分子生物学-定点诱变与蛋白质工程.ppt

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1、第九章第九章 定点诱变与蛋白质工程定点诱变与蛋白质工程山东大学医学院生物化学山东大学医学院生物化学 与分子生物学研究所与分子生物学研究所 刘贤锡刘贤锡v蛋白质在生命现象中具有重要作用，在医药、轻工蛋白质在生命现象中具有重要作用，在医药、轻工等行业也具有重要作用，如胰岛素、枯草杆菌蛋白等行业也具有重要作用，如胰岛素、枯草杆菌蛋白酶等；酶等；v天然生物材料中蛋白质含量较少；天然生物材料中蛋白质含量较少；v基因克隆技术克隆基因，在宿主细胞中可表达特定基因克隆技术克隆基因，在宿主细胞中可表达特定蛋白质（重组蛋白）；蛋白质（重组蛋白）；v多数天然蛋白质的理化特性不能适应于工业用途多数天然蛋白质的理化特性

2、不能适应于工业用途;v利用现代分子生物学技术，改变克隆基因中的特定利用现代分子生物学技术，改变克隆基因中的特定基因，即可表达出适合于商业用途的蛋白质。基因，即可表达出适合于商业用途的蛋白质。v在体外，通过碱基取代、插入或缺失的方法，在体外，通过碱基取代、插入或缺失的方法，使基因使基因DNA序列中的某个特定碱基发生改变，序列中的某个特定碱基发生改变，从而改变蛋白质的结构，称为从而改变蛋白质的结构，称为蛋白质工程。蛋白质工程。v通过蛋白质工程，人们可以随心所欲地改变通过蛋白质工程，人们可以随心所欲地改变蛋白质的结构及其理化性质和生物学功能。蛋白质的结构及其理化性质和生物学功能。例如，我们可以利用蛋

3、白质工程改变酶的例如，我们可以利用蛋白质工程改变酶的Km、Vmax，酶促反应的最适温度、最适，酶促反应的最适温度、最适pH值、值、酶促反应的特异性以及酶蛋白的稳定性等。酶促反应的特异性以及酶蛋白的稳定性等。v蛋白质工程的主要技术之一是蛋白质工程的主要技术之一是定点诱变技术定点诱变技术.第一节第一节 定点诱变定点诱变一、定点诱变的概念一、定点诱变的概念v利用分子生物学技术，在体外通过利用分子生物学技术，在体外通过碱基取代、插入碱基取代、插入或缺失或缺失可以使基因可以使基因DNA序列中任何一个序列中任何一个特定的碱基特定的碱基发生改变发生改变。这种体外特异性改变某个碱基的技术，。这种体外特异性改变

4、某个碱基的技术，称谓称谓定点诱变（定点诱变（site directed mutagenesis）。）。v定点诱变定点诱变具有简单易行、重复性高等优点，现已发具有简单易行、重复性高等优点，现已发展成为基因操作的一种技术。这种技术不仅适用于展成为基因操作的一种技术。这种技术不仅适用于基因结构与功能的研究，还可通过改变基因的密码基因结构与功能的研究，还可通过改变基因的密码子来改造天然蛋白质。子来改造天然蛋白质。v二、基因定点诱变的意义二、基因定点诱变的意义v用于研究基因的结构与功能；用于研究基因的结构与功能；v通过改变基因的密码子来改造天然蛋白质，通过改变基因的密码子来改造天然蛋白质，使其更符合人们

5、的需要。如酶蛋白的改造以使其更符合人们的需要。如酶蛋白的改造以及新型疫苗或药物的开发。及新型疫苗或药物的开发。v如枯草杆菌蛋白酶之所以易被氧化失活，是由于催化部位的如枯草杆菌蛋白酶之所以易被氧化失活，是由于催化部位的丝氨酸丝氨酸(Ser221)邻近的邻近的甲硫氨酸甲硫氨酸(Met222)易被氧化成硫氢化易被氧化成硫氢化物，若以其他氨基酸取代物，若以其他氨基酸取代Met222，则可提高酶的氧化稳定，则可提高酶的氧化稳定性而又不影响其催化活性。这是结构分析和定点突变改造蛋性而又不影响其催化活性。这是结构分析和定点突变改造蛋白质的成功范例。白质的成功范例。v枯草杆菌蛋白酶可作为洗涤剂的添加剂，但由于

6、其只能水解枯草杆菌蛋白酶可作为洗涤剂的添加剂，但由于其只能水解苯丙氨酸苯丙氨酸(Phe)羧基羧基所形成的肽键，底物作用范围过窄而限所形成的肽键，底物作用范围过窄而限制了洗涤剂的高效性，若用带正电荷的制了洗涤剂的高效性，若用带正电荷的赖氨酸赖氨酸(Lys)取代位取代位于活性中心于活性中心166位的位的甘氨酸甘氨酸(Gly)，所获得的突变酶不仅能水，所获得的突变酶不仅能水解苯丙氨酸解苯丙氨酸(Phe)羧基所形成的肽键，而且可以水解酸性氨羧基所形成的肽键，而且可以水解酸性氨基酸基酸谷氨酸谷氨酸(Glu)所形成的肽键，使其底物作用范围拓宽，所形成的肽键，使其底物作用范围拓宽，因而可能成为最高效的洗涤剂

