发酵工程第四章发酵工业的无菌技术.ppt

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1、灭灭菌菌(sterilization):(sterilization):用用化化学学或或物物理理方方法法杀杀死物料或设备中所有有生命物质的过程。死物料或设备中所有有生命物质的过程。消消毒毒(disinfection):(disinfection):用用物物理理或或化化学学方方法法杀杀死死空气、地表以及容器和器具表面的微生物。空气、地表以及容器和器具表面的微生物。除除菌菌(degermation):(degermation):用用过过滤滤方方法法除除去去空空气气或或液体中的微生物及其孢子。液体中的微生物及其孢子。防防腐腐(antisepsis):(antisepsis):用用物物理理或或化化学学

2、方方法法杀杀死死或抑制微生物的生长和繁殖或抑制微生物的生长和繁殖 。控制有害微生物主要有以下几种措施：杀灭病原微生物杀灭一切微生物比较项目比较项目灭菌灭菌消毒消毒防腐防腐化疗化疗处理因素处理因素强、理化因强、理化因素素理、化因素理、化因素理、化因素理、化因素化学治疗剂化学治疗剂处理对象处理对象任何物体内任何物体内外外生物体表，生物体表，酒、乳等酒、乳等有机物体内有机物体内外外宿主体内宿主体内微生物类型微生物类型 一切微生物一切微生物有关病原菌有关病原菌一切微生物一切微生物有关病原菌有关病原菌对微生物作对微生物作用用彻底杀灭彻底杀灭杀死或抑制杀死或抑制抑制或杀死抑制或杀死抑制或杀死抑制或杀死实例

3、实例加压蒸气灭加压蒸气灭菌，辐射灭菌，辐射灭菌、化学杀菌、化学杀菌剂菌剂70%70%酒精消酒精消毒、巴氏消毒、巴氏消毒法毒法冷藏、干燥、冷藏、干燥、糖渍、盐腌、糖渍、盐腌、缺氧、化学缺氧、化学防腐剂防腐剂抗生素、磺抗生素、磺胺药、生物胺药、生物药物素药物素什么是染菌？什么是染菌？发酵过程中除了生产菌以外，还有其它菌发酵过程中除了生产菌以外，还有其它菌生长繁殖。生长繁殖。1）由由于于杂杂菌菌污污染染，使使发发酵酵培培养养基基因因杂杂菌菌的的消消耗耗而损失，造成产率的下降；而损失，造成产率的下降；2 2）由于杂菌所产生的某些代谢产物，或染菌后）由于杂菌所产生的某些代谢产物，或染菌后发酵液某些理化性

4、质的改变，使产物的提取变发酵液某些理化性质的改变，使产物的提取变得困难，造成得率降低或使产品质量下降；得困难，造成得率降低或使产品质量下降；3）污染的杂菌可能会分解产物而使生产失败；）污染的杂菌可能会分解产物而使生产失败；4.2.1 4.2.1 杂菌污染的危害杂菌污染的危害 4）污污染染的的杂杂菌菌大大量量繁繁殖殖，会会改改变变反反应应介介质质的的pH，从而使生物化学反应发生异常变化；，从而使生物化学反应发生异常变化；5）发发生生噬噬菌菌体体污污染染，微微生生物物细细胞胞被被裂裂解解而而使使生生产失败等。产失败等。A细菌细菌谷谷氨氨酸酸(棒棒状状杆杆菌菌)：发发酵酵周周期期短短，培培养养基基不

5、不太丰富，较少染杂菌，但太丰富，较少染杂菌，但噬菌体噬菌体威胁大。威胁大。肌肌苷苷（枯枯草草杆杆菌菌）：缺缺陷陷型型生生产产菌菌，培培养养基基丰丰富富，易易染染菌菌，营营养养成成分分迅迅速速被被消消耗耗，严严重重抑制菌生长和合成代谢产物。抑制菌生长和合成代谢产物。B.霉菌霉菌PenG：绝大多数杂菌都能直接产生青霉素酶，而另一些杂菌则可被青霉素诱导而产生青霉素酶。不论在发酵前期、中期或后期，染有能产生青霉素酶的杂菌，都能使青霉素迅速破坏。青青霉霉素素水水解解酶酶上上升升，PenGPenG迅迅速速破破坏坏，发发酵酵一一无无所所获。获。柠檬酸柠檬酸：，不易染菌，不易染菌，主要防止前期染菌主要防止前期

6、染菌。链霉素、四环素、红霉素、卡那霉素等虽不象青霉素发酵染菌那样一无所得，但也会造成不同程度的危害。如杂菌大量消耗营养，干扰生产菌的正常代谢；改变pH，降低产量。灰黄霉素、制霉菌素、克念菌素等抗生素抑制霉菌，对细菌几乎没有抑制和杀灭作用。青霉素：怕染细短产气杆菌青霉素：怕染细短产气杆菌链霉素：怕染细短杆菌、假单孢杆菌和产气杆菌链霉素：怕染细短杆菌、假单孢杆菌和产气杆菌四环素：怕染双球菌、芽孢杆菌和荚膜杆菌四环素：怕染双球菌、芽孢杆菌和荚膜杆菌柠檬酸：怕染青霉菌柠檬酸：怕染青霉菌肌苷（酸）：怕染芽孢杆菌肌苷（酸）：怕染芽孢杆菌谷氨酸：怕染噬菌体，易造成连续污染谷氨酸：怕染噬菌体，易造成连续污染C

