水剂（PEGPEG、硅胶等

44、）、硅胶等）蒸发浓缩：通过加热或者减压方法，使得溶液中部蒸发浓缩：通过加热或者减压方法，使得溶液中部分溶剂汽化蒸发，常采用真空浓缩。分溶剂汽化蒸发，常采用真空浓缩。l酶高温失活，酶高温失活，一般在一般在60以下以下，真空条件下进行浓缩或干燥，真空条件下进行浓缩或干燥真空干燥，另外还有冷冻干燥、喷雾干燥、吸附干燥、气真空干燥，另外还有冷冻干燥、喷雾干燥、吸附干燥、气流干燥等。流干燥等。n冷冻干燥冷冻干燥l将酶液降温到冰点以下，使之冻结成固态，将酶液降温到冰点以下，使之冻结成固态，然后在低温状态抽真空，使冰升华，得到然后在低温状态抽真空，使冰升华，得到干燥的酶制剂干燥的酶制剂l酶质量高，结构完整，

45、活力损失少，但是酶质量高，结构完整，活力损失少，但是成本高，适合对热敏感而价值较高的酶类成本高，适合对热敏感而价值较高的酶类n结晶结晶l结晶与沉淀的区别结晶与沉淀的区别沉淀和结晶在本质上同属一种过程，都是新相析出的过程。两沉淀和结晶在本质上同属一种过程，都是新相析出的过程。两者的区别在于构成单位（原子、离子或分子）的排列方式不同者的区别在于构成单位（原子、离子或分子）的排列方式不同在条件变化缓慢时，溶质分子具有足够时间进行排列，有利于在条件变化缓慢时，溶质分子具有足够时间进行排列，有利于结晶形成；相反，当条件变化剧烈，强迫快速析出，溶质分子结晶形成；相反，当条件变化剧烈，强迫快速析出，溶质分子

46、来不及排列就析出，结果形成无定形沉淀。来不及排列就析出，结果形成无定形沉淀。l由于只有同类分子或离子才能排列成晶体，故结晶法具由于只有同类分子或离子才能排列成晶体，故结晶法具有高度的选择性。有高度的选择性。l酶在结晶之前，酶在结晶之前，酶液必须经过纯化达到一定的纯度酶液必须经过纯化达到一定的纯度。总的趋势是。总的趋势是酶的纯度越高，越容易进行结晶。如果酶液纯度太低，不能进行酶的纯度越高，越容易进行结晶。如果酶液纯度太低，不能进行结晶。结晶。通常酶的纯度应当在通常酶的纯度应当在50%50%以上，方能进行结晶。以上，方能进行结晶。l不同的酶对结晶时的纯度要求不同。不同的酶对结晶时的纯度要求不同。有

47、些酶在纯度达到有些酶在纯度达到50%50%时就可能结晶，而有些酶在纯度很高的时就可能结晶，而有些酶在纯度很高的条件下也无法析出结晶。所以酶的结晶并非达到绝对纯化，条件下也无法析出结晶。所以酶的结晶并非达到绝对纯化，只是达到相当的纯度而已。只是达到相当的纯度而已。常用方法：盐析结晶、有机溶剂结晶、透析平衡结晶、等电常用方法：盐析结晶、有机溶剂结晶、透析平衡结晶、等电点结晶等。点结晶等。三、分离纯化方法的选择及基本步骤三、分离纯化方法的选择及基本步骤l生物大分子能否高效率地制备成功，关键在于生物大分子能否高效率地制备成功，关键在于分离纯化方案的正确选择和各个分离纯化方法分离纯化方案的正确选择和各个

48、分离纯化方法实验条件的探索。选择与探索的依据就是生物实验条件的探索。选择与探索的依据就是生物大分子与杂质之间的生物学和物理化学性质上大分子与杂质之间的生物学和物理化学性质上的差异。由本章前述的生物大分子制备的各种的差异。由本章前述的生物大分子制备的各种特点可以看出，特点可以看出，分离纯化方案必然是千变万化分离纯化方案必然是千变万化的的前处理：前处理：粗分离：粗分离：细分级：细分级：结晶：结晶：生物组织生物组织破碎、溶解、离心分离破碎、溶解、离心分离无细胞提取液无细胞提取液盐析、等电点沉淀、盐析、等电点沉淀、超滤、有机溶剂分级超滤、有机溶剂分级层析、电泳层析、电泳精制品精制品结晶或者冻干结晶或者

49、冻干四、分离提纯操作要求四、分离提纯操作要求尽量减少酶活性的损失尽量减少酶活性的损失l低温低温 0 055、有机溶剂：、有机溶剂：-15-15-20-20l抽提液加入抽提液加入EDTAEDTA（络合金属）（络合金属）l抽提液加入巯基乙醇（防止含抽提液加入巯基乙醇（防止含-SH-SH酶失活）酶失活）l不能过度搅拌，以免产生大量泡沫，使酶变性不能过度搅拌，以免产生大量泡沫，使酶变性lpHpH值和盐浓度的控制值和盐浓度的控制l抗菌、抑菌抗菌、抑菌l测定酶的比活力测定酶的比活力 早期分离纯化早期分离纯化l特点：特点：粗提取液中物质成份十分复杂。粗提取液中物质成份十分复杂。欲欲制备的生物大分子浓度很稀。

50、制备的生物大分子浓度很稀。物理化学性质物理化学性质相近的物质很多。相近的物质很多。希望能除去大部分与目的希望能除去大部分与目的产物物理化学性质差异大的杂质。产物物理化学性质差异大的杂质。对所选方法的要求：对所选方法的要求：要快速、粗放。要快速、粗放。能较能较大地缩小体积。大地缩小体积。分辨力不必太高。分辨力不必太高。负荷能负荷能力要大。力要大。可选用的方法：可选用的方法：吸附；萃取；沉淀法（热变性、吸附；萃取；沉淀法（热变性、盐析、有机溶剂沉淀等）；离子交换（批量吸盐析、有机溶剂沉淀等）；离子交换（批量吸附）；亲和层析等。附）；亲和层析等。晚期分离纯化晚期分离纯化 可选用的方法：吸附层析、盐析