华南师范大学答辩模.ppt

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1、20122012年度硕士论文答辩年度硕士论文答辩论文题目：肿瘤细胞论文题目：肿瘤细胞DNADNA样品基于二次谐波样品基于二次谐波发生发生（SHGSHG）的非线性光谱学成像）的非线性光谱学成像学位申请人：罗冬梅学位申请人：罗冬梅专业名称：光学专业名称：光学研究方向：生物组织的二次谐波成像研究方向：生物组织的二次谐波成像所在院系：生物光子学研究院所在院系：生物光子学研究院导师姓名和职称：金鹰导师姓名和职称：金鹰 副教授副教授 2012.06.042012.06.04contents讨论4研究背景和内容1实验原理、装置和流程2DNA样品的SHG成像结果3总结与展望5肿肿瘤瘤细细胞胞DNA样样品品基基

2、于于二二次次谐谐波波发发生生（SHG）的的非非线线性性光光谱谱学学成成像像SHG于1961年首次被Franken发现：当两个具有相同基频的光子同时与具有非对称结构的样品相互作用时，散射产生恰好双倍于激发频率的二次谐波光信号（半波长，双倍能量）。肿肿瘤瘤细细胞胞DNA样样品品基基于于二二次次谐谐波波发发生生（SHG）的的非非线线性性光光谱谱学学成成像像研究背景和研究背景和内容内容实验原理、装置实验原理、装置和流程和流程DNADNA样品的样品的SHGSHG成像成像结果结果讨论讨论总结和展望总结和展望SHG成像特点成像特点对生物组织无光损伤和光致毒。SHG具有高度的方向性。无需外源性标定物即可实现成

3、像。SHG显微成像不受前向发射性质的限制，可以与其它显微 成像装置联合成像，如TPEF、OCT等联合使用，进行成像 比较，实现信号互补。肿肿瘤瘤细细胞胞DNA样样品品基基于于二二次次谐谐波波发发生生（SHG）的的非非线线性性光光谱谱学学成成像像研究背景和研究背景和内容内容实验原理、装置实验原理、装置和流程和流程DNADNA样品的样品的SHGSHG成像成像结果结果讨论讨论总结和展望总结和展望SHG在生物学领域的应用SHGSHG成像技成像技术的应用术的应用肌肌动动球球蛋蛋白白胶胶原原蛋蛋白白微微管管蛋蛋白白结构蛋白结构蛋白白成像白成像细胞核（细胞核（DNA）SHG成像成像线线性性染染色色体体 鲱鲱

4、鲸鲸鱼鱼细细胞胞核核DNA前前列列腺腺癌癌细细胞胞核核糖元糖元淀粉淀粉纤维素纤维素手性结构的分子手性结构的分子肿肿瘤瘤细细胞胞DNA样样品品基基于于二二次次谐谐波波发发生生（SHG）的的非非线线性性光光谱谱学学成成像像研究背景和研究背景和内容内容实验原理、装置实验原理、装置和流程和流程DNADNA样品的样品的SHGSHG成像成像结果结果讨论讨论总结和展望总结和展望研究内容：研究内容：利用TPEF/SHG光谱学成像技术对不同DNA样品进行检测，来获取DNA样品（基因组DNA溶液、细胞核提取物以及培养细胞的细胞核）的SHG信号并进行高解析度成像。在实验结果的基础上通过对培养细胞添加少量的乙醇（体积

5、比小于5%）可以得到SHG信号。在此基础上，探讨乙醇对DNA构象的影响。肿肿瘤瘤细细胞胞DNA样样品品基基于于二二次次谐谐波波发发生生（SHG）的的非非线线性性光光谱谱学学成成像像研究背景和研究背景和内容内容实验原理、装置实验原理、装置和流程和流程DNADNA样品的样品的SHGSHG成像成像结果结果讨论讨论总结和展望总结和展望介质在强激光作用下，电极化强度与入射辐射的 场强E之间的关系可以表示为：P=(1)E+(2)E2+(3)E3 (1)是介质的一阶线性极化率；(2)和(3)分别表示介质的二阶、三阶非线性极化率；(2)E2正是二次谐波和双光子荧光激发等二阶非线性光学产生的根源。SHG的产生与

