《组培考试复习题》word版.doc

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1、l 广义的快速繁殖：可包括植物组织快速繁殖， 全光照育苗法， 根颈扦插法等 1、植物组织培养的一般概念定义：无菌条件下，在人工培养基上，离体培养植物的器官、组织、细胞以获得再生植株等的过程、方法。 组织培养具有如下优点：（1）快速 （2）周年生产 （3）不变异 （4）投资少，经济效益高 （根据培养材料的分）植株培养，器官培养（胚、子房、花药、根等），茎尖分生组织培养，愈伤组织培养，悬浮细胞培养，原生质体培养外植体：由活体植物上切取下来进行培养的组织或器官。技术水平：植株、胚胎、器官、组织、细胞、原生质体。愈伤组织（callus）：原指植物受伤后于伤口表面形成的一团薄壁细胞。在组培中指在人工培养

2、基上从外植体上长出来的一团无序生长的薄壁细胞。l 空白培养：主要用于无菌外值体的建立阶段，只含糖不加任何营养元素的培养。 l 初代培养：外植体的第一次培养。 l 继代培养：第二次以上的培养(由转入新的培养基上继续培养) 胚性细胞（EC）：保持着未分化状态和旺盛的分裂能力的一类细胞，这类细胞彼此相似、细胞核大、细胞质浓稠、细胞间无间隙，主要分布于胚及各种顶端分生组织中。位置效应：植物离体活组织，延续表现出来原生长部位的形态和特性的现象。因此，要根据培养目的选择适宜的外值体. 分化：细胞在形态、结构和功能上发生永久性的适度变化的过程。脱分化：成熟的细胞转变为分生状态，进而分裂形成无分化的细胞团，即

3、形成愈伤组织的过程。再分化：脱分化后的细胞再次分裂、分化并形成不同组织、进而构成器官和植株的过程。再分化过程的两种方式： （1）器官发生方式：（2）无性胚胎方式：组织培养的难易规律 l 生长点细胞 形成层细胞 薄壁细胞 厚壁细胞 纤维细胞 退化细胞 l 种子 花器 茎下部组织 茎中部组织 冠内部枝叶 冠外部枝叶 l 组培时间长的植物 组培时间短的植物 植物组织培养技术的应用l 1、优质种苗的快速无性繁殖：l （1）无性繁殖作物及不易繁殖作物的快速繁殖l （2）通过茎尖培养生产脱毒健康种苗：如草莓、香蕉、 甘蔗、马铃薯、大蒜等。l 2、用于植物遗传育种l 包括种质资源离体保存；l 花粉花药培养产

4、生单倍体；ll 3、大规模植物细胞、组织和器官培养生产次生代谢物质；l 4、用于植物生长发育理论研究，包括生理学、病理学、胚胎学和细胞与分子生物学等。3、技术特点： 培养条件可以人为控制； 生长周期短，繁殖率高； 管理方便，利于工厂化生产和自动控制第二章 实验室设备和一般技术组织培养实验室的面积大小和装备程度取决于两个因素：l 一是所要进行的实验的性质l 二是所能得到的经费的多少 l 一、实验室设计 l 洗涤室、准备室、灭菌室、缓冲室、无菌操作室、培养室、细胞学实验室、摄影室等分室，另加驯化室、温室或大棚。 l 当规模小、条件差的情况下，全部工序也可在一间室内完成。 （一）准备室l 准备室（又

5、称化学实验室），要求20m2左右，明 亮，通风。l 任务器皿洗涤，培养基配制、分装、 高压灭菌，材料预处理，重蒸馏水的制备等。（二）缓冲室 为避免进出时带进杂菌，无菌室外应设置缓冲室，面积约3m2-5m2。进入无菌室前需在缓冲室里换上经过灭菌的卫生服、拖鞋，戴上口罩。最好安装1盏紫外灯，用以灭菌。幻灯片9（三）无菌操作室 简称无菌室或接种室，10m2-20m2，具体视生产规模和超净工作台数量而定。是组培室最关键的部分。门窗要密闭，一般用移动门窗，以减少空气的扰动。（四）培养室 培养室是将接种到培养瓶等器皿中的植物材料进行培养的场所。其面积根据培养规模和经济条件来确定。为了满足外植体的生长和发育

6、，培养室要具备适宜的温度、湿度、光照、通风等条件。l 培养器皿-指用于盛放培养基和接种培养材料的器皿。要求透光度好，能耐高压灭菌。 （2）类型l 按材料分： l 玻璃培养器皿：优点是透光度好、容易清洗；缺点是容易破碎； l 塑料培养器皿：优点是不容易破碎、成本较低，但缺点是透光度较玻璃的差、遇火焰易被熔化。2洗涤方法 使用前先用1%稀盐酸浸泡1 夜，然后用肥皂水洗净，清水冲洗，最后用蒸馏水冲淋1遍，干后备用。 已用过的玻璃器皿洗涤方法：去残渣水洗热肥皂水（或洗洁精）水洗蒸馏水冲洗1次。 较脏的玻璃器皿的洗涤：洗衣粉或洗洁精刷洗几次并冲净浸入洗涤液中流水中冲洗蒸馏水冲洗。 第三节 培养条件 在植

