南农生物分离工程生物分离.ppt

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1、Ion exchange chromatographyR R+A A-+B+B-R R+B B-+A+A-原理是依据物质所带阴阳离子的不同。电荷不同的物质，对管柱上的离子交换剂有不同的亲和力，改变冲洗液的离子强度和pH值，物质就能依次从层析柱中分离出来沸石软化硬水1935合成酚醛系磺酸型离交树脂60年代大孔型树脂离交纤维素离子交换剂的结构组成是一种含有多元酸或多元碱为功能基团的多孔网状立体结构的固相物单元结构：多孔网状立体结构的骨架不可移动部分功能基团可移动部分离子交换剂的分类 无机物沸石、磷酸钙凝胶1)骨架组成疏水性骨架树脂类有机物多糖类亲水性骨架有机聚合物树脂类（苯乙烯类、酚醛类等）多糖类

2、（葡聚糖、琼脂糖、纤维素等）有机聚合物（聚乙烯醇、聚丙烯酰胺等）微孔型（凝胶型）2)骨架结构大孔型均孔型酸性基团阳离子（强、弱）3)功能基团碱性基团阴离子（强、弱）两性离子交换层析法离子交换层析法离子交换过程离子交换：RA+B+=RB+A+洗脱：RB+C+=RC+B+再生：RC+A+=RA+C+离子交换树脂的优点离子交换树脂的优点是：是：流速快，对小分子物质流速快，对小分子物质的交换容量大，的交换容量大，因而适合用于氨基酸、核苷酸等小因而适合用于氨基酸、核苷酸等小因而适合用于氨基酸、核苷酸等小因而适合用于氨基酸、核苷酸等小分子生化物质的分离纯化。分子生化物质的分离纯化。分子生化物质的分离纯化。

3、分子生化物质的分离纯化。树脂类型树脂类型阳离子交换树脂阳离子交换树脂:含酸性活性基团的树脂。含酸性活性基团的树脂。强酸型：强酸型：RSO3H pH 0-14 不受酸度限制不受酸度限制交换交换洗脱洗脱 弱酸型：弱酸型：RCOOH pH4 ROH 选择性好选择性好,可分离各种有机碱及氨基酸可分离各种有机碱及氨基酸强碱型：强碱型：R N(CH3)3Cl pH 0-14弱碱型：弱碱型：R NH2，RNHCH3 pH 0-7 RN(CH3)2交换交换洗脱洗脱 水化作用水化作用阴离子交换树脂阴离子交换树脂:含碱性活性基团的树脂含碱性活性基团的树脂 724弱酸型PH56789交换容量（meq/g)0.82.

4、58.09.09.0两性树脂热再生树脂脱盐20-25再生70-80RCOOH+RNR2+NaCl=RCOONa+RNR2HCl 螯合树脂：螯合树脂：含有特殊的螯合活性基团含有特殊的螯合活性基团蛋白质通常以离子键吸附，因此要洗脱蛋白质时，必须提高盐浓度以破坏之，大多使用 NaCl；蛋白质吸附在担体上的强弱程度，会影响洗脱所需使用的盐浓度，结合越紧的分子，要使用越高的盐浓度。也可以改变洗脱缓冲液的 pH，使得蛋白质的电荷改变而洗脱出来，一般多使用前者。所使用缓冲液的 pH 不要离目标蛋白质的 pI 太远，否则目标蛋白质带了太强的净电荷，会很强地吸附在离子交换介质上，就必须使用较为剧烈的洗脱条件，可

5、能对蛋白质有所伤害。阳离子交换分离阳离子交换分离（0.1molL-1 HCl为淋洗液）为淋洗液）0100200300400V洗洗(mL)cLi+Na+K+(2molL-1 HCl)K+亲和力大的先被交换上去亲和力大的先被交换上去,后被洗脱下来后被洗脱下来.离子交换树脂的命名 l微孔（普通）型离子交换树脂ABCMl大孔离子交换树脂DABC其中：A分类代号B骨架代号C产品顺序号M交联度强酸001-100弱酸101-200强碱201-300弱碱301-400中强酸401-500交联度=交联剂/（单体+交联剂）100%国内外离子交换树脂相应牌号对照724=1014 弱酸弱酸717=2017 强碱强碱7