6、介质的二阶非线性极化率的存在率有关，(2)不为零。(2)与材料本身的特性有关，它反映了分子的中心对称性、介质分子排列和取向等细微结构。肿肿瘤瘤细细胞胞DNA样样品品基基于于二二次次谐谐波波发发生生（SHG）的的非非线线性性光光谱谱学学成成像像研究背景和研究背景和内容内容实验原理、实验原理、装置装置和和流程流程DNADNA样品的样品的SHGSHG成像成像结果结果讨论讨论总结和展望总结和展望二次谐波的产生条件：（1）非中心对称结构（2）相位匹配肿肿瘤瘤细细胞胞DNA样样品品基基于于二二次次谐谐波波发发生生（SHG）的的非非线线性性光光谱谱学学成成像像研究背景和研究背景和内容内容实验原理、实验原理、

7、装置装置和和流程流程DNADNA样品的样品的SHGSHG成像成像结果结果讨论讨论总结和展望总结和展望相位匹配相位匹配传播中的基波和不断产生的倍频极化波之间保持相位一致，相互干传播中的基波和不断产生的倍频极化波之间保持相位一致，相互干 涉，当相位完全匹配时产生的二次谐波输出功率最大。实际上就是涉，当相位完全匹配时产生的二次谐波输出功率最大。实际上就是 要求入射光与二次谐波倍频光在介质中的折射率相等（即传播速度要求入射光与二次谐波倍频光在介质中的折射率相等（即传播速度 相同）。相同）。肿肿瘤瘤细细胞胞DNA样样品品基基于于二二次次谐谐波波发发生生（SHG）的的非非线线性性光光谱谱学学成成像像研究背

8、景和研究背景和内容内容实验原理、实验原理、装置装置和和流程流程DNADNA样品的样品的SHGSHG成像成像结果结果讨论讨论总结和展望总结和展望 钛宝石飞秒激光器发出的超短钛宝石飞秒激光器发出的超短 脉冲激光通过声光调制器后到达双光脉冲激光通过声光调制器后到达双光子激光扫描显微镜作为激发光，经过子激光扫描显微镜作为激发光，经过主二向色性光束分束器由油浸物镜聚主二向色性光束分束器由油浸物镜聚焦到样品上，样品在基频光激发下产焦到样品上，样品在基频光激发下产生背向二次谐波再经油浸物镜收集，生背向二次谐波再经油浸物镜收集，经过红外光束滤色片滤除漫反射的基经过红外光束滤色片滤除漫反射的基频光后将激发光输送

9、到频光后将激发光输送到META探测，探测，由探测器探测后转变为电信号传输至由探测器探测后转变为电信号传输至计算机。计算机。肿肿瘤瘤细细胞胞DNA样样品品基基于于二二次次谐谐波波发发生生（SHG）的的非非线线性性光光谱谱学学成成像像研究背景和研究背景和内容内容实验原理、实验原理、装置装置和和流程流程DNADNA样品的样品的SHGSHG成像成像结果结果讨论讨论总结和展望总结和展望人肝癌细胞系BEL-7420购于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。细胞传代培养细胞传代培养基因组基因组DNA、细胞核的提取、细胞核的提取SHG成像成像培养肿瘤细胞提前一天接种于共聚焦显微镜专用培养皿培养肿瘤细胞提前

10、一天接种于共聚焦显微镜专用培养皿肿肿瘤瘤细细胞胞DNA样样品品基基于于二二次次谐谐波波发发生生（SHG）的的非非线线性性光光谱谱学学成成像像研究背景和研究背景和内容内容实验原理、实验原理、装置装置和和流程流程DNADNA样品的样品的SHGSHG成像成像结果结果讨论讨论总结和展望总结和展望基因组基因组DNA溶液的发射光谱溶液的发射光谱404nm处的波峰来自于处的波峰来自于SHG信号。信号。639nm处的波峰来自处的波峰来自卟啉及其衍生物的卟啉及其衍生物的TPEF信号。信号。肿肿瘤瘤细细胞胞DNA样样品品基基于于二二次次谐谐波波发发生生（SHG）的的非非线线性性光光谱谱学学成成像像研究背景和研究背

11、景和内容内容实验原理、流程实验原理、流程和装置和装置DNADNA样品的样品的SHGSHG成像成像结果结果讨论讨论总结和展望总结和展望 细胞核提取物的成像与光谱细胞核提取物的成像与光谱图像显示肝癌细胞核提取物具有很强的二次谐波图像显示肝癌细胞核提取物具有很强的二次谐波信号。信号。基因组基因组DNA溶液的发射光谱溶液的发射光谱404nm处有很强的处有很强的SHG信号。光谱图显示细胞核信号。光谱图显示细胞核提取物的提取物的SHG/TPEF信噪比较基因组信噪比较基因组DNA的高。的高。细胞核提取物的发射光谱细胞核提取物的发射光谱肿肿瘤瘤细细胞胞DNA样样品品基基于于二二次次谐谐波波发发生生（SHG）的

