分子克隆载体的选择.ppt

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1、第八节第八节分子克隆载体的选择分子克隆载体的选择1.选择克隆载体的几个重要参数选择克隆载体的几个重要参数1）实验对象）实验对象2）实验性质）实验性质3）载体容量）载体容量4）合适克隆位点）合适克隆位点5）载体的稳定性）载体的稳定性6）载体）载体DNA制备的难易制备的难易7）外源基因表达产物产量、产物特点等）外源基因表达产物产量、产物特点等2.实验对象实验对象1）供体供体：遗传背景与遗传背景与DNA特点等，其中包括染色体特点等，其中包括染色体DNA大小，大小，基因大小与结构，碱基组成，目的基因的产物特点以及遗传物质基因大小与结构，碱基组成，目的基因的产物特点以及遗传物质的传递方式等。的传递方式等

2、。2）受体受体：各种中间宿主与终宿主的遗传背景，如遗传物质的各种中间宿主与终宿主的遗传背景，如遗传物质的传递方式传递方式(包括人为的方法包括人为的方法)，DNA限制修饰系统，限制修饰系统，DNA重组基重组基因特点，基因产物修饰系统，即转录与翻译后修饰系统因特点，基因产物修饰系统，即转录与翻译后修饰系统。常用于基因工程的宿主菌常用于基因工程的宿主菌E.coli，菌株不同，基因型亦不同，不，菌株不同，基因型亦不同，不同载体要求不同菌株。如：同载体要求不同菌株。如：E.coli DH5:F,endA1,hsdR17(rk,mk+),supE44,thi,recA1,relA1,gyrA96 E.co

3、liDH5:F,endA1,hsdR17(rk,mk+),supE44,thi,recA1,relA1,gyrA96;80dlacZM15,(lacZYA-argF)U169 E.coliDH5F:F,endA1,hsdR17(rk,mk+),supE44,thi,recA1,relA1,gyrA96,80dlacZM15,(lacZYA-argF)U169i.三者均有限制三者均有限制-修饰系统和重组基因缺陷，外源修饰系统和重组基因缺陷，外源DNA可存活，可存活，且不发生重组且不发生重组ii.DH5和和DH5F都具有一个可供遗传标记都具有一个可供遗传标记lacZ检测的遗检测的遗传背景传背景ii

4、i.DH5F可供可供M13mp系列载体配套使用，系列载体配套使用，M13病毒的感染病毒的感染需要需要F的存在的存在3.实验性质实验性质分子克隆的一般程序包括以下几步：分子克隆的一般程序包括以下几步：i.分离供体分离供体DNA或或RNA（mRNA）和载体）和载体DNA.构建基因文库或构建基因文库或cDNA文库文库.目的基因或目的基因或cDNA克隆的筛选克隆的筛选.目的基因或目的基因或cDNA片段的鉴定：限制酶谱，次克隆，核片段的鉴定：限制酶谱，次克隆，核苷酸序列分析，基因结构分析等苷酸序列分析，基因结构分析等.基因表达与调控机理的研究基因表达与调控机理的研究1)建立文库用载体建立文库用载体常在常

5、在E.coli进行进行i.目的基因与供体基因大小目的基因与供体基因大小小小质粒载体，操作方便，鉴定简单质粒载体，操作方便，鉴定简单大大或或cos质粒载体质粒载体,甚至甚至P1或或pYAC载体载体(为减少文库规模，为减少文库规模，即使基因组小的也可用即使基因组小的也可用和和cos载体）载体）ii.筛选方法筛选方法)互补法：可表达互补法：可表达,选一般载体选一般载体;不表达，选表达载体不表达，选表达载体(外源基因外源基因必须表达，表达产物必须具备活性必须表达，表达产物必须具备活性)免疫法：与上同，但表达产物不一定具生物活性免疫法：与上同，但表达产物不一定具生物活性)杂交法：各种载体均可杂交法：各种

6、载体均可2)目的基因的鉴定目的基因的鉴定次克隆：选用质粒载体，限制酶谱分析，基因结构分析等次克隆：选用质粒载体，限制酶谱分析，基因结构分析等定序：定序载体（定序：定序载体（M13mp系列），其他质粒载体（如系列），其他质粒载体（如pUC系列，系列，pBR322，T3，T7，SP6启动子载体）启动子载体）3)基因表达与调控基因表达与调控 外源基因可表达外源基因可表达普通载体普通载体;不表达不表达表达型（分泌）载体表达型（分泌）载体4.载体容量载体容量M13mp载体载体4kb细菌质粒载体细菌质粒载体10kb载体载体23kbcos质粒载体质粒载体48kbP1载体载体95kbpYAC载体载体1000k