6、32=0017 强酸强酸711=2014 HD42=001Amberlite IR系列系列Zerolit 系列系列 神胶系列神胶系列离子交换树脂的制备 一般制备过程一般制备过程l骨架的合成：加聚法骨架的合成：加聚法 或或 缩聚法缩聚法 +交联交联l功功能能基基团团的的引引入入：化化学学反反应应偶偶联联引引入入功功能能基基团团；单单体体本本身身含含有功能基团有功能基团离子交换过程离子交换过程R-B+A+=R-A+B+1.溶液树脂表面“膜扩散”限制2.树脂表面交换中心“粒子扩散”限制(蛋白质大分子）3.A+、B+交换快4.5.逆过程影响因素影响因素1.粒度交换速度2.搅拌速度交换速度3.3.交联度

7、4.4.离子半径、离子价5.5.温度6.6.离子浓度离子交换动力学离子交换动力学原来树脂上离子2，通入离子1取代“交换带”逐渐变窄，离子逐渐分层“漏出点”B影响因素：吸附力A1浓度大交换带宽柱床流速交换速度交换带宽离子交换树脂的性能要求1.交换容量大2.选择性好3.化学性质稳定4.化学动力学性能好5.物理性能好影响因素1.功能基团的数目、种类2.交联度3.骨架、平衡离子主要理化常数测定含水量g/g干树脂烘干法交联度含水量活性基团亲水性、数量膨胀度K膨胀功能基团亲水性、数量，活性离子价，同价离子，半径，骨架结构影响湿真密度R=树脂湿重/排出同体积水重功能基团，湿视比重=树脂湿重/外观容积交换容量

8、交换容量是表征交换剂离子交换能力的主要参数。(exchangecapacity)mmol/g干树脂；mmol/ml湿树脂与功能基团、pH有关交换容量的测定交换容量的测定对对于于阳阳离离子子交交换换剂剂：用HCl将其处理成氢型，称重并测定其含水量；称数克交换剂，加入到过量已知浓度的NaOH溶液，发生交换反应，待反应达到平衡后(强酸性的需要静置24h，弱酸性的需静置数日)，测定剩余的NaOH摩尔数，就可求得阳离子交换剂的交换容量。对于阴离子交换剂对于阴离子交换剂：将阴离子交换剂转换成Cl型后，取一定量的Cl型交换剂，通入Na2SO4,用铬酸钾作指示剂，用硝酸银溶液滴定流出液的Cl-，根据Cl-量计

9、算交换容量。蛋蛋白白质质的的交交换换容容量量：比小分子化合物要小的多。树脂孔道的空间排阻作用大；交换后排阻其他蛋白质的扩散和交换；蛋白质的多电荷与多个交换中心结合滴定曲线滴定曲线全面评价表征交换剂的重要参数方法：方法：1g氢型(或羟型)树脂+x-ml0.1MNaOH/orHCl+0.1MNaCl至50ml(其中1支+50ml0.1MNaCl)+静置24h(对强交换剂)/or7d(对弱交换剂)+测pH+作图意义：意义：强离子交换剂的交换；弱离子交换剂的交换；滴定曲线的转折点确定交换容量；转折点数确定交换基团的种类数；交换容量随pH的变化。离子交换的选择性离子交换的选择性在稀溶液中，在稀溶液中，离

10、子价数越高，结合力越大离子价数越高，结合力越大。在在离离子子间间电电荷荷相相同同时时，则则离离子子的的原原子子序序数数越越高高，水合离子半径越小，结合力亦越大水合离子半径越小，结合力亦越大。交换环境的影响1.pH2.对强树脂，影响交换离子的解离度3.弱交换离子和树脂的解离度4.蛋白质、酶等少用强树脂，影响选择性，不易洗脱，弱树脂可控，洗脱温和2.离子强度3.低离子强度3.有机溶剂4.降低有机分子解离度，树脂倾向于吸附无机离子交联度交联度大、结构紧密、膨胀度小、筛分能力大，选择性大。（无机离子）大分子复杂K膨胀小，空间效应主要K膨胀大，选择性主要交联度不能过大离子筛：链霉素、庆大霉素除Ca2+M