7、添加酶，这是定点诱变改变蛋因而可能成为最高效的洗涤剂添加酶，这是定点诱变改变蛋白质生物学活性的成功例子。白质生物学活性的成功例子。vN端端-笨丙笨丙-天冬天冬-谷谷-甘甘-C端端 多肽链多肽链三、定点诱变的原理三、定点诱变的原理定点诱变原理示意图vThe Nobel Prize in Chemistry 1993The Nobel Prize in Chemistry 1993forcontributionstothedevelopmentsofmethodswithinDNA-basedchemistryforhisinventionofthepolymerasechainreaction(

8、PCR)methodforhisfundamentalcontributionstotheestablishmentofoligonucleotide-based,site-directedmutagenesisanditsdevelopmentforproteinstudiesKary B.Mullis1/2oftheprizeUSA1/2oftheprizeCanadaMichael Smith四、定点诱变的常用方法（一）M13DNA寡核苷酸诱变v基因工程中基因工程中,噬菌体噬菌体是一种常用的基因载体是一种常用的基因载体,其中又其中又以以M13M13 和和为最常用。为最常用。vM13噬菌体

9、是一种环形噬菌体是一种环形DNA，基因组大小为，在颗，基因组大小为，在颗粒中包装的仅是粒中包装的仅是正链的正链的DNA，有时也称为，有时也称为感染型单感染型单链链DNA(single stranded DNA,ssDNA)。v当感染型单链当感染型单链M13噬菌体感染大肠杆菌后，在菌体噬菌体感染大肠杆菌后，在菌体内借助宿主的酶系统先把内借助宿主的酶系统先把ssDNA复制为双链复制为双链（dsDNA），称为），称为复制型（复制型（replication form,RF）M13（RF-M13）。v广泛用于广泛用于DNA序列分析和噬菌体表面展示系统序列分析和噬菌体表面展示系统（phage displa

10、y)和单链核酸的制备和单链核酸的制备。单链丝状噬菌体(M13噬菌体)1.基本原理：基本原理：v寡核苷酸定点诱变技术所依据的原理是寡核苷酸定点诱变技术所依据的原理是:v首先制备单链核酸首先制备单链核酸,即按体外即按体外DNA重组技术，将待诱变的目重组技术，将待诱变的目的基因插入到的基因插入到M13噬菌体上，制备此种含有目的基因的噬菌体上，制备此种含有目的基因的M13单链单链DNA，即正链，即正链DNA。v再使用化学合成的再使用化学合成的含有突变碱基含有突变碱基的寡核苷酸短片段作引物，的寡核苷酸短片段作引物，启动启动M13单链单链DNA分子进行复制，随后这段寡核苷酸引物便分子进行复制，随后这段寡核

11、苷酸引物便成为新合成的成为新合成的DNA子链的一个组成部分。子链的一个组成部分。v因此所产生的新链便具有已发生突变的碱基序列因此所产生的新链便具有已发生突变的碱基序列,将其转入将其转入细胞后细胞后,经过不断复制经过不断复制,即可获得突变的即可获得突变的DNA分子分子,再经表达再经表达即可获得改造后蛋白质即可获得改造后蛋白质.v为了使目的基因的特定位点发生突变，所设计的寡核苷酸引为了使目的基因的特定位点发生突变，所设计的寡核苷酸引物的序列除了所需的突变碱基外，其余的则与目的基因编码物的序列除了所需的突变碱基外，其余的则与目的基因编码链的特定区段完全互补。链的特定区段完全互补。2.诱变过程诱变过程

12、1)合成含有目的合成含有目的基因的正链基因的正链DNA；2)合成含有特殊合成含有特殊突变碱基的引物；突变碱基的引物；3）制备异源双链）制备异源双链DNA（右图）；（右图）；4）富集和转化双）富集和转化双链链DNA分子；分子；5）筛选突变体并鉴定）筛选突变体并鉴定（二）（二）Kunkel定点诱变法定点诱变法v体外体外DNA合成往往是不完全的，所以部分合合成往往是不完全的，所以部分合成的成的DNA分子必须通过蔗糖密度梯度离心除分子必须通过蔗糖密度梯度离心除去去,获得纯化的突变获得纯化的突变DNA。v理论上来说，理论上来说，DNA是半保留复制的，应用寡是半保留复制的，应用寡核苷酸定点诱变时，所形成的