12、的非非线线性性光光谱谱学学成成像像研究背景和研究背景和内容内容实验原理、流程实验原理、流程和装置和装置DNADNA样品的样品的SHGSHG成像成像结果结果讨论讨论总结和展望总结和展望 培养细胞的培养细胞的SHG/TPEF成像成像肿肿瘤瘤细细胞胞DNA样样品品基基于于二二次次谐谐波波发发生生（SHG）的的非非线线性性光光谱谱学学成成像像添加了乙醇的肝癌细胞的二次谐波添加了乙醇的肝癌细胞的二次谐波双光子成像双光子成像明显强于未添加乙醇的肝癌细胞的二次谐波明显强于未添加乙醇的肝癌细胞的二次谐波双双光子成像。光子成像。常规培养状态下无常规培养状态下无SHG当添加一定量的乙醇后（体积比当添加一定量的乙醇

13、后（体积比5%）后，出现后，出现SHG。研究背景和研究背景和内容内容实验原理、流程实验原理、流程和装置和装置DNADNA样品的样品的SHGSHG成像成像结果结果讨论讨论总结和展望总结和展望结论：结论：基因组DNA和细胞核提取物DNA均能产生SHG信号，且 细胞核提取物的SHG/TPEF信噪比明显高于基因组DNA的 SHG/TPEF信号。常规状态下几乎观测不到来自培养细胞的细胞核核区的SHG信号。通过在培养基中添加少量无水乙醇（体积比小于5%），可以在培养细胞的细胞核区域检测到SHG信号。肿肿瘤瘤细细胞胞DNA样样品品基基于于二二次次谐谐波波发发生生（SHG）的的非非线线性性光光谱谱学学成成像像

14、研究背景和研究背景和内容内容实验原理、流程实验原理、流程和装置和装置DNADNA样品的样品的SHGSHG成像成像结果结果讨论讨论总结和展望总结和展望DNA产生二次谐波的原因：（1）DNA由核苷酸分子构成，核苷酸是手性分子，满足非中 心对称结构；（2）DNA的反向平行的双螺旋结构在一定的电场激发下，能 够实现相位匹配，满足产生SHG的产生条件。肿肿瘤瘤细细胞胞DNA样样品品基基于于二二次次谐谐波波发发生生（SHG）的的非非线线性性光光谱谱学学成成像像研究背景和研究背景和内容内容实验原理、流程实验原理、流程和装置和装置DNADNA样品的样品的SHGSHG成像成像结果结果讨论讨论总结和展望总结和展望

15、 在真核细胞中，DNA以非常致密的形式存在于细胞核中；基因组DNA是以线性双链的形态的存在于溶液中，DNA致密程度远低于细胞核DNA。基因组基因组DNA的的SHG/TPEF信噪比低于细信噪比低于细胞核胞核DNA的原因：的原因：肿肿瘤瘤细细胞胞DNA样样品品基基于于二二次次谐谐波波发发生生（SHG）的的非非线线性性光光谱谱学学成成像像研究背景和研究背景和内容内容实验原理、流程实验原理、流程和装置和装置DNADNA样品的样品的SHGSHG成像成像结果结果讨论讨论总结和展望总结和展望在细胞中DNA主要以B型构象存在，也包括Z型和A型构象。乙醇诱导乙醇诱导DNA构象发生改变构象发生改变 对于添加酒精后

16、培养细胞中出现对于添加酒精后培养细胞中出现SHG信号，我们推测是由于乙醇的加入改变了培养信号，我们推测是由于乙醇的加入改变了培养细胞细胞DNA的分子构象，导致的分子构象，导致DNA的某些光学特性发生了变化，从而引起的某些光学特性发生了变化，从而引起SHG的产生。的产生。DNA构象影响因素：（1）溶剂极性；（2）介电常数；（3）粘度；（4）离子浓度肿肿瘤瘤细细胞胞DNA样样品品基基于于二二次次谐谐波波发发生生（SHG）的的非非线线性性光光谱谱学学成成像像研究背景和研究背景和内容内容实验原理、流程实验原理、流程和装置和装置DNADNA样品的样品的SHGSHG成像成像结果结果讨论讨论总结和展望总结和