7、.C.酵母菌酵母菌:易污染细菌以及野生酵母菌易污染细菌以及野生酵母菌 D.疫苗生产:危害很大,现在疫苗多采用深层培养，这是一类不加提纯而直接使用的产品，在其深层培养过程中，一旦污染杂菌，不论死菌、活菌或内外毒素，都应全部废弃。因此，发酵罐容积越大，污染杂菌后的损失也越大。污染其它杂菌有些杂菌会使生产菌自溶产生大量泡沫，即使添加消泡剂也无法控制逃液，影响发酵过程的通气搅拌。有的杂菌会使发酵液发臭、发酸，致使pH下降，使不耐酸的产品破坏。特别是染芽孢杆菌，由于芽孢耐热，不易杀死，往往一次染菌后会反复染菌。由于接种量较小，生产菌生长一开始不占优势，而且培养基营养丰富，培养基营养丰富，容易污染杂菌。种

8、子染种子染菌对发酵危害极大，应严格控制种子染菌，菌对发酵危害极大，应严格控制种子染菌，如在此阶段染菌，应将培养液全部废弃。（2）不同发酵时期发酵时期染菌对发酵的影响1）种子培养期染菌 2）发酵前期染菌）发酵前期染菌发酵前期最易染菌。原因 发酵前期菌量不很多，与杂菌没有竞争优势；且还未合成产物（抗生素）或产生很少，抵御杂菌能力弱。在这个时期要特别警惕以防止染菌的发生。措施 如果前期染菌，且培养基养料消耗不多，可以重新灭菌，补加一些营养，重新接种再用。发酵中期染菌，处理困难，危害很大。发酵中期染菌，处理困难，危害很大。3）发酵中期染菌）发酵中期染菌发酵中期染菌会严重干扰产生菌的代谢。杂菌大量发酵中

9、期染菌会严重干扰产生菌的代谢。杂菌大量产酸，培养液产酸，培养液pHpH下降；糖、氮消耗快，发酵液发粘，下降；糖、氮消耗快，发酵液发粘，菌丝自溶，产物分泌减少或停止，有时甚至会使已产菌丝自溶，产物分泌减少或停止，有时甚至会使已产生的产物分解。有时也会使发酵液发臭，产生大量泡生的产物分解。有时也会使发酵液发臭，产生大量泡沫。沫。措施措施 降温培养，减少补料，密切注意代谢变化情降温培养，减少补料，密切注意代谢变化情况。如果发酵单位到达一定水平可以提前放罐，或者况。如果发酵单位到达一定水平可以提前放罐，或者抗生素生产中可以将高单位的发酵液输送一部分到染抗生素生产中可以将高单位的发酵液输送一部分到染菌罐

10、，抑制杂菌。菌罐，抑制杂菌。4）发酵后期染菌）发酵后期染菌发酵后期发酵液内已积累大量的产物，特别是抗生素，对杂菌有一定的抑制或杀灭能力。因此如果染菌不多，对生产影响不大。如果染菌严重，又破坏性较大，可以提前放罐。（3 3）杂菌污染对发酵产物提取和产品质量的影响）杂菌污染对发酵产物提取和产品质量的影响1）发酵染菌对过滤的影响染菌的发酵液一般发粘，菌体大多数自溶，所以在发酵液过滤时不能或很难形成滤饼，导致过滤困难。污染杂菌的种类对过滤的影响程度有差异，如污染霉菌时，影响较小，而污染细菌时很难过滤。由于过滤困难，过滤时间拉长，影响发酵液储罐和过滤设备的周转使用，破坏了生产平衡。染菌发酵液还会因过滤困

11、难而大幅度降低过滤收率，直接影响提取总收率。丝状菌发酵被产酸菌污染：丝状菌发酵被产酸菌污染：pHpH不断下降，菌丝大量自溶，不断下降，菌丝大量自溶，发酵液粘度增加，过滤困难发酵液粘度增加，过滤困难 预处理方法：预处理方法：将发酵液加热后再加助滤剂；将发酵液加热后再加助滤剂；先加絮凝先加絮凝剂使蛋白质凝聚后沉淀剂使蛋白质凝聚后沉淀杂菌分泌较多蛋白质杂质时，对发酵后处理过程中采用溶杂菌分泌较多蛋白质杂质时，对发酵后处理过程中采用溶媒萃取的提取工艺非常不利，使水相和溶媒之间极易发生媒萃取的提取工艺非常不利，使水相和溶媒之间极易发生乳化乳化染菌发酵液中含有比正常发酵液更多的水溶性蛋白和其它杂质。采用有

12、机溶剂萃取的提炼工艺，则极易发生乳化，很难使水相和溶剂相分离，影响进一步提纯。采用直接用离子交换树脂的提取工艺，如链霉素、庆大霉素，染菌后大量杂菌黏附在离子交换树脂表面，或被离子交换树脂吸附，大大降低离子交换树脂的交换容量，而且有的杂菌很难用水冲洗干净，洗脱时与产物一起进入洗脱液，影响进一步提纯。u显微镜检查法显微镜检查法 镜检出杂菌需要一定时间镜检出杂菌需要一定时间u平板划线培养或斜面培养检查法：菌落平板划线培养或斜面培养检查法：菌落 噬菌体检查可采用双层平板法：噬菌斑噬菌体检查可采用双层平板法：噬菌斑u肉汤培养检查法肉汤培养检查法 u发酵过程的异常现象判断发酵过程的异常现象判断DODO2

