《蛋白质制备》PPT课件.ppt

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1、第二章蛋白质制备第二章蛋白质制备蛋白质分离纯化的一般程序蛋白质分离纯化的一般程序蛋白质的粗分离蛋白质的粗分离蛋白质的层析分离蛋白质的层析分离蛋白质的电泳分离蛋白质的电泳分离蛋白质的结晶蛋白质的结晶内内 容容 提提 要要（第二讲）（第二讲）（三）膜蛋白的释放（三）膜蛋白的释放膜蛋白膜蛋白外周蛋白外周蛋白固有蛋白固有蛋白去污剂去污剂阴离子去污剂阴离子去污剂（脱氧胆酸盐）（脱氧胆酸盐）阳离子去污剂阳离子去污剂（溴化十二烷基三甲胺）（溴化十二烷基三甲胺）两性离子去污剂两性离子去污剂非离子型去污剂非离子型去污剂（二甲基十二烷基甘氨酸）（二甲基十二烷基甘氨酸）（TritonX-100）增溶作用：抽提固有蛋

2、白时，既要削弱它与膜脂的疏水增溶作用：抽提固有蛋白时，既要削弱它与膜脂的疏水性结合，又要使它仍保持疏水基暴露在外的天然状态。性结合，又要使它仍保持疏水基暴露在外的天然状态。比较理想的增溶剂是去污剂。比较理想的增溶剂是去污剂。3.在低温（在低温（-20）下，用丙酮处理组织和细菌。）下，用丙酮处理组织和细菌。（四）胞外酶的分离（四）胞外酶的分离浓缩的方法是超滤。浓缩的方法是超滤。二、蛋白质的浓缩和脱盐二、蛋白质的浓缩和脱盐1.除盐方法：除盐方法：透析法透析法纤维过滤透析法纤维过滤透析法分子筛层析法分子筛层析法释放膜蛋白的方法：释放膜蛋白的方法：1.用磷酸脂酶用磷酸脂酶A消化膜脂肪。消化膜脂肪。2.

3、在高在高pH和较高温度下进行超声作用。和较高温度下进行超声作用。方法方法处理量处理量操作时间操作时间操作难易操作难易透析透析纤维过滤透析纤维过滤透析分子筛层析分子筛层析少量或数十毫升少量或数十毫升大量样品大量样品少量或数十毫克少量或数十毫克5h以上以上0.5h数小时数小时容易容易稍难稍难稍难稍难蛋白质的脱盐方法比较蛋白质的脱盐方法比较2.浓缩的方法浓缩的方法沉淀法沉淀法吸附到离子交换剂上吸附到离子交换剂上干胶吸附法干胶吸附法渗透浓缩法渗透浓缩法AB抽真空抽真空超滤液超滤液N2压力压力膜膜多孔多孔支板支板磁力搅拌器磁力搅拌器超滤器超滤器超滤浓缩法超滤浓缩法利用利用压力或离力或离心力心力强行使水行

4、使水和小分子和小分子杂质通通过超超滤膜膜(一种半透膜一种半透膜)除去，而蛋白除去，而蛋白质留在膜上，留在膜上，称称为超超过滤。超滤法是最近几年发展超滤法是最近几年发展起来的一种新技术，利用分起来的一种新技术，利用分子大小不同，来分离蛋白质。子大小不同，来分离蛋白质。三、沉淀法分级蛋白质三、沉淀法分级蛋白质（一）盐析法（一）盐析法蛋白质蛋白质 溶液溶液盐溶现象盐溶现象盐析现象盐析现象加盐加盐盐浓度低盐浓度低盐浓度高盐浓度高在浓盐溶液中，蛋白质溶解度的对数和溶液中离子强在浓盐溶液中，蛋白质溶解度的对数和溶液中离子强度成正比度成正比S=S0-KsI盐析方程式：盐析方程式：S-蛋白质在某一离子强度溶液

5、中的溶解度蛋白质在某一离子强度溶液中的溶解度I-中性盐的离子强度中性盐的离子强度 Ks-盐析常数盐析常数S0-蛋白质在无盐溶液中的溶解度蛋白质在无盐溶液中的溶解度盐析法盐析法:加入中性盐，使各种蛋白质依次分别沉淀的方加入中性盐，使各种蛋白质依次分别沉淀的方 法法S0-某一蛋白质在特定条件下的溶解度某一蛋白质在特定条件下的溶解度Ks是盐析常数，与溶质的结构、盐的价数有关。是盐析常数，与溶质的结构、盐的价数有关。如用如用表示表示S0，盐析方程式可写为：盐析方程式可写为：S=-KsI盐析常数盐析常数Ks代表盐析效率，它是与蛋白质和盐种类有关的特性代表盐析效率，它是与蛋白质和盐种类有关的特性常数。常数