7、b5.合适的克隆位点合适的克隆位点 单克隆位点和多克隆位点单克隆位点和多克隆位点 第第九九节节分子克隆载体的组建分子克隆载体的组建构建克隆载体必须考虑的条件：构建克隆载体必须考虑的条件：复制起点复制起点，克隆位点克隆位点，标记基因标记基因，载体容量载体容量等。等。1.克隆位点的建立克隆位点的建立1)体外重组体外重组i.减少限制酶识别位点减少限制酶识别位点ii.增加限制酶识别位点：增加限制酶识别位点：人工接头，匹配接头人工接头，匹配接头2)体内重组或突变体内重组或突变i.减少限制酶识别位点减少限制酶识别位点体内自发突变和体外限制酶切富集。如在构建体内自发突变和体外限制酶切富集。如在构建pSUPV

8、系系列载体时，去除列载体时，去除Kanr基因中的基因中的HindIII位点就采用了以下技位点就采用了以下技术路线：术路线：培养有培养有pNG35的大肠杆菌细胞的大肠杆菌细胞提取质粒提取质粒DNA用用HindIII完全酶切完全酶切转化大肠杆菌转化大肠杆菌再提取质粒再提取质粒DNA再酶切，再酶切，再转化，直至提取单菌落质粒再转化，直至提取单菌落质粒DNA已无法用已无法用HindIII酶切为止酶切为止ii.增加限制酶识别位点增加限制酶识别位点M13mp系列载体构建中系列载体构建中EcoRI位点的建立位点的建立体外诱变体外诱变体内错配体内错配体外筛选体外筛选-肽链肽链ThrMetIleThrAspSe

9、rM13mp正链正链5ATGACCATGATTACGGATTCACT3CH3互补链负链互补链负链3TACTGGTACTAATGCTTAAGTGA5M13mp正链正链5ATGACCATGATTACGAATTCACT3-肽链肽链ThrMetIleThrAsnSer2.标记基因的建立标记基因的建立1）启动子）启动子2）编码区）编码区密码子偏爱性，基因产物适用范围密码子偏爱性，基因产物适用范围3）终止子）终止子3.载体容量载体容量 尽可能除去无关的尽可能除去无关的DNADNA序列。序列。第二章第二章练习题练习题1当一当一DNA片段插入终止子探针型载体片段插入终止子探针型载体pBU10的的Hind克隆位

10、克隆位点后，重组质粒仍可转化点后，重组质粒仍可转化E.coli(CmlsTcs)为为CmlrTcr，为什么，为什么?可设计什么实验证明其假设可设计什么实验证明其假设?2当一当一DNA片段插入片段插入pUC18后，在后，在x-gal平板上出现两类菌落，平板上出现两类菌落，兰色菌落和白色菌落。从白色菌落中分离纯化的质粒经电泳兰色菌落和白色菌落。从白色菌落中分离纯化的质粒经电泳检查，均比原载体检查，均比原载体DNA分子大；但从兰色菌落随机分离的质分子大；但从兰色菌落随机分离的质粒粒DNA却有两类，其中一类与载体大小相同，另一类却与白却有两类，其中一类与载体大小相同，另一类却与白色菌落中分离的质粒大小

11、相同。如何解释这一实验结果色菌落中分离的质粒大小相同。如何解释这一实验结果?可设可设计何种实验证明你的解释是正确的计何种实验证明你的解释是正确的?3当把一外源当把一外源DNA插入一克隆载体后，重组插入一克隆载体后，重组DNA分子转化分子转化E.coli细胞所获得的重组子分子可根据其限制酶图谱分为两类，细胞所获得的重组子分子可根据其限制酶图谱分为两类，即这两类转化子中所含的重组即这两类转化子中所含的重组DNA分子的限制酶图谱不一样，分子的限制酶图谱不一样，从这两类转化细胞中分离到的重组从这两类转化细胞中分离到的重组DNA分子可用限制酶回收分子可用限制酶回收插入的片段。而从这两类转化细胞培养液所分

12、离到的插入的片段。而从这两类转化细胞培养液所分离到的DNA却却不能用限制酶回收该片段。当把同类转化细胞培养液所分离到不能用限制酶回收该片段。当把同类转化细胞培养液所分离到的的DNA进行复性分析时，进行复性分析时，DNA分子间不会发生复性，但把从不分子间不会发生复性，但把从不同类转化细胞培养液分离到的同类转化细胞培养液分离到的DNA进行同样的实验时，发现在进行同样的实验时，发现在电镜下可观察到十分类似于电镜下可观察到十分类似于8字形的结构。如何解释上述实验结字形的结构。如何解释上述实验结果果?可利用图示法解释。可利用图示法解释。4.由由于于分分子子克克隆隆载载体体的的大大小小决决定定外外源源DN