13、2水平异常变化水平异常变化pHpH异常变化异常变化尾气尾气COCO2 2异常变化异常变化 双双层层平平板板法法底层平板（底层平板（2琼脂培养基琼脂培养基10mL）上层平板上层平板上层培养基（上层培养基（1琼脂培养基琼脂培养基5mL）宿主菌悬液（对数期菌液）宿主菌悬液（对数期菌液）噬菌体试样（合适稀释液）噬菌体试样（合适稀释液）混匀混匀3710余余h计数噬菌斑计数噬菌斑vv溶解氧水平的异常变化溶解氧水平的异常变化感染噬菌体，生产菌的作用受到抑制，溶氧浓感染噬菌体，生产菌的作用受到抑制，溶氧浓度很快上升。度很快上升。污染好氧性杂菌，溶解氧在短时间内下降，并污染好氧性杂菌，溶解氧在短时间内下降，并接

14、近零值，长时间不能回升；接近零值，长时间不能回升；污染非好氧性杂菌，生产菌受到抑制，耗氧量污染非好氧性杂菌，生产菌受到抑制，耗氧量减少，溶解氧升高。减少，溶解氧升高。12vv尾气中尾气中COCO2 2含量异常含量异常污染杂菌，糖耗加快，污染杂菌，糖耗加快，COCO2 2含量增加；感染含量增加；感染噬菌体，糖耗减慢，噬菌体，糖耗减慢，COCO2 2含量减少。含量减少。vvpHpH异常异常对于污染产酸菌或利用碳源效率高生长较快对于污染产酸菌或利用碳源效率高生长较快的杂菌，会使的杂菌，会使pHpH迅速下降。迅速下降。主要原因：主要原因：种子带菌种子带菌 无菌空气带菌无菌空气带菌 设备渗漏设备渗漏 灭

15、菌不彻底灭菌不彻底 操作失误操作失误 技术管理不善技术管理不善日本工业技术院发酵研究所多年来抗生素发酵染菌原因分析项目百分率%种子带菌或怀疑种子带菌接种时罐压跌零培养基灭菌不透总空气系统有菌泡沫冒顶夹套穿孔盘管穿孔接种管穿孔阀门渗漏搅拌轴密封渗漏罐盖漏其它设备渗漏操作原因原因不明1 1）从污染杂菌的种类分析）从污染杂菌的种类分析污染耐热芽孢杆菌：培养基或设备灭菌不彻底；污染耐热芽孢杆菌：培养基或设备灭菌不彻底；污染不耐热杂菌：种子带菌、空气除菌不彻底、污染不耐热杂菌：种子带菌、空气除菌不彻底、设备渗漏或操作问题；设备渗漏或操作问题；污染浅绿色菌落杂菌：冷却盘管渗漏引起；污染浅绿色菌落杂菌：冷却

16、盘管渗漏引起；污染霉菌：无菌室灭菌不彻底，或操作问题；污染霉菌：无菌室灭菌不彻底，或操作问题；污染酵母菌：糖液灭菌不彻底。污染酵母菌：糖液灭菌不彻底。2 2）从污染时间分析）从污染时间分析发酵前期染菌：种子带菌、培养基或设备灭菌发酵前期染菌：种子带菌、培养基或设备灭菌不彻底、操作不当或空气带菌；不彻底、操作不当或空气带菌；发酵后期染菌：中间补料污染、设备渗漏或操发酵后期染菌：中间补料污染、设备渗漏或操作问题。作问题。3 3）从染菌程度分析）从染菌程度分析多个罐染菌：种子带菌、空气系统问题；多个罐染菌：种子带菌、空气系统问题；个别罐染菌：设备问题、操作不当。个别罐染菌：设备问题、操作不当。（1）

17、种子带菌及其防治发酵前期种子带菌又分为种子本身带菌和种子培养过程中染菌。加强种子管理，严格无菌操作，种子本身带菌是可以克服的。种子培养过程染菌与发酵一样有许多因素造成。l培养基及器具彻底灭菌灭菌锅使用l避免菌种在移接过程中受污染无菌室l避免菌种在培养过程或保藏过程中受杂菌污染无菌室要求无菌室要求在无菌室中装有紫外灯，打开紫外灯，照半小时，关灯后15分钟再接种。用消毒药水如新洁而灭配成1/1000浓度擦桌子、拖地.接种时必须在超净台上操作，超净台装有一台鼓风机，进风口有一粗过滤器，出风口有高效过滤器，保证无菌风从超净台吹出，外界有菌空气不可能进入接种区域，保证无菌条件。接种人员必须穿好无菌服，戴

18、好口罩，手用酒精棉球擦干净。（2 2）过滤空气带菌及其防治）过滤空气带菌及其防治从日本工业技术院分析空气带菌而造成的染菌为。国内外空气除菌技术虽已有较大改善，但仍然没有使染菌率降低到理想的程度。因为空气除菌系统较为复杂，环节多，不慎便会导致空气除菌失败。p正确选择采气口p保持过滤介质的干燥p设计和安装合理的空气过滤器（3 3）设备渗漏或）设备渗漏或“死角死角”设备渗漏包括夹套穿孔、盘管穿孔、接种管穿孔、阀门渗漏、搅拌轴渗漏、罐盖漏和其它设备漏等。从日本工业技术院发酵研究所对染菌原因分析发现，这类染菌占。所以说加强设备本身及附属零部件的严密度检查，对制服染菌是极其主要的，也是重要的。好气性机械搅