11、g2+灰分辅助力氢键、范德华力（交换离子是有机离子）无机离子K1-10有机离子102-103土霉素对H+K1200功能基团的特殊亲和力羧酸型树脂对Ca2+Cu2+Ni2+偶极离子的排斥作用偶极离子的排斥作用RSO3-Na+H3+NRCHCOO-=RSO3-H3+NRCHCOO-+Na+RSO3-H+H3+NRCHCOO-=RSO3-H3+NRCHCOOHH型没有排斥力，对型没有排斥力，对AA吸附量吸附量AA烃基链加长，排斥力烃基链加长，排斥力丙酮中，羧基解离被抑制，丙酮中，羧基解离被抑制，H型型 Na型对型对AA交换量接近交换量接近AA脱盐脱盐：通过：通过Na型强酸，无机离子被吸附型强酸，无机

12、离子被吸附离子交换操作技术离子交换操作技术1.树脂的选择和处理树脂的选择和处理2.装柱装柱3.交换交换4.洗脱洗脱5.树脂再生树脂再生离离子子交交换换树树脂脂玻璃纤维玻璃纤维交换柱交换柱树脂的选择目的物较强碱、酸性，宜用弱酸、弱碱性树脂弱酸、弱碱性，强碱、强酸性（AA）蛋白、酶等，弱酸、弱碱性孔径树脂有化学稳定性、机械性能处理和再生1.外观与粒度球型，直径为（约16-70目）2.预处理物理处理：过筛、水洗、酒精等浸泡化学处理：8-10倍1mol/LHClNaOH交替浸泡4h732分离AA，酸-碱-酸（转型）碱-酸-碱得Na型阴树脂：最后用NaOH处理得羟型，用HCl得氯型生物大分子：转型后相应

13、缓冲液平衡数小时新3遍，旧2遍再生、转型、毒化3.再生：大量水处理（物理吸附）酸一次，碱一次4.转型：弱酸或弱碱树脂用碱（NaOH）或酸（HCl）5.强酸或强碱树脂用碱、酸，相应盐（NaCl）6.毒化：堵塞孔隙、活性基团脱落、生成不可逆化合物7.常规处理，酸碱加热（40-50）有机溶剂加热，酶化学稳定性阳阴（同种骨架）苯乙烯酚醛丙烯酸型M（金属）H型氯型羟型大孔凝胶交联度大交联度小基本操作方法1.方式2.静态：分批，不适宜多种成分分离3.动态：柱分离，多组分2.洗脱3.动态、静态4.酸、碱洗脱液改变电荷5.盐类高浓度同种电荷离子竞争返回离子交换层析的基本操作离子交换层析的基本操作离子交换层析的

14、基本操作离子交换层析的基本操作层析柱平衡平衡缓冲液的用量至少为柱体积的平衡缓冲液的用量至少为柱体积的 2 2 倍倍平衡缓冲液的流速可略高于正常操作流速平衡缓冲液的流速可略高于正常操作流速平衡终点以流出液的离子浓度、导电性、平衡终点以流出液的离子浓度、导电性、pHpH值值与缓冲液一致与缓冲液一致为准，其中为准，其中pHpH值最重要值最重要 离子交换层析的基本操作离子交换层析的基本操作离子交换层析的基本操作离子交换层析的基本操作样品进柱为了达到满意的分离效果，进样量一般为介质为了达到满意的分离效果，进样量一般为介质交交换容量换容量的的10-20%10-20%为了避免进样溶液中的离子强度过高，样品浓

15、度不为了避免进样溶液中的离子强度过高，样品浓度不宜太高宜太高交换过程洗脱过程离子交换层析的基本操作离子交换层析的基本操作离子交换层析的基本操作离子交换层析的基本操作样品洗脱恒定洗脱恒定洗脱阶段洗脱阶段洗脱梯度洗脱梯度洗脱101020203030404050506060707080809090分子浓度分子浓度离子强度离子强度pHpH值值大孔、均孔树脂凝胶型（微孔型）孔径3nm孔隙率、表面积低亲水性，呈溶胀状态，失水后孔隙消失，非水介质中没有交换能力大孔型离交树脂加不参加反应的填充剂（致孔剂高级醇类），后用有机溶媒溶出与交联度致孔剂种类有关特征：交联度高孔径大（大分子）、交换速度快、“永久性孔隙”