13、噬菌体中携带核苷酸定点诱变时，所形成的噬菌体中携带突变基因的应为一半。但实际上，由于技术突变基因的应为一半。但实际上，由于技术上的原因通常只有上的原因通常只有1-5%的噬菌斑含有突变基的噬菌斑含有突变基因的噬菌体。因的噬菌体。v因此，为了获得更多含有突变噬菌体的噬菌因此，为了获得更多含有突变噬菌体的噬菌斑，必须提高突变体的比率。目前已有多种斑，必须提高突变体的比率。目前已有多种改良的寡核苷酸定点诱变方法，此处将改良的寡核苷酸定点诱变方法，此处将Kunkel 1985年建立的方法做以简单介绍。年建立的方法做以简单介绍。v基本原理：基本原理：vKunkel定点诱变法是一种通定点诱变法是一种通过筛除

14、过筛除含有含有尿嘧啶尿嘧啶(U)的的DNA模模板链进行的寡核苷酸定点诱变法。它的基本原理是板链进行的寡核苷酸定点诱变法。它的基本原理是:v将待突变的基因克隆入将待突变的基因克隆入RF-M13 DNA载体上，导入含有载体上，导入含有dUTP酶（酶（dut）和）和N-尿嘧啶脱糖苷酶（尿嘧啶脱糖苷酶（ung）双缺陷双缺陷的大肠的大肠杆菌（杆菌（dut-，ung-）菌株中。）菌株中。(细胞内的细胞内的dUTP酶能将细胞内的酶能将细胞内的dUTP降解降解,使其含量减少使其含量减少;ung能将误入能将误入DNA新生链中的新生链中的dUTP切除切除.在在dut和和ung双缺双缺陷陷的大肠杆菌中的大肠杆菌中,

15、新合成的新合成的DNA链中含有链中含有U.)vdut缺陷导致细胞内缺陷导致细胞内dUTP水平上升，并在水平上升，并在DNA复制时，部分复制时，部分取代取代dTTP进入进入DNA新生链中。又由于新生链中。又由于ung缺陷使掺入缺陷使掺入DNA的的dUTP残基不能除去。由这种大肠杆菌菌株产生的残基不能除去。由这种大肠杆菌菌株产生的M13单单链链DNA大约有大约有1%的的T被被U所取代，然后所取代，然后 以其为模板以其为模板体外合成体外合成DNA的另一条链的另一条链(不含不含U)，双链，双链DNA导入导入正常的大肠杆菌中正常的大肠杆菌中，其其N-尿嘧啶脱糖苷酶切去尿嘧啶脱糖苷酶切去DNA链上的尿嘧啶

16、碱基。结果原来链上的尿嘧啶碱基。结果原来的的M13模板链被降解。只有突变链因不含模板链被降解。只有突变链因不含U，被保留下来。，被保留下来。这种方法产生的这种方法产生的M13噬菌体中含有突变噬菌体中含有突变DNA的比例大大增加。的比例大大增加。Kunkel定点诱变示意图定点诱变示意图（三）PCR定点诱变vPolymeraseChainReaction（PCR）是一）是一种体外酶促合成特定种体外酶促合成特定DNA片断的技术，是根片断的技术，是根据人类的需要对复杂生命过程的一种简单化据人类的需要对复杂生命过程的一种简单化的模拟。的模拟。PCR技术的原理是技术的原理是DNA半保留复制。半保留复制。首

17、创。首创。PCR原理简介原理简介vThe principle：v以待扩增的以待扩增的DNA分子为模板，分子为模板，DNA变性后，以一对变性后，以一对分别与模板分别与模板5末端和末端和3末端互补的寡核苷酸片段为末端互补的寡核苷酸片段为引物，在引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸至完成新的机制沿着模板链延伸至完成新的DNA合成，重复这合成，重复这一过程，即可使目的一过程，即可使目的DNA片段得到扩增。片段得到扩增。v反应体系的基本成分反应体系的基本成分模板模板DNA、特异性、特异性引物引物、耐、耐热性热性DNA聚合酶、聚合酶、dNTP、含

18、、含Mg2+的缓冲液。的缓冲液。v包括如下基本反应步骤：包括如下基本反应步骤：v变性变性(denaturation:Heat to 95 to melt strands)，将反应系统加热至，将反应系统加热至95，使模板，使模板DNA完完全变性成为单链，同时引物自身和引物之间存在的全变性成为单链，同时引物自身和引物之间存在的局部双链也得以消除；局部双链也得以消除；v退火退火(annealling:Cool to55 to anneal primers with template strand)，将温度下降至适，将温度下降至适宜温度（宜温度（55左右）使左右）使引物与模板引物与模板DNA退火结合退

19、火结合；v延伸延伸(extension:Extend primers with Taq polymerase)，将温度升至，将温度升至72，DNA聚合酶以聚合酶以dNTP为底物摧化为底物摧化DNA的合成反应。上述三个步骤的合成反应。上述三个步骤称为一个循环，新合成的称为一个循环，新合成的DNA分子继续作为下一轮分子继续作为下一轮合成的模板，合成的模板，经多次循环（经多次循环（25-30次）后次）后即可达到即可达到扩增扩增DNA片段的目的。片段的目的。v5.AAGGCTTTGCCGATAGGCCATAAGCAGTGCA.3v3.TTCCGAAACGGCTATCCGGTATTCGT CACGT.5