19、拌发酵罐是密封式受压设备，主要部件包括：罐身轴封消泡器搅拌器联轴器中间轴承挡板空气分布管换热装置人孔以及管路等u发酵罐的发酵罐的“死角死角”法兰、内衬、接口、表头、罐内部件及其支撑件如搅拌法兰、内衬、接口、表头、罐内部件及其支撑件如搅拌轴拉杆、联轴器、冷却盘管、挡板、空气分布管及其支轴拉杆、联轴器、冷却盘管、挡板、空气分布管及其支撑件撑件 口：人孔（或手孔）、排风管接口、灯孔、视镜口、口：人孔（或手孔）、排风管接口、灯孔、视镜口、进料管口进料管口 发酵罐罐底发酵罐罐底脓疱状积垢脓疱状积垢造成造成“死角死角”消除方法：加强清洗并定期铲除污垢；安装消除方法：加强清洗并定期铲除污垢；安装放汽边阀放汽

20、边阀u管道安装不当或配置不合理形成的管道安装不当或配置不合理形成的“死角死角”灭菌时蒸汽不易通达的“死角”及其消除方法发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角”法兰连接不当造成的“死角”（4 4）灭菌不彻底）灭菌不彻底灭菌技术的好坏与灭菌质量很有关系升温快慢、保温时间,泡沫蒸汽总压是否达到要求标准环境中的杂菌数量因季节而有很大差别。如上海第四制药厂在卡那霉素生产中，于炎热的夏季将连续灭菌预热至80的培养基采样培养，可发现无法计数的大量的芽孢杆菌；而在冬季取样的培养中，则仅发现23个芽孢杆菌。培养基与设备灭菌不彻底的防治培养基与设备灭菌不彻底的防治原料性状：大颗粒的原料过筛除去原料性状：大颗粒的原料过筛除

21、去实罐灭菌时要充分排除罐内冷空气实罐灭菌时要充分排除罐内冷空气灭菌过程中产生的泡沫造成染菌：添加消泡剂灭菌过程中产生的泡沫造成染菌：添加消泡剂 防止泡沫升顶防止泡沫升顶连消不彻底连消不彻底：最好采用自动控制装置：最好采用自动控制装置 灭菌后期罐压骤变灭菌后期罐压骤变 死角死角 操作不当造成染菌操作不当造成染菌 噬菌体染菌及其防治噬菌体染菌及其防治 干热灭菌法干热灭菌法 湿热灭菌法湿热灭菌法 射线灭菌法射线灭菌法 化学药剂灭菌法化学药剂灭菌法过滤除菌法过滤除菌法火焰灭菌法火焰灭菌法 1）化学试剂灭菌法：常用试剂有甲醛、氯气（或次氯酸钠）、高锰酸钾、环氧乙烷、季铵盐（如新洁尔灭）、臭氧等。这些物质

22、易与微生物细胞中的一些成分产生化学反应，如使蛋白质变性、酶类失活、破坏细胞膜通透性而杀灭微生物。由于化学试剂也会与培养基中的一些成分作用，而且加入培养基后不易去除，它不能用于培养基的灭菌，但染菌后的培养基可用化学药剂处理。2 2）辐射灭菌：）辐射灭菌：vv利用高能量的电磁辐射和微粒辐射来杀灭微生物。利用高能量的电磁辐射和微粒辐射来杀灭微生物。如如紫外线紫外线（穿透力低，仅适用于表面消毒和空气消（穿透力低，仅适用于表面消毒和空气消毒）与菌体核酸的光化学反应而使菌体死亡；毒）与菌体核酸的光化学反应而使菌体死亡；的的X X射线射线、CoCo6060产生的产生的 射线射线，它们含极高的能量，可使，它们

23、含极高的能量，可使菌体内的水和有机物产生强烈的离子化反应，形成菌体内的水和有机物产生强烈的离子化反应，形成OHOH-、H H2 2O O2 2和有机过氧化物，从而在微生物体内引和有机过氧化物，从而在微生物体内引起氧化连锁反应，导致微生物菌体迅速死亡。近年起氧化连锁反应，导致微生物菌体迅速死亡。近年兴起了微波灭菌。兴起了微波灭菌。3 3）过滤除菌法过滤除菌法适适用用于于澄澄清清液液体体和和气气体体的的除除菌菌。是是将将液液体体或或气气体体用用微微孔孔薄薄膜膜过过滤滤，使使大大于于孔孔径径的的细细菌菌等等微微生生物物颗颗粒粒阻阻留留，从从而而达达到到除除菌菌目目的的。用用于于遇遇热容易变性而失效的

24、试剂或培养液。热容易变性而失效的试剂或培养液。4 4）干热灭菌法）干热灭菌法l l160160下保温下保温1-2h1-2h。干热对微生物有氧化、使细。干热对微生物有氧化、使细胞蛋白质变性和电解质浓缩等效应而使菌体死胞蛋白质变性和电解质浓缩等效应而使菌体死亡。亡。5 5）火焰灭菌法）火焰灭菌法l l灭灭菌菌彻彻底底，但但仅仅适适用用于于接接种种针针、玻玻璃璃棒棒、三三角角瓶口等的灭菌。瓶口等的灭菌。6）湿热灭菌法：l湿热灭菌要比干热灭菌更有效，这一方面是由于湿热易于传递热量，蒸汽具有很强的穿透能力，而且在冷凝时会放出大量的冷凝热，另一方面是由于湿热更易破坏保持蛋白质稳定性的氢键等结构，从而加速其