6、。Ks分段盐析法：当盐的种类确定后，在一定分段盐析法：当盐的种类确定后，在一定pH和温度和温度条件下，利用不同蛋白质条件下，利用不同蛋白质Ks的不同，通过改变盐的的不同，通过改变盐的I值，值，使不同蛋白质分离。使不同蛋白质分离。对于同一种蛋白质，盐离子价数越高，盐析能力越强。对于同一种蛋白质，盐离子价数越高，盐析能力越强。PO43-SO42-C2O42-（CHOHCOO-）2 AC-Cl-NO3-K+Rb+Na+Cs+Li+NH4+Hofmeister序列：序列：-分段分段盐析法：在一定的盐析法：在一定的I值下，提高改变值下，提高改变pH及温度分及温度分离蛋白质。离蛋白质。蛋白质浓度影蛋白质浓

7、度影响盐析界限响盐析界限蛋白质浓度高，盐析界限宽。蛋白质浓度高，盐析界限宽。蛋白质浓度低，盐析界限窄。蛋白质浓度低，盐析界限窄。蛋白质浓度在蛋白质浓度在3.0%之间合适。之间合适。求一定体积蛋白质溶液应加饱和硫酸铵的毫升数求一定体积蛋白质溶液应加饱和硫酸铵的毫升数x：-所需所需饱和度（和度（%）V-蛋白质溶液体积蛋白质溶液体积分段盐析：利用不同的蛋白质所带电荷、水化程度分段盐析：利用不同的蛋白质所带电荷、水化程度不同，所需盐浓度不同分离。不同，所需盐浓度不同分离。x=v100-血浆清蛋白血浆清蛋白血浆球蛋白血浆球蛋白 饱饱 和和（NH4）2SO4 半半 饱饱 和和（NH4）2SO4盐析法优点：

8、盐析法优点：操作简便，使用广泛，中性盐对易变性的蛋白质有保护作用，能操作简便，使用广泛，中性盐对易变性的蛋白质有保护作用，能除去较多杂质，有纯化作用。除去较多杂质，有纯化作用。盐析法缺点：盐析法缺点：分辨能力差，纯化倍数低。分辨能力差，纯化倍数低。（二）有机溶剂沉淀法（二）有机溶剂沉淀法F-两个带电质点之间的作用力两个带电质点之间的作用力Q1Q2-两个带电质点电荷量两个带电质点电荷量r-两个带电质点之间的距离两个带电质点之间的距离-是介电常数是介电常数选择有机溶剂的原则：选择有机溶剂的原则：必须能与水完全混溶；必须能与水完全混溶；不与蛋白质发生反应；不与蛋白质发生反应；要有较好的沉淀效应；要有

9、较好的沉淀效应；溶剂蒸汽无毒，且不燃烧。溶剂蒸汽无毒，且不燃烧。F=r2Q1Q2乙醇和丙酮乙醇和丙酮使用最广泛使用最广泛库伦定律库伦定律（三）有机聚合物沉淀法（三）有机聚合物沉淀法（四）选择性变性沉淀法（四）选择性变性沉淀法有三种方法：有三种方法：热变性热变性pH变性变性有机溶剂变性有机溶剂变性有机溶剂沉淀法比盐析法分辨率高，广泛用于生产有机溶剂沉淀法比盐析法分辨率高，广泛用于生产蛋白质制剂。蛋白质制剂。PEG可沉淀蛋白质，聚丙烯酸可沉淀带正电蛋白质。可沉淀蛋白质，聚丙烯酸可沉淀带正电蛋白质。分配层析原理（俄国植物学家分配层析原理（俄国植物学家LiBer1903年提出）年提出）混合物在层析系统

10、中的分离决定于该混合物的混合物在层析系统中的分离决定于该混合物的组分在这两相分配系数。组分在这两相分配系数。层析系统层析系统固相固相液相液相半液相半液相液相液相气相气相第三节第三节 蛋白质的层析分离蛋白质的层析分离固定相固定相流动相流动相（静相）（静相）（动相）（动相）支持物支持物静相静相动相动相被分离被分离的物质的物质一、层析法的一般原理一、层析法的一般原理ABCDE321616168812412482212812345阶段阶段层析柱分离物质示意图层析柱分离物质示意图分配定律：分配定律：质量分配系数：质量分配系数：D=kVsVmVs-固定相体积固定相体积 Vm-流动相体积流动相体积D 1，大