20、 v 变性变性 退火退火(杂交杂交)v5.AAGGCTTTGCCGATAGGCCATAAGCAGTGCA.3v ATTCGT 5 引物引物v 5 AGGCTTv3.T TCCGAAACGGCTATCCGGTATTCGT CACGT.5 v v 延伸延伸v5AAGGCTTTGCCGATAGGCCATAAGCAGTGCA.3v TTCCGAAACGGCTATCCGGTATTCGT 5 v 5 AGGCTTTGCCGATAGGCCATAAGCAGTGCA.v3.T TCCGAAACGGCTATCCGGTATTCGTCACGT.5 v v5AAGGCTTTGCCGATAGGCCATAAGCAGTGCA

21、.3 TTCCGAAACGGCTATCCGGTATTCGT 5 5AAGGCTTTGCCGATAGGCCATAAGCAGTGCA.3 ATTCGT 5 5 AGGCTT TTCCGAAACGGCTATCCGGTATTCGT 5 5AAGGCTTTGCCGATAGGCCATAAGCAGTGCA.3 TTCCGAAACGGCTATCCGGTATTCGT 5 5 AGGCTTTGCCGATAGGCCATAAGCA 3 TTCCGAAACGGCTATCCGGTATTCGT 5 v5 AGGCTTTGCCGATAGGCCATAAGCA 3 v3 TCCGAAACGGCTATCCGGT ATTCGT 5v

22、 变性变性 退火退火v5 AGGCTTTGCCGATAGGCCATAAGCA 3 v ATTCGT 5v5 AGGCTTv3 TCCGAAACGGCTATCCGGT ATTCGT 5v 延伸延伸v5 AGGCTTTGCCGATAGGCCATAAGCA 3 v3 TCCGAAACGGCTATCCGGT ATTCGT 5v5 AGGCTTTGCCGATAGGCCATAAGCA 3 v3 TCCGAAACGGCTATCCGGT ATTCGT 5vPCR定点诱变又称为定点诱变又称为PCR寡核苷酸定点诱变，该法具有简寡核苷酸定点诱变，该法具有简单、快捷的特点，其基本原理及操作程序如下：单、快捷的特点，其

23、基本原理及操作程序如下：v将待诱变靶基因克隆到质粒载体上，并分装到两个反应管将待诱变靶基因克隆到质粒载体上，并分装到两个反应管中；中；v在每一个反应管中加入两种特定的引物，其中引物在每一个反应管中加入两种特定的引物，其中引物1和和3均均含有错配核苷酸，但两个引物分别与质粒含有错配核苷酸，但两个引物分别与质粒DNA的不同链不完的不同链不完全互补，引物全互补，引物2和和4均不含有错配核苷酸，二者分别与质粒均不含有错配核苷酸，二者分别与质粒DNA的引物的引物1和和3杂交链的互补链完全互补；杂交链的互补链完全互补；v进行进行PCR扩增获得含有突变碱基的线型质粒扩增获得含有突变碱基的线型质粒DNA；v将

24、两个反应管中的线型质粒将两个反应管中的线型质粒DNA混合，再经过变性和复性，混合，再经过变性和复性，一个反应管中的一条链和另一个反映管中的互补链杂交，通一个反应管中的一条链和另一个反映管中的互补链杂交，通过两个粘性末端形成带有缺口的环状过两个粘性末端形成带有缺口的环状DNA分子；分子；v转化入大肠杆菌，环状转化入大肠杆菌，环状DNA分子的缺口可被大肠杆菌修复。分子的缺口可被大肠杆菌修复。如果同一反应管中的两个互补链又互相杂交，则继续形成线如果同一反应管中的两个互补链又互相杂交，则继续形成线状状DNA分子，在大肠杆菌中不稳定，易被降解。该方法把特分子，在大肠杆菌中不稳定，易被降解。该方法把特异突

25、变点导入克隆基因，无需把基因插入异突变点导入克隆基因，无需把基因插入M13中，即可在大中，即可在大肠杆菌中进行表达。肠杆菌中进行表达。PCR进行寡核苷酸进行寡核苷酸定点诱变的示意图定点诱变的示意图 第二节第二节 蛋白质工程蛋白质工程v一、蛋白质工程概论一、蛋白质工程概论v基因工程诞生10周年之际著名科学家Kevin 于1983年在SCIENCESCIENCE(VOL.219)发表了论文 Protein Protein EngineeringEngineering,该文的摘要是:vThe prospects for protein engineering,including the roles

26、of x-ray crystallography,chemical synthesis of DNA,and computer modeling of protein structure and folding,are is now possible to attempt to modify many different properties of proteins by combining information on crystal structure and protein chemistry with artificial gene techniques offer the poten