25、变性。很容易使蛋白质凝固而杀死各种微生物。l一般的湿热灭菌条件：121，30min。高压蒸汽灭菌是发酵工业最常用的方法，能有效地杀灭杂菌，但高温也破坏培养基的营养成分。消除高温有害影响的措施（1 1）对易破坏的含糖培养基进行灭菌时，应先）对易破坏的含糖培养基进行灭菌时，应先将糖液与其他成分分别灭菌后再合并；将糖液与其他成分分别灭菌后再合并；（2 2）对含）对含CaCa2+2+或或FeFe3+3+的培养基与磷酸盐先作分的培养基与磷酸盐先作分别灭菌，然后再混合，就不易形成磷酸盐沉淀；别灭菌，然后再混合，就不易形成磷酸盐沉淀；（3）对含有在高温下易破坏成分的培养基（如含糖组合培养基）可进行低压灭菌（

26、在112即cm2或8磅英寸2下灭菌15分钟）或间歇灭菌；（4）在大规模发酵工业中，可采用连续加压灭菌法进行培养基的灭菌。7)7)间歇灭菌法，又称丁达尔灭菌法或分段灭菌法。间歇灭菌法，又称丁达尔灭菌法或分段灭菌法。适用于不耐热培养基的灭菌。适用于不耐热培养基的灭菌。l l方法是：将待灭菌的培养基在方法是：将待灭菌的培养基在8080100100下蒸下蒸煮煮151560min60min，以杀死其中所有微生物的营养，以杀死其中所有微生物的营养细胞，然后置室温或细胞，然后置室温或3737下保温过夜，诱导残下保温过夜，诱导残留的芽孢发芽，第二天再以同法蒸煮和保温过留的芽孢发芽，第二天再以同法蒸煮和保温过夜

27、，如此连续重复夜，如此连续重复3 3天，即可在较低温度下达天，即可在较低温度下达到彻底灭菌的效果。到彻底灭菌的效果。热死时间热死时间热死时间热死时间-衡量湿热灭菌的指标衡量湿热灭菌的指标衡量湿热灭菌的指标衡量湿热灭菌的指标是指在规定的温度下杀死一定比例的微生物所需是指在规定的温度下杀死一定比例的微生物所需是指在规定的温度下杀死一定比例的微生物所需是指在规定的温度下杀死一定比例的微生物所需要的时间。要的时间。要的时间。要的时间。加热温度和受热时间是灭菌工作的关键。加热温度和受热时间是灭菌工作的关键。加热温度和受热时间是灭菌工作的关键。加热温度和受热时间是灭菌工作的关键。1 微生物的热阻杀死微生物

28、的极限温度称为致死温度。在致死温度下，杀死全部微生物所需的时间称为致死时间；在致死温度以上，温度愈高，致死时间愈短。微生物的热阻：是指微生物在某一特定条件（主要是温度和加热方式）下的致死时间。相对热阻是指某一微生物在某条件下的致死时间与另一微生物在相同条件下的致死时间的比值。微生物微生物微生物微生物相相相相对热对热对热对热阻阻阻阻营营营营养养养养细细细细胞和酵母胞和酵母胞和酵母胞和酵母细细细细菌芽菌芽菌芽菌芽孢孢孢孢霉菌霉菌霉菌霉菌孢孢孢孢子子子子病毒和噬菌体病毒和噬菌体病毒和噬菌体病毒和噬菌体1.01.03103106 62102101515实实验验证证明明，在在一一定定温温度度下下，微微生

29、生物物营营养养细细胞胞的的均均相相热热死死动动力力学学符符合合化化学学反反应应的的一一级级反反应应动动力力学学，即即：对对微微生生物物进进行行湿湿热热灭灭菌菌时时，培培养养基基中中的的微微生生物物受受热热死死亡亡的的速速率率与与残存的微生物数量成正比，这就是对数残留定律。残存的微生物数量成正比，这就是对数残留定律。式中，式中，N N：任一时刻的活细菌浓度（个：任一时刻的活细菌浓度（个/L/L）;t t：时间（：时间（minmin）;K K：比热死速率常数（：比热死速率常数（min-1min-1）.若开始灭菌（若开始灭菌（t=0）时，培养基中活的微生物数为）时，培养基中活的微生物数为N0 t=2

30、.303 logN0/N/k-dN/dt=NlnN/N0=-t积分积分0/N=tor可见灭菌时间取决于污染程度可见灭菌时间取决于污染程度(N(N0 0)、灭菌程度（残留、灭菌程度（残留菌数菌数N N）和）和k k值值例：有一发酵罐内装有一发酵罐内装40m40m3 3培养基，在培养基，在121121温度下进行实罐灭温度下进行实罐灭菌。原污染程度为每菌。原污染程度为每mlml有有2102105 5个耐热细菌芽孢，个耐热细菌芽孢，121121时灭时灭菌速度常数为菌速度常数为1 1。求灭菌失败几率为时所需的灭菌时间。求灭菌失败几率为时所需的灭菌时间。解：解：N0=40106 2105=8 1012(个

31、个)N=0.001;=1.8(min1)=2.303 lgN0N=2.3031.8lg(81015)=20.34(min)大肠杆菌在不同温度下大肠杆菌在不同温度下的残留曲线的残留曲线嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢在不同嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢在不同温度下的死亡曲线温度下的死亡曲线 当当Nt=0时，时，t=，既无意义，也不可能。既无意义，也不可能。一般采用一般采用，即即1000次灭菌中只有一次失败次灭菌中只有一次失败。实验还证明，细菌孢子的热杀灭动力学与营实验还证明，细菌孢子的热杀灭动力学与营养细胞的有所不同。它表现为非对数的死亡养细胞的有所不同。它表现为非对数的死亡动力学。这可能与孢子壁的化学成分及结构动力

