《基因克隆》PPT课件.ppt

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1、基因工程及体外表达体系基因工程及体外表达体系（2 2）.载体载体心血管病研究所心血管病研究所王王 佐佐一、概述外外源源DNA一一般般没没有有明明显显的的遗遗传传标标志志，如如果果将将其其导导入入宿宿主主细细胞胞，没没有有有有效效的的方方法法将将导导入入了了外外源源DNA的的细细胞胞和和未未导导入入外外源源DNA的的细胞区分开来。细胞区分开来。外外源源DNA导导入入宿宿主主细细胞胞后后，不不能能随随宿宿主主细细胞胞的的繁繁殖殖而而复复制制，达达不不到到使使外外源源DNA片片段段扩增的目的。扩增的目的。1载体（vector）携携带带靶靶DNA片片段段（外外源源DNA片片段段）进入宿主细胞进行扩增和

2、表达的工具。进入宿主细胞进行扩增和表达的工具。宿主细胞，常见的有大肠杆菌、酵母等。宿主细胞，常见的有大肠杆菌、酵母等。2载体的特征：能自主复制；能自主复制；具备筛选标记；具备筛选标记；适当大小的分子量和适当限制性内切酶适当大小的分子量和适当限制性内切酶酶切位点；酶切位点；在细胞中拷贝数高在细胞中拷贝数高除上述特征外，表达载体还应配备有与除上述特征外，表达载体还应配备有与宿主细胞相适应的启动子、前导顺序、宿主细胞相适应的启动子、前导顺序、加尾信号、增强子等调控加尾信号、增强子等调控DNA元件。元件。3 载体的分类按来源分：质粒、噬菌体、病毒载体等；按来源分：质粒、噬菌体、病毒载体等；按用途和功能

3、分：克隆载体和表达载体。按用途和功能分：克隆载体和表达载体。克隆载体与表达载体克克隆隆载载体体：主主要要用用来来获获得得大大量量纯纯化化的的目目的的DNA片片段段（目目的的基基因因），以以便便进进一一步步研研究究其其结结构构和和功能；功能；本章主要以克隆载体为例讲解本章主要以克隆载体为例讲解。表表达达载载体体：主主要要用用来来产产生生插插入入基基因因和和mRNA，进而合成相关蛋白质。进而合成相关蛋白质。二、质粒载体 PlasmidPlasmid：细细菌菌染染色色体体外外小小型型双双链链环环状状DNADNA，对对细细菌菌的的某某些些代代谢谢活活动动和和抗抗药药性的表型具有一定的作用。性的表型具有

4、一定的作用。1 1 概念概念2 严紧型质粒与松驰型质粒的区别严紧型质粒严紧型质粒松驰型质粒松驰型质粒质粒复制所需的酶质粒复制所需的酶DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA聚合酶聚合酶每每个个细细胞胞中中所所含含的的质质粒数粒数1 15 5个个1010200200个以上个以上质质粒粒复复制制与与细细菌菌复复制制的关系的关系密切密切能在没有蛋白质合成能在没有蛋白质合成的情况下继续复制的情况下继续复制在在基基因因克克隆隆中中的的应应用用前景前景小小大大3 Specificity of Plasmid VectorsAutonomously replicating DNA moleculesn(have

5、 an origin of replication)Selectable marker,such as drug resistanceInsertion site for foreign DNAn(often a genetically engineered multiple cloning region with sites for several restriction enzymes)multiple cloning sites 人人工工合合成成的的DNADNA序序列列，含含有有密密集集排排列列的的多多种种限限制制性性内内切切酶酶识识别别序序列列，以以利利于于不不同同来来源源的的外外源源