27、tial for altering protein structure and function in ways not possible by any other method.v该文的发表标志着作为生物工程三大技术之一的蛋白质工程诞生了。（一）蛋白质工程的概念（一）蛋白质工程的概念 Protein Engineeringv蛋白质工程是在重组蛋白质工程是在重组DNADNA技术应用于蛋白质结构与技术应用于蛋白质结构与功能研究之后发展起来的一门新兴学科。功能研究之后发展起来的一门新兴学科。所谓蛋白所谓蛋白质工程，就是通过对蛋白质已知结构和功能的了解，质工程，就是通过对蛋白质已知结构和功能的了解，

28、借助计算机辅助设计，利用基因定点诱变等技术，借助计算机辅助设计，利用基因定点诱变等技术，特异性地对蛋白质结构基因进行改造，产生具有新特异性地对蛋白质结构基因进行改造，产生具有新的特性的蛋白质的技术，并由此深入研究蛋白质的的特性的蛋白质的技术，并由此深入研究蛋白质的结构与功能的关系。结构与功能的关系。v蛋白质工程是在遗传工程取得的成就的基础上，融蛋白质工程是在遗传工程取得的成就的基础上，融合合蛋白质结晶学、蛋白质动力学、计算机辅助设计蛋白质结晶学、蛋白质动力学、计算机辅助设计和蛋白质化学和蛋白质化学等学科而迅速发展起来的一个新兴研等学科而迅速发展起来的一个新兴研究领域，它开创了按照人类意愿设计制

29、造符合人类究领域，它开创了按照人类意愿设计制造符合人类需要的蛋白质的新时期，因此，被誉为第二代遗传需要的蛋白质的新时期，因此，被誉为第二代遗传工程。蛋白质工程的出现，为认识和改造蛋白质分工程。蛋白质工程的出现，为认识和改造蛋白质分子提供了强有力的手段。子提供了强有力的手段。（二）蛋白质工程的理论基础（二）蛋白质工程的理论基础v1.工、农业以及医药卫生事业的高速发工、农业以及医药卫生事业的高速发 展展为蛋白质工程的开展开拓了广阔应用前景为蛋白质工程的开展开拓了广阔应用前景v2.蛋白质结构与功能关系研究技术的建立推蛋白质结构与功能关系研究技术的建立推动了蛋白质结构与功能关系的研究，从而为动了蛋白质

30、结构与功能关系的研究，从而为蛋白质改造提供了理论依据蛋白质改造提供了理论依据v3.基因工程理论和技术的发展，为蛋白质的基因工程理论和技术的发展，为蛋白质的改造和生产提供了必要的技术手段改造和生产提供了必要的技术手段1.工、农业以及医药卫生事业的高速发展工、农业以及医药卫生事业的高速发展 为蛋白质工程的开展开拓了广阔应用前景为蛋白质工程的开展开拓了广阔应用前景v酶的专一性强，在温和条件下能有效地催化化学反酶的专一性强，在温和条件下能有效地催化化学反应的能力，使酶的应用日益广泛。药品、化学、食应的能力，使酶的应用日益广泛。药品、化学、食品工业及分析服务行业是酶开发的重要领地。妨碍品工业及分析服务行

31、业是酶开发的重要领地。妨碍酶开发利用的原因主要有：酶开发利用的原因主要有：v生物材料中酶含量甚少，用传统方法分离纯化酶蛋生物材料中酶含量甚少，用传统方法分离纯化酶蛋白成本太高；白成本太高；v酶蛋白分子结构的稳定性差，过酸、过碱、高温、酶蛋白分子结构的稳定性差，过酸、过碱、高温、氧化等因素可破坏其结构，使其丧失生物活性，因氧化等因素可破坏其结构，使其丧失生物活性，因而在工业加工条件下，酶的半衰期短，利用率低；而在工业加工条件下，酶的半衰期短，利用率低；v酶催化活性的最适酶催化活性的最适pHpH值及底物专一性的范围较窄，值及底物专一性的范围较窄，与工业应用的要求有较大差距。与工业应用的要求有较大差

32、距。v因此，要想扩大酶蛋白的开发利用，需要建立适当因此，要想扩大酶蛋白的开发利用，需要建立适当的方法，以改善酶蛋白的生物特性，使之适合于工的方法，以改善酶蛋白的生物特性，使之适合于工业应用的需求。业应用的需求。2.蛋白质结构与功能关系研究技术的建立推动蛋白质结构与功能关系研究技术的建立推动了蛋白质结构与功能关系的研究，从而为蛋白了蛋白质结构与功能关系的研究，从而为蛋白质改造提供了理论依据质改造提供了理论依据v蛋白质工程的重要目标之一，是通过改造蛋白质的蛋白质工程的重要目标之一，是通过改造蛋白质的结构来提高其开发利用的价值。这就是说，蛋白质结构来提高其开发利用的价值。这就是说，蛋白质的结构改变了