32、学。这可能与孢子壁的化学成分及结构有关。但当温度超过有关。但当温度超过120C120C时，热阻极强的时，热阻极强的嗜热脂肪芽孢杆菌孢子的热杀灭动力学也接嗜热脂肪芽孢杆菌孢子的热杀灭动力学也接近对数死亡动力学即符合一级反应规律。近对数死亡动力学即符合一级反应规律。+培养物质受热破坏也可看作一级反应：培养物质受热破坏也可看作一级反应：式中式中C：对热不稳定物质的浓度；对热不稳定物质的浓度；k：分解速度常数分解速度常数；k的变化也遵循阿累尼乌斯方程：的变化也遵循阿累尼乌斯方程：都与相应的活化能及都与相应的活化能及T有关有关当当T1 T2 (k2/k1)/(k2/k1)=E/E1 (EE)随随着着T上

33、上升升，菌菌死死亡亡速速率率增增加加倍倍数数大大于于培培养养基基成成分分分分解解速速率率增增加加倍倍数数，故故一一般般选选择择高高温温快快速灭菌速灭菌。受受受受热热热热物物物物质质质质EE（J/molJ/mol）维维维维生素生素生素生素B12B12维维维维生素生素生素生素B1B1盐盐盐盐酸酸酸酸盐盐盐盐嗜嗜嗜嗜热热热热脂肪芽脂肪芽脂肪芽脂肪芽孢孢孢孢杆菌杆菌杆菌杆菌孢孢孢孢子子子子肉毒梭菌肉毒梭菌肉毒梭菌肉毒梭菌孢孢孢孢子子子子枯草杆菌枯草杆菌枯草杆菌枯草杆菌孢孢孢孢子子子子96232962329204892048283257283257343088343088317984317984灭灭灭灭

34、菌温度菌温度菌温度菌温度（C C）达到达到达到达到灭灭灭灭菌程度的菌程度的菌程度的菌程度的时时时时间间间间（minmin）维维维维生素生素生素生素B B1 1的的的的损损损损失（失（失（失（%）10010011011012012013013014014015015084384375757.67.60.8510.8510.1070.1070.0150.01599.9999.998989272710103 31 1嗜热脂肪芽孢杆菌孢子死灭程度为嗜热脂肪芽孢杆菌孢子死灭程度为N/NN/N0 0=10=10-16-16时，时，灭菌温度对维生素灭菌温度对维生素B1B1破坏的影响。破坏的影响。培养基成分培

35、养基成分油脂、糖类及一定浓度的蛋白质、高浓度有机物等油脂、糖类及一定浓度的蛋白质、高浓度有机物等增加微生物的耐热性增加微生物的耐热性低浓度（低浓度（1%-2%）NaCl对微生物有保护作用，随着对微生物有保护作用，随着浓度增加，保护作用减弱，当浓度达浓度增加，保护作用减弱，当浓度达8%-10%以上，以上，则减弱微生物的耐热性。则减弱微生物的耐热性。pH：，微微生生物物最最耐耐热热；，H+易易渗渗入入微微生生物物细细胞内，改变细胞的生理反应促使其死亡。胞内，改变细胞的生理反应促使其死亡。培养基培养基pH愈低，灭菌所需时间愈短。愈低，灭菌所需时间愈短。温度 孢子数 灭菌时间(min)()(个120

36、10000 8 7 5 3 3 115 10000 25 25 16 13 13110 10000 70 65 35 30 24100 10000 740 720 180 150 150 pHpH对灭菌时间的影响对灭菌时间的影响培养基中的颗粒物质培养基中的颗粒物质 培养基中的颗粒物质大，灭菌困难，反之，灭培养基中的颗粒物质大，灭菌困难，反之，灭菌容易。一般说来，含有颗粒对培养基灭菌影菌容易。一般说来，含有颗粒对培养基灭菌影响不大，但在培养基混有较大颗粒，特别是存响不大，但在培养基混有较大颗粒，特别是存在凝结成团的胶体时，会影响灭菌效果，必须在凝结成团的胶体时，会影响灭菌效果，必须过滤除去。过滤

37、除去。泡泡沫沫：泡泡沫沫中中的的空空气气形形成成隔隔热热层层，对对灭灭菌菌极极为不利，可加入少量消泡剂为不利，可加入少量消泡剂 。微生物数量微生物数量：浓度越高，所需灭菌时间越长浓度越高，所需灭菌时间越长例如：例如：如肉毒梭状芽孢杆菌，在如肉毒梭状芽孢杆菌，在105105湿热灭菌时湿热灭菌时芽孢杆菌数芽孢杆菌数/ml /ml 时间时间 (min)(min)9109108 8 48 489109106 6 36 369109104 4 20 209109102 2 14 14 培养基的分批灭菌就是将配制好的培养基放在发酵罐或其他容器中，通入蒸汽将培养基和所用设备一起灭菌的操作过程，也称实罐灭菌。