16、、非水溶胀下使用、表面积大孔隙率大、比重小均孔型阴树脂、凝胶型亲水性离子交换剂1)特点亲水性骨架孔度大电荷密度小亲水性离子交换剂 2）分类多糖凝胶类（葡聚糖、琼脂糖、纤维素）骨架组成（Sephadex、Sepharose、Sephacel等）有机聚合物（聚乙烯醇、聚丙烯酰胺等）(Toyopearl、Biogel-P)酸性基团阳离子（强、弱）功能基团（磺丙基SP、羧甲基CM）碱性基团阴离子（强、弱）（季胺乙基QAE、二乙胺基乙基DEAE）命名功能基团+骨架组成如DEAE-Sepharose、SP-SephacelDEAESephadexA50、CMSephadexC75、DE52、CMBio-G

17、elA离子交换纤维素：离子交换纤维素：是携带功能基团是携带功能基团是携带功能基团是携带功能基团纤维素衍生物，具有松散的纤维素衍生物，具有松散的纤维素衍生物，具有松散的纤维素衍生物，具有松散的亲亲亲亲水水水水性性性性网状结构以及较大的表面积，网状结构以及较大的表面积，网状结构以及较大的表面积，网状结构以及较大的表面积，交换基团稀疏、交换基团稀疏、交换基团稀疏、交换基团稀疏、吸附弱，吸附弱，吸附弱，吸附弱，大分子可以自由通过，因而对生物大分子大分子可以自由通过，因而对生物大分子大分子可以自由通过，因而对生物大分子大分子可以自由通过，因而对生物大分子（如蛋白质）的交换容量比离子交换树脂大。（如蛋白质

18、）的交换容量比离子交换树脂大。（如蛋白质）的交换容量比离子交换树脂大。（如蛋白质）的交换容量比离子交换树脂大。阳离子型包括羧甲基纤维素（CM纤维素）等阴离子型包括二乙基氨基乙基纤维素（DEAE纤维素）CM-C弱酸型：-O-CH2COO-，适于中、碱性蛋白PH4使用，DEAE-C强碱型：-O-(CH2)2N+H(C2H5)2适于中、酸性蛋白PH使用，制备CM-C：-OH（NaOH)-ONa(二氯乙酸交联，一氯乙酸引入羧甲基)-O-CH2COOHDEAE-C：-ONa(C2H5)2N-CH2CH2OH+SOCl2选择酸性蛋白pI5，用DEAE-CpH5.5-9.0碱性蛋白pI8，用考虑目的物稳定性

19、、杂质解吸洗脱缓和，改变pH、IC-OCH2COO-H3N+POH-C-OCH2COO-+H2NP+H2OH+C-OCH2COOH+H3N+PNaClC-OCH2COO-Na+H3N+P+Cl-处理和再生水浸泡，充分溶胀，用数十倍低浓度HCl和NaOH反复浸泡（0.3-1h)平衡离子、缓冲液平衡不耐酸、碱处理阳离子纤维素膨胀大离子交换葡聚糖：离子交换葡聚糖：是葡聚糖是葡聚糖是葡聚糖是葡聚糖经环氧氯丙烷交联后形成的具有多孔三经环氧氯丙烷交联后形成的具有多孔三经环氧氯丙烷交联后形成的具有多孔三经环氧氯丙烷交联后形成的具有多孔三维空间网状结构和离子交换功能基团的多糖衍生物维空间网状结构和离子交换功能

20、基团的多糖衍生物维空间网状结构和离子交换功能基团的多糖衍生物维空间网状结构和离子交换功能基团的多糖衍生物（Sephadex GSephadex G）常用的离子交换葡聚糖包括：常用的离子交换葡聚糖包括：阳离子交换剂阳离子交换剂CM-SephadexCM-SephadexCC-25-25，CM-SephadexC-50CM-SephadexC-50SephadexC-25SephadexC-25，SephadexC-50SephadexC-50 25-25-吸液量吸液量1010倍倍 阴离子交换剂阴离子交换剂DEAE-SephadexDEAE-SephadexA A-25-25，DEAE-Sepha