33、，其生物学功能不能变。的结构改变了，其生物学功能不能变。v蛋白质结构与功能关系的研究表明，蛋白质功能部蛋白质结构与功能关系的研究表明，蛋白质功能部位的几个氨基酸残基决定着蛋白质的功能，但是这位的几个氨基酸残基决定着蛋白质的功能，但是这几个负责功能的氨基酸残基必须处于一个极其精密几个负责功能的氨基酸残基必须处于一个极其精密的空间状态下才能发挥功能。只要能维持蛋白质结的空间状态下才能发挥功能。只要能维持蛋白质结构域的必须氨基酸及其空间构象不变，其功能域的构域的必须氨基酸及其空间构象不变，其功能域的生物学活性就会保持不变。生物学活性就会保持不变。v因此在对蛋白质进行改造之前必需对其结构因此在对蛋白质

34、进行改造之前必需对其结构与功能的关系进行充分地研究，了解影响蛋与功能的关系进行充分地研究，了解影响蛋白质特性的氨基酸或氨基酸序列是哪些？改白质特性的氨基酸或氨基酸序列是哪些？改变这个（些）氨基酸是否会影响蛋白质的功变这个（些）氨基酸是否会影响蛋白质的功能？因此阐明蛋白质的三维结构，进而研究能？因此阐明蛋白质的三维结构，进而研究其与生物学功能的关系已成为了解生命现象其与生物学功能的关系已成为了解生命现象的关键，并成为蛋白质工程的基础。的关键，并成为蛋白质工程的基础。v蛋白质结构与功能关系研究技术主要包括蛋蛋白质结构与功能关系研究技术主要包括蛋白质晶体学、蛋白质动力学、生物信息学等白质晶体学、蛋白

35、质动力学、生物信息学等。3.基因工程理论和技术的发展，为蛋白质基因工程理论和技术的发展，为蛋白质的改造和生产提供了必要的技术手段的改造和生产提供了必要的技术手段v随着基因工程理论和技术的发展，人们已经随着基因工程理论和技术的发展，人们已经能克隆特异蛋白质的基因，并令其在适宜宿能克隆特异蛋白质的基因，并令其在适宜宿主菌中表达，使蛋白质的产量大大提高，因主菌中表达，使蛋白质的产量大大提高，因而降低蛋白质纯化成本的问题已基本解决。而降低蛋白质纯化成本的问题已基本解决。重要的问题是提高酶蛋白的稳定性，改良其重要的问题是提高酶蛋白的稳定性，改良其生物学特性。生物学特性。v稳定蛋白质空间构象的主要因素是蛋

36、白质分子众多基团间的稳定蛋白质空间构象的主要因素是蛋白质分子众多基团间的相互作用，如相互作用，如肽键肽键和侧链间的和侧链间的氢键氢键、带有不同电菏的侧链间、带有不同电菏的侧链间的的静电作用静电作用、极性氨基酸残基侧链间的、极性氨基酸残基侧链间的偶极作用偶极作用、疏水残基、疏水残基间的间的疏水作用疏水作用以及分子内的以及分子内的二硫键二硫键等。等。v蛋白质结构与功能研究表明，上述稳定蛋白质空间构象的因蛋白质结构与功能研究表明，上述稳定蛋白质空间构象的因素是由蛋白质一级结构中某一个或某一段氨基酸序列决定的，素是由蛋白质一级结构中某一个或某一段氨基酸序列决定的，人工改变或修饰这些氨基酸残基，有可能增

37、加蛋白质的稳定人工改变或修饰这些氨基酸残基，有可能增加蛋白质的稳定性，又不影响其生物学活性。性，又不影响其生物学活性。v如野生型枯草杆菌蛋白酶的如野生型枯草杆菌蛋白酶的218218位位天冬酰胺天冬酰胺(Asn)(Asn)是酶活性部是酶活性部位有关的氨基酸残基，若将其变成位有关的氨基酸残基，若将其变成丝氨酸丝氨酸(Ser)(Ser)，用，用6565的失的失活半衰期衡量，从活半衰期衡量，从5959分钟增到分钟增到223223分钟，酶的稳定性显著增分钟，酶的稳定性显著增加。加。v再如氧化失活使枯草杆菌蛋白酶在工业上的应用受到严重限再如氧化失活使枯草杆菌蛋白酶在工业上的应用受到严重限制。很早就有人证实

38、制。很早就有人证实枯草杆菌蛋白酶在少量枯草杆菌蛋白酶在少量H H2 2OO2 2作用下很作用下很快失活是由于埋藏在催化部位快失活是由于埋藏在催化部位Ser221Ser221邻近的邻近的蛋氨酸蛋氨酸(Met222)(Met222)氧化成硫氢化物的原因。氧化成硫氢化物的原因。19851985年年WellsWells证明若用其他氨基酸证明若用其他氨基酸取代取代Met222Met222，可以提高酶的氧化稳定性而又保持高催化活，可以提高酶的氧化稳定性而又保持高催化活性性。v目前我们已经能对蛋白质的结构进行改造，目前我们已经能对蛋白质的结构进行改造，甚至于能制造出全新的蛋白质，这得益于分甚至于能制造出全新