38、在工业上，培养基的分批灭菌无需专门的灭菌设备，设备投资少，灭菌效果可靠，对灭菌用蒸汽要求低（表压），但因其灭菌温度低、时间长而对培养基成分破坏大，对操作难于实现自动控制。培养基分批灭菌过程培养基分批灭菌过程中的温度变化情况中的温度变化情况24016012080时间（min)050100150温度升温冷却保温过程包括：过程包括：升温、保温和冷却升温、保温和冷却三阶段。三阶段。各阶段对灭菌的各阶段对灭菌的贡献：贡献：20%20%、75%75%、5%5%。分批分批灭菌方法（实验室种子培养基）灭菌方法（实验室种子培养基）手提式灭菌锅结构示意图手提式灭菌锅结构示意图立式立式台式台式卧式卧式操作过程：操作

39、过程：空罐准备：清洗、检修和检测。空罐准备：清洗、检修和检测。升温：把培养基加热到灭菌所需的温度。升温：把培养基加热到灭菌所需的温度。保温维持：在灭菌温度下保持灭菌所需时间。保温维持：在灭菌温度下保持灭菌所需时间。冷却保压：把培养基的温度降低到接种的温度。冷却保压：把培养基的温度降低到接种的温度。分空气过滤器灭菌分空气过滤器灭菌并用空气吹干并用空气吹干夹套或蛇管排冷水，开启排夹套或蛇管排冷水，开启排气管阀，空气管通蒸汽，也气管阀，空气管通蒸汽，也可夹套内通蒸汽可夹套内通蒸汽达达70左右左右取样管取样管放料管放料管通蒸汽通蒸汽120，1105pa保温保温保温阶段，凡液面以下各管保温阶段，凡液面以

40、下各管道都应通蒸汽，液面上其余道都应通蒸汽，液面上其余各管道则应排蒸汽，不留死各管道则应排蒸汽，不留死角，维持压力、温度恒定角，维持压力、温度恒定罐压接近空气压力罐压接近空气压力向罐内通无菌空气向罐内通无菌空气保温结束，依次关闭保温结束，依次关闭各排汽、进汽阀门各排汽、进汽阀门夹套或蛇管中通冷水夹套或蛇管中通冷水 培养基降温到所需温度培养基降温到所需温度1 1）培养基的预热）培养基的预热l l灭灭菌菌时时培培养养基基需需通通过过夹夹套套或或蛇蛇管管先先加加热热到到80809090，然然后后再再导导入入蒸蒸汽汽升升温温至至120120130130。预预热热的的目目的的一一是是防防止止直直接接导导

41、入入蒸蒸汽汽时时由由于于培培养养基基与与蒸蒸汽汽的的温温差差过过大大而而产产生生大大量量冷冷凝凝水水使使培培养养基基稀稀释释；二二是是防防止止直直接接导导入入蒸蒸汽汽所所造造成成的的泡泡沫沫急急剧上升而引起物料外溢。剧上升而引起物料外溢。2 2）培养基灭菌）培养基灭菌l l将将蒸蒸汽汽从从进进气气口口、排排料料口口或或取取样样口口直直接接导导入入罐罐内，使罐温上升至内，使罐温上升至120120130130，并保温，并保温30min30min。3 3）降温）降温l l关关闭闭蒸蒸汽汽，通通冷冷却却水水进进行行冷冷却却，当当罐罐内内温温度度降降至至7070以以下下时时，启启动动搅搅拌拌桨桨搅搅拌拌

42、，慢慢速速搅搅动动培培养基，加速冷却。养基，加速冷却。当当蒸蒸汽汽阀阀门门关关闭闭以以及及通通冷冷却却水水后后，发发酵酵罐罐的的罐罐压压将将迅迅速速下下降降，当当罐罐内内压压力力降降至至时时，必必须须间间隙隙开开启启进进气气阀阀，让让无无菌菌空空气气进进入入发发酵酵罐罐内内，并并使使罐罐压压保保持持在在0.03-0.05 MPa0.03-0.05 MPa之间，维持降温过程中的正压。之间，维持降温过程中的正压。应该指出，在分批灭菌时，升温阶段对灭菌亦是有应该指出，在分批灭菌时，升温阶段对灭菌亦是有贡献的。贡献的。升温、冷却两阶段也有一定的灭菌效果，考虑到灭升温、冷却两阶段也有一定的灭菌效果，考虑

43、到灭菌的可靠性主要在保温阶段进行，故可以简单地利菌的可靠性主要在保温阶段进行，故可以简单地利用式用式 (N/N0)=-kt 来粗略估算灭菌所需时间。来粗略估算灭菌所需时间。保证间歇灭菌成功保证间歇灭菌成功的要素的要素（1 1）内部结构合理）内部结构合理(主主要是无死角要是无死角)，焊缝及，焊缝及轴封装置可靠，蛇管轴封装置可靠，蛇管无穿孔现象无穿孔现象（2 2）压力稳定的蒸汽）压力稳定的蒸汽（3 3）合理的操作方法。）合理的操作方法。培养基的连续灭菌连续灭菌连续灭菌就是将配制好的培养基在通入发酵罐时同时进行加热、保温、降温的灭菌过程，也称之为连消。连续灭菌时，培养基在短时间内被加热到灭菌温度（一

44、般为130-140），短时间保温（一般为5-8min）后，被快速冷却，再进入早已灭菌完毕的发酵罐。组成培养基的不同成分（耐热与不耐热、糖与氮源）可在不同温度下分开灭菌，以减少培养基受热破坏的程度。培养基的连续灭菌具有对培养基破坏小、可以实现自动控制、提高发酵罐的设备利用率、蒸汽用量平稳等优点而被广泛应用，尤其在培养基体积较大时。但对加热蒸汽的压力要求较高，一般不小于。同时连续灭菌需要一组附加设备，设备投资大。工艺流程工艺流程喷淋冷却连续灭菌流程喷淋冷却连续灭菌流程喷射加热连续灭菌流程喷射加热连续灭菌流程 薄板式换热器连续灭菌流程薄板式换热器连续灭菌流程 灭菌时间的计算灭菌时间的计算 (Ct/C