6、DNADNA片段插入载体。片段插入载体。pBRpBR系列载体系列载体4 pBR质粒载体筛选的原理质粒载体筛选的原理5 pBR质粒载体的筛选方法质粒载体的筛选方法双抗生素对照筛选法双抗生素对照筛选法6 pUC系列载体 由由pBR质质粒粒与与M13噬噬菌菌体体构构建建成成的的双双链链DNA质粒载体，长质粒载体，长2674bp，1983年构建。年构建。（1 1）构建）构建主主要要特特点点：氨氨苄苄青青霉霉素素抗抗性性基基因因、lac lac Z Z基基因因、复制起始点（复制起始点（oriori）（2）筛选原理及方法 含含有有来来自自大大肠肠杆杆菌菌的的lacZ操操纵纵子子的的DNA片片段段（lacZ

7、基基因因），编编码码-半半乳乳糖糖苷苷酶酶氨氨基基端端的的一一个个片片段段。此此片片段段能能与与宿宿主主细细胞胞所所编编码码的的缺缺陷陷型型-半半乳乳糖糖苷苷酶酶实实现现基基因因内内互互补补（互互补补），形形成成完完整整的的-半半乳糖苷酶。该酶能分解乳糖苷酶。该酶能分解X-gal，形成蓝色菌落。，形成蓝色菌落。外外源源基基因因插插入入载载体体后后，lacZ被被破破坏坏，不不能能分分解解X-gal，菌落呈白色。，菌落呈白色。“蓝白斑蓝白斑”筛选法。筛选法。7质粒载体的主要用途保存和扩增片段小于保存和扩增片段小于2kb的的DNA；构建构建cDNA文库；文库；目的目的DNA测序；测序；制备探针。制备

8、探针。缺点：所能接受的缺点：所能接受的DNADNA片段容量小；转化效率低。片段容量小；转化效率低。三、噬菌体载体 噬噬菌菌体体的的基基因因组组是是约约50kb的的线线性性双双链链DNA分分子子，两两端端各各有有12个个核核苷苷酸酸的的5突突出出，碱碱基基互互补补（cos位位点点，又又称称粘粘端端）。噬噬菌菌体体感感染染宿宿主主菌菌后后，其其粘粘端端通通过过碱碱基基配对而结合，形成环状配对而结合，形成环状DNA分子。分子。1噬菌体在细菌内的生长方式：裂裂菌菌性性生生长长（lytic pathway）：在在宿宿主主菌菌中中大大量量复复制制并并组组装装成成子子代代噬噬菌菌体体颗颗粒粒，导导致致宿宿主

9、主菌裂解。菌裂解。溶溶菌菌性性生生长长（lysogenic pathway）：整整合合到到宿宿主主菌菌DNA分分子子中中，随随宿宿主主菌菌DNA复复制制并并转转到到子代细菌中。子代细菌中。2噬菌体结构 野野生生型型的的噬噬菌菌体体基基因因组组庞庞大大而而复复杂杂，有有约约48.5kb48.5kb，约约占占基基因因组组总总长长度度3030的的中中间间部部分分的的基基因因对对噬噬菌菌体体生生长长是是非非必必需需的的，可可以以直直接接插插入入外外源基因或切除该区域而由外源基因代替而不影响噬菌体的生存。源基因或切除该区域而由外源基因代替而不影响噬菌体的生存。DNADNA与与噬噬菌菌体体载载体体组组成成

10、重重组组DNADNA分分子子后后，还还不不能能直直接接转转染染宿宿主主细细胞胞，必必须须首首先先包包装装成成有有活活性性的的成成熟熟噬噬菌菌体体颗颗粒粒后后才才具具有有转转染染宿宿主主细细胞胞的的能能力力，重重组组DNADNA分分子子能能否否被被噬噬菌菌体体包包装装蛋蛋白白、头头部部所所识识别别而而被被包包装装，除除必必须须含含有有coscos位位点点外外，就就是是对对重重组组DNADNA分分子子长长度度有有严严格格的的限限制制，必必须须不不能能大大于于野野生生型型基基因因组组长长度度的的105105或或小小于于7575，否否则则均均不不能能被被包包装装成成有有活活性性的的噬噬菌菌体体颗颗粒粒