13、A插插入入片片段段的的大大小小，两两者者呈呈反反比比关关系系，因因而而在在建建立立载载体体时时千千方方百百计计地地减减小小载载体体分分子子量量。对对于于穿穿梭梭载载体体，因因为为复复制制起起点点和和标标记记基基因因具具有有生生物物特特异异性性，所所以以载载体体上上需需要要同同时时具具有有两两个个以以上上的的复复制制起起点点和和标标记记基基因因。已已知知不不同同生生物物的的某某些些基基因因启启动动子子可可以以在在E.coli细细胞胞中中启启动动基基因因转转录录，问可以采取一些什么方法减小穿梭载体的分子量问可以采取一些什么方法减小穿梭载体的分子量?5.丝丝状状真真菌菌的的分分子子克克隆隆载载体体绝

14、绝大大多多数数都都是是整整合合型型的的。当当用用丝丝状状真真菌菌突突变变体体作作为为宿宿主主菌菌和和利利用用遗遗传传互互补补法法筛筛选选基基因因时时，常常常常会会遇遇到到无无法法回回收收到到阳阳性性克克隆隆中中的的基基因因片片段段的的问问题题。有有的的科科学学家家利利用用或或cos质质粒粒载载体体构构建建文文库库，然然后后利利用用重重组组分分子子转转化化宿宿主主菌菌，在在所所获获得得的的阳阳性性克克隆隆中中，可可用用一一简简单单的的方方法法获获得得所所需需基基因因，他他是是采采用何种方法获得该基因的用何种方法获得该基因的?6为了弄清为了弄清leu2基因的突变位点，一研究生将基因的突变位点，一研

15、究生将YIp(含含LEU2基因基因)质粒转入酿酒酵母质粒转入酿酒酵母(Leu-)，然后在无亮氨酸的合成培养基上分，然后在无亮氨酸的合成培养基上分离到离到Leu+转化子，经各种实验证明该质粒已整合到转化子，经各种实验证明该质粒已整合到leu2基因基因旁边，最后他用一种非常简单的方法就将旁边，最后他用一种非常简单的方法就将leu2基因分离出来了。基因分离出来了。他是用何种方法分离该基因的他是用何种方法分离该基因的?可用何种方法证明该基因是突可用何种方法证明该基因是突变基因变基因?画出整个设计图（已知酵母的画出整个设计图（已知酵母的LEU2基因可与具基因可与具leuB的的E.coli突变体发生遗传互

16、补）突变体发生遗传互补）7当当YIp整合到染色体整合到染色体DNA中后，偶尔还会发生再次重组，导致中后，偶尔还会发生再次重组，导致突变基因被野生型基因所取代，现已知有两个转化体分别属突变基因被野生型基因所取代，现已知有两个转化体分别属于上述两种情况，可用何种方法区别这两种不同的转化体于上述两种情况，可用何种方法区别这两种不同的转化体?8当当YRp质粒转移到酵母细胞后，有时也会发生整合现象，即质粒转移到酵母细胞后，有时也会发生整合现象，即这种自主复制是质粒可插入到染色体这种自主复制是质粒可插入到染色体DNA中，现有一个含中，现有一个含URA3的的YRp质粒，可用何种方法筛选到这种整合型的转化体质

17、粒，可用何种方法筛选到这种整合型的转化体?如何证明如何证明?9.有些用于转化的酵母菌株也可发生回复突变，当把有些用于转化的酵母菌株也可发生回复突变，当把YRp质质粒转入酵母细胞后，在选择性培养基上生长的大多数为转粒转入酵母细胞后，在选择性培养基上生长的大多数为转化体，极少数为回复突变体。现分离到一个菌落，怀疑它化体，极少数为回复突变体。现分离到一个菌落，怀疑它为回复突变体，可用什么方法证明此推断为回复突变体，可用什么方法证明此推断?为避免回复突为避免回复突变体的出现，应选择何种受体菌变体的出现，应选择何种受体菌?10.可用何种方法使酵母菌株中的天然质粒消除可用何种方法使酵母菌株中的天然质粒消除

18、?简要描述其简要描述其实验设计，并写明可用什么方法证明其质粒被彻底消除实验设计，并写明可用什么方法证明其质粒被彻底消除?11.现有一现有一BamHIDNA片段，片段，已知内含有如下限制酶识别位已知内含有如下限制酶识别位点：点：PstI,Hind,EcoRI,SalI,KpnI,它们都只有一个识别它们都只有一个识别位点。一研究者要绘制该片段的上述几种限制酶谱，他手位点。一研究者要绘制该片段的上述几种限制酶谱，他手中现有两种克隆载体。其中一种的上述各限制酶识别顺序中现有两种克隆载体。其中一种的上述各限制酶识别顺序均集中在一多克隆位点区，而另一载体则分散于整个均集中在一多克隆位点区，而另一载体则分散于整个DNA分子中，他应选择何种载体分子中，他应选择何种载体?为什么为什么?载载体体的的整整合合和和重重组组