45、0)=kt t=2.303/klg(C0/Ct)式中：式中：C0、Ct分别为单位体积培养基灭菌前、后分别为单位体积培养基灭菌前、后 的含菌数。的含菌数。预热至预热至60-70 13240-50维持数分钟维持数分钟 喷淋冷却连续灭菌流程喷淋冷却连续灭菌流程例例2某发酵罐内装某发酵罐内装40m3培养基，采用连续灭菌，培养基，采用连续灭菌，灭菌温度为灭菌温度为1310C，原污染程度为每，原污染程度为每1ml含有含有2105个杂菌，已知个杂菌，已知1310C时灭菌速度常数为时灭菌速度常数为15min-1，求，求灭菌所需的维持时间。灭菌所需的维持时间。连续灭菌时间的估算连续灭菌时间的估算解：解：C0=2

46、105(个/ml)Ct=0.001/(40106)=2.510-11(个/ml)t=2.303/klg(C0/Ct)=2.303/15lg(2105)/(2.510-11)=2.37 min连续灭菌的优点：（适用于大型罐）连续灭菌的优点：（适用于大型罐）u可采用高温短时灭菌，营养成分破坏少，有利于提高发酵产率；u发酵罐利用率高；u蒸汽负荷均衡；u采用板式换热器时，可节约大量能量；u适宜采用自动控制，劳动强度小；u可实现将耐热性物料和不耐热性物料在不同温度下分开灭菌，减少营养成分的破坏。缺点：缺点：对小型罐无优势，不方便，对设备要求高；蒸汽波动时灭菌不彻底；当培养基中含有固体颗粒或有较多泡沫时，

47、以分批灭菌好，防止灭菌不彻底。分批灭菌与连续灭菌的比较分批灭菌与连续灭菌的比较灭菌方式 优点 缺点 连续灭菌 1、灭菌温度高，可减少培养基中营养物质的损失；2、操作条件恒定，灭菌质量稳定；3、易于实现管道化和自控操作；4、避免了反复的加热和冷却，提高了热的利用率；5、发酵设备利用率高；1、对设备的要求高，需另外设置加热冷却装置；2、操作较麻烦；3、染菌的机会多；4、不适合于含大量固体物料的灭菌；5、对蒸汽的要求高；分 批 灭菌 1、设备要求低，不需另外的加热冷却装置；2、操作要求低，适于手动操作；3、适合于小批量生产规模；4、适合于含有大量固体物质的培养基的灭菌；1、培养基的营养物质损失较多，

48、灭菌后培养基的质量下降；2、需进行反复的加热和冷却，能耗较高；3、不适合于大规模生产过程的灭菌；4、发酵罐的利用率较低；n空消及管道灭菌n空气过滤器灭菌n种子培养基实消n发酵培养基实消n发酵培养基连续灭菌n补料实罐灭菌空气除菌空气除菌好气性发酵过程中需要大量的无菌空气，空气要作到绝对无菌在目前是不可能的，也是不经济的。发酵对无菌空气的要求是：无菌，无灰尘，无杂质，无水，无油，正压等几项指标；发酵对无菌空气的无菌程度要求是：只要在发酵过程中不因无菌空气染菌而造成损失即可。在工程设计中一般要求1000次使用周期中只允许有一个菌通过，即经过滤后空气的无菌程度为N=10-3 1、空气除菌的方法：辐射杀

49、菌：辐射杀菌：利用高能量的电磁辐射与菌体核酸的光化学反应造成菌体死亡。加热杀菌加热杀菌：基于加热后微生物体内的蛋白质（酶）热变性而得以实现。静电除菌：静电除菌：利用静电引力来吸附带电粒子而达到除尘灭菌的目的。过滤除菌过滤除菌 ：利用微生物不能透过滤膜除菌。2 2、过滤除菌、过滤除菌过滤除菌是采用定期灭菌的介质（棉花、活性炭、玻璃纤维、有机合成纤维、有机或无机烧结材料）来截留空气中的微生物而制得无菌压缩空气。从可靠性，经济适用与便于控制等方面考虑，目前仍以介质过滤法较好，也是大多数发酵厂广泛采用的方法。按过滤机按过滤机制的不同制的不同绝对过滤绝对过滤 利用微孔滤膜，其孔隙利用微孔滤膜，其孔隙小于

50、甚至，将空气中的细菌滤除，从而获小于甚至，将空气中的细菌滤除，从而获得无菌空气。得无菌空气。深层介质过滤深层介质过滤由多种介质组成过滤由多种介质组成过滤层，滤层较深，空隙较大，靠静电、扩散、层，滤层较深，空隙较大，靠静电、扩散、惯性和阻截作用等将细菌截留在滤层中，从惯性和阻截作用等将细菌截留在滤层中，从而获得无菌空气。而获得无菌空气。棉花棉花玻璃纤维玻璃纤维活性炭活性炭 超细玻璃纤维纸超细玻璃纤维纸 石棉滤板石棉滤板 烧结材料过滤介质烧结材料过滤介质 新型过滤介质新型过滤介质 1.1.棉花：棉花：品种不同，要求新鲜，纤维长而疏松，品种不同，要求新鲜，纤维长而疏松，品种不同，要求新鲜，纤维长而疏