39、的蛋白质，这得益于分子生物学理论与技术的发展。子生物学理论与技术的发展。2020世纪世纪7070年代年代初期，初期，DNADNA重组技术诞生，并成功地应用于重组技术诞生，并成功地应用于基因操作，从而产生了基因工程基因操作，从而产生了基因工程(7373年年)。而。而基因工程的诞生，基因工程的诞生，特别是特别是DNADNA重组技术重组技术和和定定点诱变技术点诱变技术的建立的建立，使我们有可能从基因水，使我们有可能从基因水平改造蛋白质分子中氨基酸的序列，为蛋白平改造蛋白质分子中氨基酸的序列，为蛋白质工程的诞生质工程的诞生(8383年年)，奠定了技术基础。，奠定了技术基础。(三)蛋白质工程的研究内容蛋

40、白质工程的研究内容v1.利用已知蛋白质一级结构的信息作为应用利用已知蛋白质一级结构的信息作为应用研究研究v2.定量研究蛋白质结构与功能的关系定量研究蛋白质结构与功能的关系v3.根据已知结构根据已知结构-功能的关系人工改造蛋白质功能的关系人工改造蛋白质1.利用已知蛋白质一级结构的信息作利用已知蛋白质一级结构的信息作为应用研究为应用研究v蛋白质的结构决定蛋白质的功能和理化性质，而蛋蛋白质的结构决定蛋白质的功能和理化性质，而蛋白质功能区的某个或某些氨基酸残基可能在维持蛋白质功能区的某个或某些氨基酸残基可能在维持蛋白质的结构、功能、理化性质中起重要作用。因此，白质的结构、功能、理化性质中起重要作用。因

41、此，定点改变这些氨基酸序列，即可能改变蛋白质的功定点改变这些氨基酸序列，即可能改变蛋白质的功能和特性，使之更适合于工业化生产的要求。能和特性，使之更适合于工业化生产的要求。v如前所述枯草杆菌蛋白酶之所以易被氧化失活，是如前所述枯草杆菌蛋白酶之所以易被氧化失活，是由于催化部位的由于催化部位的Ser221Ser221邻近的邻近的Met222Met222易被氧化成硫易被氧化成硫氢化物，若以其他氨基酸取代氢化物，若以其他氨基酸取代Met222Met222，则可提高酶，则可提高酶的氧化稳定性而又不影响其催化活性。这是结构分的氧化稳定性而又不影响其催化活性。这是结构分析和定点突变改造蛋白质的成功范例。析和

42、定点突变改造蛋白质的成功范例。2.定量研究蛋白质结构与功能的关系定量研究蛋白质结构与功能的关系v这是目前蛋白质工程研究的主体。这一类研这是目前蛋白质工程研究的主体。这一类研究的课题很广泛，包括蛋白质三维结构模型究的课题很广泛，包括蛋白质三维结构模型的建立，配体结合和酶催化的性质，蛋白质的建立，配体结合和酶催化的性质，蛋白质折叠和稳定性研究，蛋白质变异等等。这类折叠和稳定性研究，蛋白质变异等等。这类研究看起来偏重理论，但对于指导实际工程研究看起来偏重理论，但对于指导实际工程意义重大。意义重大。3.根据已知结构根据已知结构-功能关系人工改造蛋白功能关系人工改造蛋白质质v根据蛋白质结构和功能的关系，

43、采用基因定点诱变根据蛋白质结构和功能的关系，采用基因定点诱变技术，人工改造蛋白质则是蛋白质工程的主要研究技术，人工改造蛋白质则是蛋白质工程的主要研究内容之一。其主要研究内容如下：内容之一。其主要研究内容如下：v通过改变蛋白质的活性部位，提高其生物功效及独通过改变蛋白质的活性部位，提高其生物功效及独立工作的能力；立工作的能力；v通过改变蛋白质的结构顺序，提高其在极端条件通过改变蛋白质的结构顺序，提高其在极端条件（如酸、碱、热等）下的稳定性；（如酸、碱、热等）下的稳定性；v通过改变蛋白质的结构顺序使其便于分离纯化。通过改变蛋白质的结构顺序使其便于分离纯化。v这项研究虽然难度较大，但随着人类基因组研

44、究、这项研究虽然难度较大，但随着人类基因组研究、后基因组研究的不断深入和完善，随着蛋白质工程后基因组研究的不断深入和完善，随着蛋白质工程研究技术和手段的不断发展，该项研究必将获得丰研究技术和手段的不断发展，该项研究必将获得丰硕的成果。硕的成果。蛋白质工程的程序蛋白质工程的程序v分离纯化纯蛋白质，分离纯化纯蛋白质，v测定其部分肽段一段结构，根据编码原则合成相应测定其部分肽段一段结构，根据编码原则合成相应同位素标记的寡苷酸探针同位素标记的寡苷酸探针;v以此从基因库中分离编码该蛋白质的克隆化基因，以此从基因库中分离编码该蛋白质的克隆化基因，转入噬菌体转入噬菌体M13M13系统，用双脱氧末端终止法进行