11、多样品留在固相，大多样品留在固相，样品流速慢；样品流速慢；D 1，大多样品留在流相，大多样品留在流相，样品流速快；样品流速快；D=0，样品留在柱顶；，样品留在柱顶；D无限大，样品流到柱底；无限大，样品流到柱底；溶质通过柱的速度决定溶质通过柱的速度决定于它的质量分配系数于它的质量分配系数k=c1c2一定量的某一溶质在一定量的溶剂系统中分配时，转移一定量的某一溶质在一定量的溶剂系统中分配时，转移次数越多，即分溶管数越多，其分溶曲线越集中，即峰次数越多，即分溶管数越多，其分溶曲线越集中，即峰形越窄而高，这样有利于混合物中各物质的完全分离。形越窄而高，这样有利于混合物中各物质的完全分离。D=1的物质的

12、洗脱图谱的物质的洗脱图谱和平衡次数的关系。和平衡次数的关系。在柱上的相对分布在柱上的相对分布-+二、离子交换层析二、离子交换层析(IEX)（一）基本原理（一）基本原理+-+-+-+-支持物和带电配体支持物和带电配体带电样品分子带电样品分子平衡离子平衡离子阳离子交换剂阳离子交换剂：解离基团带负电，能结合阳离子。：解离基团带负电，能结合阳离子。阴离子交换剂阴离子交换剂：解离基团带正电，能结合阴离子。：解离基团带正电，能结合阴离子。当当pH pI时，分子带负电，可结合于阴离子交换剂上。时，分子带负电，可结合于阴离子交换剂上。当当pH pI时，分子带正电，可结合于阳离子交换剂上。时，分子带正电，可结合

13、于阳离子交换剂上。阳离子交换剂与带正电蛋白质分子之间有如下平衡：阳离子交换剂与带正电蛋白质分子之间有如下平衡：EXch-X+EXch-+X+EXch-+P+EXch-P+EXch+X-EXch+X-EXch+P-EXch+P-阴离子交换剂与带负电蛋白质分子之间有如下平衡：阴离子交换剂与带负电蛋白质分子之间有如下平衡：EXch-阳离子交换剂阳离子交换剂X+-平衡离子平衡离子P+-带正电的蛋白质分子带正电的蛋白质分子EXch+-阳离子交换剂阳离子交换剂X-平衡离子平衡离子P-带正电的蛋白质分子带正电的蛋白质分子带正正电荷多蛋白荷多蛋白紧密密结合合带负电荷多蛋白流荷多蛋白流过层析柱析柱离子交换层析离

14、子交换层析 蛋白质按照蛋白质按照在相应在相应pHpH条件条件下所带电荷的下所带电荷的不同而以不同不同而以不同的速度向下移的速度向下移动动 带有更多负带有更多负电荷的蛋白质电荷的蛋白质以更快的速度以更快的速度被洗脱被洗脱离子交换层析离子交换层析（二）离子交换剂的基本类型（二）离子交换剂的基本类型离子交换剂离子交换剂阳离子交换剂阳离子交换剂阴离子交换剂阴离子交换剂按酸碱性按酸碱性强酸强酸强碱强碱弱酸弱酸弱碱弱碱pH范围（范围（212）完全解离）完全解离低于低于pH4高于高于pH9难于解离，无交换能力难于解离，无交换能力蛋白质在蛋白质在pH6 8之间稳定，所以常用弱酸或弱碱型交换剂之间稳定，所以常用

15、弱酸或弱碱型交换剂1.离子交换纤维素离子交换纤维素具有松散的亲水网络，较大的表面积，吸附容量大，通透性具有松散的亲水网络，较大的表面积，吸附容量大，通透性好。好。2.离子交换葡聚糖凝胶离子交换葡聚糖凝胶既有离子交换剂的性质，又有分子筛效应。既有离子交换剂的性质，又有分子筛效应。3.交联凝胶离子交换剂交联凝胶离子交换剂可处理大量样品，适用于蛋白质的早期分离。可处理大量样品，适用于蛋白质的早期分离。（三）层析条件的选择（三）层析条件的选择1.离子交换剂的选择离子交换剂的选择带负电的物质，用阴离子交换剂；带负电的物质，用阴离子交换剂；带正电的物质，用阳离子交换剂。带正电的物质，用阳离子交换剂。实验室常用实验室常用DEAE-和和CM-交换剂。交换剂。在极低在极低pH条件下（条件下（pH 3）层析，使用）层析，使用P-或或SE交换剂；交换剂；在极高在极高pH条件下（条件下（pH 10）层析，使用）层析，使用GE-交换剂。交换剂。