11、，因因此此噬噬菌菌体体载载体体大大致致允允许许插插入入外外源源基基因的长度范围为因的长度范围为151525kb25kb。噬菌体载体在细菌中以溶菌状态生长。它有两噬菌体载体在细菌中以溶菌状态生长。它有两种形式：插入载体和替代载体。种形式：插入载体和替代载体。3 插入载体 经经 人人 工工 改改 造造 而而 成成，具具 有有 单单 一一 的的EcoR酶酶切切位位点点，该该酶酶切切位位点点位位于于lacZ基基因因内内，使使用用蓝蓝白白斑斑筛筛选选法法。插插入入片片段段长长度度约约几几个个kb，主主要要用用于于构构建建cDNA文库。文库。插入载体的插入载体的筛选原理筛选原理 4 替代载体替代载体 噬菌

12、体基因组中央部分约有噬菌体基因组中央部分约有14kb14kb主要主要编码抑制性因子，非裂菌性生长所必需，编码抑制性因子，非裂菌性生长所必需，作为载体这部分可被外源作为载体这部分可被外源DNADNA所替代。所替代。此此载载体体中中央央部部分分两两端端有有三三个个酶酶切切位位点点。可可插插入入片片段段的的长长度度约约9 922kb22kb，主主要要用用于于构构建建基基因组文库。因组文库。不足：噬噬菌菌体体载载体体在在进进行行真真核核基基因因组组文文库库构构建建时时，其其容容量量仍仍然然受受到到一一定定的的限限制。最大插入片段不能超过制。最大插入片段不能超过23kb。四、粘粒载体 1978年年构构建

13、建，由由质质粒粒和和噬噬菌菌体体的的cos粘粘性性末末端端构构建建而而成成。插插入入片片段段2945kb。可可根根据据载载体体携携带带的的抗抗药药性性标标记记筛筛选选阳阳性性克隆细胞株。克隆细胞株。构构成成：质质粒粒复复制制起起始始点点、一一个个或或多多个个限限制制性性内内切切酶酶位位点点、抗抗药药性性基基因因、噬噬菌菌体体的的coscos位位点。粘粒载体大小为点。粘粒载体大小为4 46kb6kb。粘粒克隆外源DNA的步骤：外源外源DNA与粘粒载体用同一种内切酶酶切；与粘粒载体用同一种内切酶酶切；连接酶连接，外源连接酶连接，外源DNA插入到两个线状粘粒之间；插入到两个线状粘粒之间；离离体体包包

14、装装，组组成成成成熟熟的的噬噬菌菌体体颗颗粒粒。该该过过程程对对DNA分分子子长长度度有有严严格格的的限限制制，过过长长或或过过短短均均不不能能被被包包装装，所所以以虽虽然然粘粘粒粒只只有有几几千千个个碱碱基基，但但要要求求插插入入的的外外源源基基因因却却必必须须是是大大片片段（段（2545kb）。）。体体外外包包装装好好的的颗颗粒粒感感染染宿宿主主菌菌，重重组组载载体体由由于于缺缺乏乏噬噬菌菌体体其其他他部部分分基基因因，故故不不能能像像噬噬菌菌体体一一样样复复制制，只只能能像像质质粒粒一一样扩增。样扩增。五、BAC(bacterial artificial chromosome)与标准的质

15、粒载体相似，但有不同的与标准的质粒载体相似，但有不同的ori和编码和编码ori蛋白的蛋白的F因子；因子；可容纳大于可容纳大于300kb的外源的外源DNA；重组子可通过电脉冲穿孔高效导入细菌细胞；重组子可通过电脉冲穿孔高效导入细菌细胞；进入细胞的拷贝数低。进入细胞的拷贝数低。六、YAC(yeast artificial chromosome)由酵母的染色体经人工改建而成。由酵母的染色体经人工改建而成。优点优点：1 1 酵母是真核细胞，能真核基因序列，尤其是重复序列；酵母是真核细胞，能真核基因序列，尤其是重复序列；2 2 能克隆很大的能克隆很大的DNADNA片段（片段（2Mb2Mb）。）。缺点缺点