45、系统，用双脱氧末端终止法进行DNADNA序列分析序列分析;v通过表达载体获得较大量克通过表达载体获得较大量克)该蛋白质用于空间结构该蛋白质用于空间结构测定及结构与功能研究，借助计算机提出分子预测测定及结构与功能研究，借助计算机提出分子预测性质及改造方案性质及改造方案;v通过寡核苷酸通过寡核苷酸M13M13系统定点诱变并分离其突变体，系统定点诱变并分离其突变体，引入表达载体生产并纯化多量突变性蛋白质，分析引入表达载体生产并纯化多量突变性蛋白质，分析其性质指导进一步分子设计，以最终获得所预期性其性质指导进一步分子设计，以最终获得所预期性质的分子。质的分子。v二、定点诱变在二、定点诱变在蛋白质工程中

46、的应用的举例蛋白质工程中的应用的举例（一）加入二硫键增加蛋白质的稳定性（一）加入二硫键增加蛋白质的稳定性v蛋白质分子中两个半胱氨酸残基上的巯基蛋白质分子中两个半胱氨酸残基上的巯基（SH）之间氧化脱氢即形成二硫键（）之间氧化脱氢即形成二硫键（）。二硫键的数量与蛋白质的稳定性）。二硫键的数量与蛋白质的稳定性有关，增加蛋白质分子中的二硫键，可提高有关，增加蛋白质分子中的二硫键，可提高蛋白质分子的热稳定性、有机溶剂稳定性和蛋白质分子的热稳定性、有机溶剂稳定性和酸碱稳定性。酸碱稳定性。v在一项研究中，通过寡核苷酸定点诱变构建在一项研究中，通过寡核苷酸定点诱变构建了了T4溶菌酶的六种变异体溶菌酶的六种变异

47、体,比较了它们的活性比较了它们的活性.v表表41 T4溶菌酶和溶菌酶和6种设计的变体特性种设计的变体特性v酶酶 氨基酸的位置氨基酸的位置 二硫键的数目二硫键的数目 相对活性相对活性 Tmv 3 9 21 54 97 142 164 (%)()vwt Ile Ile Thr Cys Cys Thr Leuvpwt Ile Ile Thr Thr Ala Thr LeuvA Cys Ile Thr Thr Cys Thr LeuvB Ile Cys Thr Thr Ala Thr CysvC Ile Ile Cys Thr Ala Cys LeuvD Cys Cys Thr Thr Cys Thr

48、 CysvE Ile Cys Cys Thr Ala Cys CysvF Cys Cys Cys Thr Cys Cys Cysvwt：野生型：野生型T4溶菌酶；溶菌酶；pwt:假野生型酶；假野生型酶；AF：六种设计的半胱氨酸：六种设计的半胱氨酸变体；变体；Tm:熔点温度熔点温度（二）将天冬酰胺（二）将天冬酰胺(Asn)和谷氨酰胺和谷氨酰胺(Gln)转换转换成其他氨基酸成其他氨基酸v当蛋白质暴露于高温时当蛋白质暴露于高温时:v天冬酰胺（天冬酰胺（Asn）天冬氨酸天冬氨酸(Asp)+NH3v谷氨酰胺谷氨酰胺(Gln)谷氨酸谷氨酸(Glu)+NH3v导致肽链折叠的局部的改变导致肽链折叠的局部的改变

49、,可能影响其活性。可能影响其活性。v如酵母的如酵母的丙糖磷酸异构酶丙糖磷酸异构酶是由两个相同的亚基组成的二聚体，是由两个相同的亚基组成的二聚体，每个亚基都含有两个每个亚基都含有两个Asn残基，均位于两个亚基相互接触的残基，均位于两个亚基相互接触的表面上，可能与该酶的热稳定性有关。表面上，可能与该酶的热稳定性有关。v若将两个若将两个Asn全部换成全部换成Asp，则变体酶即使在常温下也不稳，则变体酶即使在常温下也不稳定，而且酶活性也大为降低；定，而且酶活性也大为降低；v而将而将2个个Asn分别换为分别换为苏氨酸苏氨酸(Thr)和和异亮氨酸异亮氨酸(Ile)，其半，其半衰期则延长。衰期则延长。v表表

50、43 酵母菌磷酸丙糖异构酶及其变体的热稳定酵母菌磷酸丙糖异构酶及其变体的热稳定性性v 氨基酸位点氨基酸位点v酶酶 14 78 半衰期（半衰期（min）v野生型野生型 Asn Asn 13v变体变体A Asn Thr 17v变体变体B Asn Ile 16v变体变体C Thr Ile 25v变体变体D Asp Asn 11 v酶的稳定性以在酶的稳定性以在100时半衰期或者失活率来表示。时半衰期或者失活率来表示。半衰期越长酶越稳定半衰期越长酶越稳定（三）减少游离（三）减少游离Cys残基的数目残基的数目v在利用在利用DNA重组技术表达外源基因时，常常重组技术表达外源基因时，常常会遇到这种情况：外源蛋