17、展望当加入乙醇到当加入乙醇到DNA溶液中，使得溶液中溶液中，使得溶液中水活性降低，致使结合到水活性降低，致使结合到DNA上的水分子上的水分子数减少，原来被水分子支撑而伸展的数减少，原来被水分子支撑而伸展的DNA沟槽收缩，大沟槽变得更窄更深，小沟槽沟槽收缩，大沟槽变得更窄更深，小沟槽变得更宽更浅，使得变得更宽更浅，使得DNA整体外形变得更整体外形变得更短，从而导致短，从而导致DNA构象由构象由B型向型向A型转变，型转变，这种转变将改变双螺旋结构中大沟槽和小这种转变将改变双螺旋结构中大沟槽和小沟槽的氢键类型。沟槽的氢键类型。肿肿瘤瘤细细胞胞DNA样样品品基基于于二二次次谐谐波波发发生生（SHG）的

18、的非非线线性性光光谱谱学学成成像像研究背景和研究背景和内容内容实验原理、流程实验原理、流程和装置和装置DNADNA样品的样品的SHGSHG成像成像结果结果讨论讨论总结和展望总结和展望 DNA随着乙醇浓度的增大稳定性会降随着乙醇浓度的增大稳定性会降低，推测当加入乙醇到培养的细胞中，乙低，推测当加入乙醇到培养的细胞中，乙醇小分子会通过核孔进入到细胞核内，致醇小分子会通过核孔进入到细胞核内，致使使DNA的稳定性降低从而使的稳定性降低从而使DNA与蛋白质与蛋白质的结合松散，使双链处于较松散的状态，的结合松散，使双链处于较松散的状态，有利于有利于DNA与与RNA结合致使构象发生改变。结合致使构象发生改变

19、。松散状态的松散状态的DNADNA与与RNA结合结合肿肿瘤瘤细细胞胞DNA样样品品基基于于二二次次谐谐波波发发生生（SHG）的的非非线线性性光光谱谱学学成成像像研究背景和研究背景和内容内容实验原理、流程实验原理、流程和装置和装置DNADNA样品的样品的SHGSHG成像成像结果结果讨论讨论总结和展望总结和展望反射式背向二次谐波信号强度由以下公式决定：反射式背向二次谐波信号强度由以下公式决定：由上式可知二次谐波信号强度与介质的二阶非线性极化率有关。由上式可知二次谐波信号强度与介质的二阶非线性极化率有关。肿肿瘤瘤细细胞胞DNA样样品品基基于于二二次次谐谐波波发发生生（SHG）的的非非线线性性光光谱谱

20、学学成成像像研究背景和研究背景和内容内容实验原理、流程实验原理、流程和装置和装置DNADNA样品的样品的SHGSHG成像成像结果结果讨论讨论总结和展望总结和展望 二阶非线性极化率又与材料本身的特性有关：二阶非线性极化率又与材料本身的特性有关：它反映了介质分子的中心对称性、介质分子排列和取向等细微结构。它反映了介质分子的中心对称性、介质分子排列和取向等细微结构。推测有可能乙醇的加入造成的推测有可能乙醇的加入造成的DNA构象的转变使得构象的转变使得DNA分子的二分子的二 阶非线性极化率阶非线性极化率(2)发生变化，继而导致介质的二次谐波加强，实验结发生变化，继而导致介质的二次谐波加强，实验结 果再

21、次说明了二次谐波对生物组织的微观结构的变化极其敏感。果再次说明了二次谐波对生物组织的微观结构的变化极其敏感。肿肿瘤瘤细细胞胞DNA样样品品基基于于二二次次谐谐波波发发生生（SHG）的的非非线线性性光光谱谱学学成成像像研究背景和研究背景和内容内容实验原理、流程实验原理、流程和装置和装置DNADNA样品的样品的SHGSHG成像成像结果结果讨论讨论总结和展望总结和展望 在活细胞中，由于细胞本身不满足非中心对称结构，每个核苷酸在活细胞中，由于细胞本身不满足非中心对称结构，每个核苷酸 分子产生的二次谐波相互叠加抵消使得我们在实验中并未观测到分子产生的二次谐波相互叠加抵消使得我们在实验中并未观测到SHG

22、的产生。的产生。当加入乙醇分子后，当加入乙醇分子后，DNA分子表面的电荷特性发生改变以及分子分子表面的电荷特性发生改变以及分子 的螺旋构象形态发生改变，使得每个分子在同样入射光的的激发下所产的螺旋构象形态发生改变，使得每个分子在同样入射光的的激发下所产 生的超极化强度与之前相比发生改变，在我们观察的生物组织区域内，生的超极化强度与之前相比发生改变，在我们观察的生物组织区域内，所有的二次谐波相位一致而相互干涉加强，满足相位匹配原理，使得我所有的二次谐波相位一致而相互干涉加强，满足相位匹配原理，使得我们在加入乙醇后观察到了们在加入乙醇后观察到了SHG。肿肿瘤瘤细细胞胞DNA样样品品基基于于二二次次