16、：转化效率低，形成的克隆数少，每个细胞仅含一个拷贝。转化效率低，形成的克隆数少，每个细胞仅含一个拷贝。人类基因组计划中作物理图的工具。人类基因组计划中作物理图的工具。YACYAC载载体体序序列列包包括括着着丝丝粒粒序序列列（CEN1CEN1）、端端粒粒序序列列（TEL TEL 使使线线形形DNADNA的的完完全全复复制制和和保保护护染染色色体体末末端端免免于于核核酸酸酶酶的的降降解解）、自自主主复复制制序序列列（ARS1 ARS1 主主导导染染色色体体DNADNA的的自自主主复复制制）、氨氨苄苄青青霉霉素素抗性基因（抗性基因（AmpAmp）、源于的复制起始区（）、源于的复制起始区（oriori

17、）。）。由由于于酵酵母母细细胞胞内内真真正正必必需需的的DNADNA片片段段主主要要限限于于几几百百碱碱基基对对，因因而而就就可可以以用用酵酵母母染染色色体体复复 制制 子子 ARSARS元元 件件 构构 建建 新新 型型 的的 克克 隆隆 载载 体体。YACYAC的的基基本本构构成成为为二二个个端端粒粒、一一个个着着丝丝粒粒及及ARSARS元元件件，以以适适当当大大小小的的外外源源DNADNA串串成成线线状状分子，端粒以正确取向位于末端。分子，端粒以正确取向位于末端。宿主宿主：酵母宿主菌：酵母宿主菌AB1380菌株含菌株含ade-2基因，因赭石突变呈红色；基因，因赭石突变呈红色；YAC含含S

18、UP4基因，克服基因，克服ade-2突变，使菌突变，使菌株恢复到野生型，呈白色。株恢复到野生型，呈白色。外源基因克隆进外源基因克隆进SUP4基因会引起插入失基因会引起插入失活，菌株重新变成突变型活，菌株重新变成突变型红色。红色。鉴定鉴定：Approximate Maximum Length of DNA That Can Be Cloned in VectorsVector TypeCloned DNA(kb)Plasmid20phage25Cosmid45P1 phage100BAC(bacterial artificial chromosome)300YAC(yeast artificia

19、l chromosome)1000七、表达载体原核细胞表达载体；原核细胞表达载体；真核细胞表达载体。真核细胞表达载体。表达载体适用于在受体细胞中表达外源表达载体适用于在受体细胞中表达外源基因，产生相关蛋白质。为产生大量天然状基因，产生相关蛋白质。为产生大量天然状态含量极少的蛋白组份提供了可能，具有重态含量极少的蛋白组份提供了可能，具有重要的医学应用价值（如：胰导素、干扰素等）要的医学应用价值（如：胰导素、干扰素等）。分为：。分为：可控制的高效启动子，可被可控制的高效启动子，可被RNA聚合酶识别，经诱导后聚合酶识别，经诱导后能启动目的基因转录出大量能启动目的基因转录出大量mRNA；调控序列、起始

20、密码子；调控序列、起始密码子；在克隆基因和启动子之间要有正确的阅读框架，不引起在克隆基因和启动子之间要有正确的阅读框架，不引起读框移位；读框移位；SD序列；序列；有很强的终止子，保证只转录目的基因，而不转录其他有很强的终止子，保证只转录目的基因，而不转录其他DNA。除克隆载体需要的一些序列外（选择性标记、多克隆位除克隆载体需要的一些序列外（选择性标记、多克隆位点等），还需要外源基因转录和表达所必需的元件：点等），还需要外源基因转录和表达所必需的元件：1原核表达载体产生非融合型表达蛋白载体产生非融合型表达蛋白载体：非融合蛋白是不与细菌的任：非融合蛋白是不与细菌的任何蛋白或多肽融合在一起的表达蛋白