21、dexA-50DEAE-SephadexA-50QAE-SephadexA-25QAE-SephadexA-25，QAE-SephadexA-50QAE-SephadexA-50 Sephadex的优点：亲水性强亲水性强、不会引起生物分子的变性和失、不会引起生物分子的变性和失活，母链对蛋白质、核活，母链对蛋白质、核酸酸及其它生物分及其它生物分子的非特异性吸附能力小子的非特异性吸附能力小电离基团在母体上取代程度高，电离基团在母体上取代程度高，交换容量交换容量大大，装柱方便，流速快，装柱方便，流速快既有离子交换作用，又有既有离子交换作用，又有分子筛分子筛效应效应离子交换琼脂糖：离子交换琼脂糖：是携

22、带是携带DEAEDEAE或或CMCM基团的基团的SepharoseCL-6BSepharoseCL-6B DEAE-SepharoseDEAE-Sepharose（阴离子型阴离子型）和）和CM-SepharoseCM-Sepharose（阳（阳离子型）离子型）的离子交换介质具有硬度大、性质稳定，流速好，的离子交换介质具有硬度大、性质稳定，流速好，分离能力强等优点分离能力强等优点尤其是介质受尤其是介质受pHpH和离子强度的影响所引起的膨胀和收缩效和离子强度的影响所引起的膨胀和收缩效应较小，因应较小，因此具有稳定的外形体积此具有稳定的外形体积离子交换介质的选择原则离子交换介质的选择原则离子交换介质

23、的选择原则离子交换介质的选择原则一般而言：一般而言：酸性酸性物质用物质用阴离子阴离子交换剂分离交换剂分离氨基酸、核苷酸、蛋白质等氨基酸、核苷酸、蛋白质等两性电解质两性电解质，可根据其，可根据其pIpI值值及及离子化离子化曲线曲线来选择来选择碱性碱性物质用物质用阳离子阳离子交换剂分离交换剂分离离子交换介质的选择原则离子交换介质的选择原则离子交换介质的选择原则离子交换介质的选择原则1122334466778899101055pHpH+-蛋蛋白白质质净净电电荷荷等电点等电点吸附阴离子交换剂吸附阴离子交换剂吸附阳离子交换剂吸附阳离子交换剂pHpHpIpIpI（-）对对pI=5pI=5的某酸性蛋白质的某

24、酸性蛋白质在在的范围内，的范围内，当蛋白质为阴离子时，当蛋白质为阴离子时，应首选应首选DEAEDEAE纤维素纤维素；在在的范围内，的范围内，当蛋白质为阳离子时，当蛋白质为阳离子时，应首选应首选CMCM纤维素纤维素离子交换剂与操作条件的选择 1)离子交换剂的选择 疏水性树脂类种类 亲水性凝胶类 小分子：无机离子、生物小分子 离子交换物 大分子：蛋白、酶、核酸、多糖 酸性（阳）强、弱功能基团性质 碱性（阴）强、弱 交联度及离子交换容量稳定性 2）操作条件的选择 介质的pH值（离子交换剂的离解度、离子交换物质的离解度及其稳定性）离子交换剂的离子形式阳离子（H+、Na+、K+、NH4+）阴离子（OH-

25、、Cl-、SO4 2-、CO3 2-）淋洗剂水、低离子强度缓冲液 改变pH值洗脱剂 增加离子强度 或+缓冲液 有机溶剂再生（转型）：l疏水性树脂类：1.02.0 M 酸、碱（HCl、NaOH）l亲水性凝胶类：0.10.5 M 酸、碱（HCl、NaOH）“中毒”树脂类常采用的处理方法 4050的 2.0 M 强酸、强碱 10%NaCl+1-2%NaOH混合剂 有机溶剂混合液离子交换法的应用 软水和去离子水的制备水的软化机理RNa+Ca2+、Mg2+=RCa2+、Mg2+Na+去离子水的制备原理RH+ROH-+MeX=RMe+RX-+H2O 氨基酸的分离氨基酸的分离(阳离子交换树脂阳离子交换树脂)用用pH递增的柠檬酸盐缓冲溶液洗脱递增的柠檬酸盐缓冲溶液洗脱侧链侧链pKa增大的氨基酸增大的氨基酸蛋白质、酶、核酸等生物活性物质的蛋白质、酶、核酸等生物活性物质的 分离、纯化和富集分离、纯化和富集.1离子交换树脂的分类？2简述亲水性离子交换剂的特点。3如何测定离子交换树脂的交换容量？