23、谐谐波波发发生生（SHG）的的非非线线性性光光谱谱学学成成像像研究背景和研究背景和内容内容实验原理、流程实验原理、流程和装置和装置DNADNA样品的样品的SHGSHG成像成像结果结果讨论讨论总结和展望总结和展望 由此，反推基因组由此，反推基因组DNA和细胞核提取物中和细胞核提取物中SHG的产生，的产生，由于在提取这两种物质的过程中添加了乙醇，乙醇的加入由于在提取这两种物质的过程中添加了乙醇，乙醇的加入 也会影响也会影响DNA的构象，对二次谐波的产生和增强造成一定的构象，对二次谐波的产生和增强造成一定 的影响。的影响。肿肿瘤瘤细细胞胞DNA样样品品基基于于二二次次谐谐波波发发生生（SHG）的的非

24、非线线性性光光谱谱学学成成像像研究背景和研究背景和内容内容实验原理、流程实验原理、流程和装置和装置DNADNA样品的样品的SHGSHG成像成像结果结果讨论讨论总结和展望总结和展望总总 结：结：本论文围绕光学非线性成像技术在生物组织成像中的应用进行展本论文围绕光学非线性成像技术在生物组织成像中的应用进行展 开，讨论了基于开，讨论了基于DNA样品的二次谐波（样品的二次谐波（SHG）的非线性光学成像，）的非线性光学成像，探讨了乙醇对探讨了乙醇对DNA光学特性的影响。光学特性的影响。有助于进一步理解生物组织中有助于进一步理解生物组织中DNA二次谐波效应的产生机制及其二次谐波效应的产生机制及其 影响因素

25、，对进一步获取生物组织影响因素，对进一步获取生物组织DNA的细微结构信息，拓宽其在的细微结构信息，拓宽其在 生物医学领域的应用具有一定的指导意义和参考价值。生物医学领域的应用具有一定的指导意义和参考价值。肿肿瘤瘤细细胞胞DNA样样品品基基于于二二次次谐谐波波发发生生（SHG）的的非非线线性性光光谱谱学学成成像像研究背景和研究背景和内容内容实验原理、流程实验原理、流程和装置和装置DNADNA样品的样品的SHGSHG成像成像结果结果讨论讨论总结和展望总结和展望不足与展望：不足与展望：（1）乙醇对DNA二次谐波成像的影响只是做了定性的研究，未来还可 以考虑定量方面的研究。（2）还可以考虑其它的化学试

26、剂（如十二烷基硫酸钠：SDS，乙二 胺四乙酸二钠盐：EDTA等）对DNA非线性光学特性产生影响，并进行相关的研究。肿肿瘤瘤细细胞胞DNA样样品品基基于于二二次次谐谐波波发发生生（SHG）的的非非线线性性光光谱谱学学成成像像研究背景和研究背景和内容内容实验原理、流程实验原理、流程和装置和装置DNADNA样品的样品的SHGSHG成像成像结果结果讨论讨论总结和展望总结和展望致致 谢谢本论文是在导师金鹰老师的细心指导和帮助下完成的。在此，我向金鹰老师表示衷心的感谢，感谢他三年来在我的科研、学习和生活上的指导、关心与帮助！感谢邓小元老师的帮助与支持，感谢光子中医实验室的其他各位老师对我学习和研究上很多有

27、益的帮助和鼓励。感谢光子中医实验室的各位同学在我的实验相关工作中的关心与帮助。感谢国家自然科学基金项目/科学部主任基金项目（30940020）对本课题的资助和支持！感谢我的父母及家人在我三年硕士期间对我的长期支持与鼓励！最后，衷心地感谢各位答辩老师能够在百忙之中参与我的答辩！肿肿瘤瘤细细胞胞DNA样样品品基基于于二二次次谐谐波波发发生生（SHG）的的非非线线性性光光谱谱学学成成像像研究生期间发表的论文研究生期间发表的论文 1、罗冬梅、金鹰等，“肿瘤细胞DNA样品基于二次谐波发生（SHG）的非线性光谱学成像”光谱学与光谱分析，2012；2、罗冬梅，金鹰等，“人类基因组非冗余Exon/Intron 数据库的构建”华南师范大学学报，2010；3、罗冬梅，金鹰等，“肿瘤基因组研究进展”激光生物学报，2009。