21、。其优点是，它具有何蛋白或多肽融合在一起的表达蛋白。其优点是，它具有近似于真核生物体内蛋白质的结构。缺点是，易被细菌蛋近似于真核生物体内蛋白质的结构。缺点是，易被细菌蛋白酶所破坏。白酶所破坏。产生融合型表达蛋白载体产生融合型表达蛋白载体：融合型蛋白是指蛋白质的：融合型蛋白是指蛋白质的N末末端由原核端由原核DNA序列或其他序列或其他DNA序列编码，序列编码，C端由真核端由真核DNA的完整序列编码。这样产生的融合蛋白是由一条短的原核的完整序列编码。这样产生的融合蛋白是由一条短的原核多肽与真核蛋白质结合而成。优点是，抵御细菌蛋白酶的多肽与真核蛋白质结合而成。优点是，抵御细菌蛋白酶的降解，构成一些信号

22、肽使重组蛋白转移到细胞内合适的位降解，构成一些信号肽使重组蛋白转移到细胞内合适的位置。置。由由哈哈佛佛大大学学的的GilbertGilbert实实验验室室构构建建。在在大大肠肠杆杆菌菌细细胞胞中中能能高高水水平平表表达达外外源源基基因因。由由PBR322PBR322构构建建，包包括括：tactac杂杂合合强强启启动动子子、操操纵纵子子、SDSD序序列列、包包括括PUC8PUC8的的多多克克隆隆位位点点和和rrnB rrnB rRNArRNA转转录录终终止止子子。宿宿主主JM105JM105大大肠肠杆杆菌菌菌菌株株。属属于于非非融融合合型表达载体。型表达载体。载载体体含含有有：tactac启启动

23、动子子、LacLac操操纵纵基基因因、SDSD序序列列、LacILacI阻阻遏遏蛋蛋白白基基因因等等。SDSD序序列列下下游游是是谷谷胱胱甘甘肽肽巯巯基基转转移移酶酶基基因因，克克隆隆的的外外源源基基因因就就是是与与这这个个酶酶基基因因相相连连接接。基基因因表表达达产产物物为为谷谷胱胱甘甘肽肽巯巯基基转转移移酶酶和和目目的的基基因因的的融融合合体体。其其表表达达的的融融合合蛋蛋白白使使用用凝凝血血酶酶和和XaXa因因子子就就可可从从表表达达的的融融合合蛋蛋白白中中切切下下所所需需要要的蛋白质和多肽。的蛋白质和多肽。2 真核表达载体原核原核DNA序列：序列：Ori、抗生素抗性基因、单克隆位、抗生

24、素抗性基因、单克隆位点；点；启动子；启动子；增强子；增强子；终止信号和加终止信号和加poly A信号；信号；遗传选择标记（报告基因）：有效地筛选出转化遗传选择标记（报告基因）：有效地筛选出转化细胞。细胞。构成：构成：原理 多多使使用用病病毒毒载载体体。这这些些真真核核生生物物的的病病毒毒核核酸酸经经改改建建之之后后，具具有有真真核核细细胞胞可可以以识识别别的的启启动动子子，能能够够使使克克隆隆的的外外源源基基因因及及其其某某些些常常用用的的报报告告基基因因得得以以表表达达。当当这这些些病病毒毒感感染染宿宿主主细细胞胞后后，在在感感染染周周期期中中可可持持续续地地复复制制，从从而而使使基基因因组

25、组拷拷贝贝数数达达到到相相当当的的水水平平；若若克克隆隆的的外外源源目目的的基基因因可可以以插插入入到到这这些些病病毒毒的的基基因因组组中中，病病毒毒感感染染后后的的很很短短时时间间内内，其其拷拷贝贝数数也也会会增增加加，使基因达到有效的表达。使基因达到有效的表达。一、各种病毒载体系统的特点特征特征逆逆转转录录病病毒载体毒载体腺腺病病毒毒载载体体单单纯纯疱疱疹疹病毒载体病毒载体EB病病 毒毒载体载体腺腺相相关关病病毒载体毒载体痘痘病病毒毒载载体体野野 生生 型型 病病毒毒二二 倍倍 体体 正正链链 RNA病病毒毒 长长 810kb双双 链链 线线 状状DNA病病毒毒，长长36kb双双 链链 线

26、线 状状DNA病病毒毒，有有4种种异异构构体体，长长152kb双双 链链 线线 状状DNA病病毒毒，长长172kb单单 链链 线线 状状DNA病毒，病毒，双双 链链 线线 状状DNA病病毒毒，长长190kb外外 源源 基基 因因插插 入入 最最 大大容量容量8kb7.5kb30kb？4.4kb40kb在在 细细 胞胞 内内定位定位细胞核细胞核细胞核细胞核细胞核细胞核细胞核细胞核细胞核细胞核细胞浆细胞浆宿主范围宿主范围较宽较宽宽宽宽宽宽宽宽宽？基基 因因 表表 达达持续持续长长 期期、稳稳定表达定表达瞬时表达瞬时表达瞬时表达瞬时表达长期表达长期表达长长 期期、稳稳定表达定表达瞬时表达瞬时表达基基

27、 因因 表表 达达水平水平中等中等高高中等中等高高中等中等高高二、酵母细胞的表达载体酵母整合质粒；酵母整合质粒；酵母复制型质粒；酵母复制型质粒；酵母附加体质粒；酵母附加体质粒；酵母着丝点质粒。酵母着丝点质粒。酵母是一种低等真核细胞，对蛋白具有一定的修饰酵母是一种低等真核细胞，对蛋白具有一定的修饰作用。在酵母中有一种天然质粒，长约作用。在酵母中有一种天然质粒，长约2m2m，在酵母中，在酵母中，它的拷贝数高，但易丢失。目前常用酵母载体是以克隆它的拷贝数高，但易丢失。目前常用酵母载体是以克隆质粒载体为基础，插入酵母的启动子和终止子构建起来质粒载体为基础，插入酵母的启动子和终止子构建起来的，主要有以下

28、几种：的，主要有以下几种：三、昆虫细胞表达载体 昆昆虫虫细细胞胞能能有有效效地地对对表表达达外外源源蛋蛋白白进进行行加加工工修修饰饰，同同时时还还可可以以将将外外源源蛋蛋白白分分泌泌到到细细胞胞外外，易易于于蛋蛋白白的的分分离离和和纯纯化化。昆昆虫虫细细胞胞载载体体是是用用易易感感染染昆昆虫虫的的病病毒毒改改建建而而来来的的，常常用用的的是是昆昆虫虫杆杆状状病病毒毒载载体体。优优点点：容容量量大大，可可以以插插入入大大片片段段外外源源DNA，对对宿宿主主有有严严格格的的专专一一性性，对对脊脊椎椎动动物物无无害害，携携带带了了外外源源基基因因的的病病毒毒载载体体还还可可以以直直接接感感染染昆昆虫虫的的幼幼虫虫，表达大量的外源蛋白。表达大量的外源蛋白。四、电子克隆定定义义：通通过过基基因因数数据据库库序序列列搜搜索索、对对比比分分析析、拼拼接接整整合合，预预测测新新的的、假假定定的的全全长长基基因因，然然后后通通过过分分子子生生物物学学方方法法，加加以以证证实实，并并从从相相应应的的、细细胞胞中中获获得得这这种种基基因因，即即电电子子克克隆隆（in silico cloning）。）。基于基于EST数据库电子克隆程序数据库电子克隆程序基于基因组数据库电子克隆程序基于基因组数据库电子克隆程序