7、物组织培养中温度、光照、湿度等各种环境条件，培养基组成、pH值、渗透压等各种化学环境条件都会影响组织培养育苗的生长和发育。 幻灯片513.1温度 l 大多数植物组织培养 都是在2327、之间进行，一般采用25土2。 3.2光照 3.2.1光照强度 光照强度对培养细胞的增殖和器官的分化有重要影响，从目前的研究情况看，光照强度对外植体、细胞的最初分裂有明显的影响。一般来说，光照强度较强，幼苗生长的粗壮，而光照强度较弱幼苗容易徒长。 .2.3光周期 l 试管苗培养时要选用一定的光周期来进行组织培养，最常用的周期是16h的光照，8h的黑暗。3.3湿度 包括:培养容器湿度 环境的湿度条件 湿度过低：会使

8、培养基丧失大量水分，导致培养基各种成分浓度的改变和渗透压的升高，进而影响组织培养的正常进行。 湿度过高时：易引起棉塞长霉，造成污染。 3.4 渗透压 l 培养基中由于有添加的盐类、蔗糖等化合物，因此，而影响到渗透压的变化。l 通常12个大气压对植物生长有促进作用，3.5 pH值 l 大多在56.5左右，一般培养基皆要求5.8，这基本能适应大多植物培养的需要。pH值调整 可用0.1M的NaOH和0.1M的HCI来调整。lml的NaOH可使pH值升高0.2单位，lml的HCI可使pH值降低0.2单位。调节时一定要充分搅拌均匀。3.6气体 氧气是组织培养中必需的因素，瓶盖封闭时要考虑通气问题，可用附

9、有滤气膜的封口材料。通气最好的是棉塞封闭瓶口，但棉塞易使培养基干燥，夏季易引起污染。 改善气体的方法l 固体培养基可加进活性炭来增加通气度，以利于发根。培养室要经常换气，改善室内的通气状况。 l 液体振荡培养时，要考虑振荡的次数、振幅等，同时要考虑容器的类型、培养基等。第三章 培养基及其配制培养基(culture medium)的配制 培养基 外植体分化途径 不同种植物的组织对营养有不同的要求 同一种植物不同部位的组织对营养的要求也不相同。 第一节 培养基的种类 一、根据其态相不同分为 固体培养基：是指加凝固剂（如琼脂）的培养基。 液体培养基：是指不加凝固剂的培养基。 二、根据培养物的培养过程

10、分为 初代培养基：是指用来第一次接种从植物体上分离 下来的外植体的培养基。 继代培养基：是指用来接种继初代培养之后的培养 物的培养基。 三、根据其作用不同分为诱导培养基增殖培养基生根培养基 四、根据其营养水平不同分为基本培养基：主要有MS、White、B5、N6、改良MS、 Heller、Nitsh、Miller、SH等 完全培养基：就是在基本培养基的基础上，根据试验的 不同需要，附加一些物质，如植物生长调节物质和其它复杂有机附加物等。l 第二节 培养基的成分 水无机营养维生素类氨基酸有机附加物激素糖类琼脂等。 第二节 培养基的成分 一、无机营养（即无机盐类） (一)大量元素 （二）微量元素其

11、它微量元素l B、Mn、Zn、Cu、Mo、Co等，也是植物组织培养中不可缺少的元素，缺少这些物质会导致生长，发育异常现象。 幻灯片19二、氨基酸氨基酸是蛋白质的组成成分，也是一种有机氮化合物。常用的有甘氨酸、谷氨酸、精氨酸、丝氨酸、丙氨酸、半胱氨酸以及酰胺类物质（如天门冬酰胺）和多种氨基酸的混合物（如水解酪蛋白、水解乳蛋白）等。 注意：氨基酸类物质只有在含有无机氮的情况下，对离体组织生长才有较好的效果。幻灯片20三、有机附加物l 有机附加物:l 包括：如椰乳、香蕉汁、番茄汁、酵母提取液、麦芽糖等。 四、维生素类 维生素类:它能明显地促进离体组织的生长。培养基中的维生素主要是B族维生素，如硫胺素

12、（ VB1）、吡哆醇（VB6）、烟酸（VB3 ，又称VPP）和泛酸钙（VB5）、生物素维生素类l 一般用量为0.11.0mgL,有时用量较高。VBl对愈伤组织的产生和生活力有重要作用，VB6能促进根的生长，Vpp与植物代谢和胚的发育有一定关系,Vc有防止组织变褐的作用。 五、糖类 1.作用：一是作为离体组织赖以生长的碳源二是使培养基维持一定的渗透压（一般在1.5-4.1MPa）。2.种类：蔗糖（多用），其浓度为1%-5%,也可用砂糖、葡萄糖或果糖等。不同糖类对生长的影响不同l 从各种糖对水稻根培养的影响来看：l 以葡萄糖效果最好。l 果糖和蔗糖相当。l 麦芽糖差一些。l 六、琼脂在固体培养时，

13、琼脂是使用最方便、最好的凝固剂 和支持物，一般用量为即6-10g/L。琼脂粉比条状的使 用更方便。冷后（400C以下）即凝固为固体状成凝胶。幻灯片31七、植物生长调节物质 （一）生长素（二）细胞分裂素 生长素：是指能引起完整组织中的细胞扩展的化合物。包括：内源的（存在于植物体内的） 人工合成的作用：促进细胞脱分化，诱导愈伤组织的产生； 促进细胞的伸长生长； 诱导受伤的组织表面形成愈伤组织； 促进生根。（一）生长素常用的生长素有：吲哚乙酸（IAA）吲哚丁酸（IBA） 萘乙酸（NAA）2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)等。（二）细胞分裂素l 这类激素是腺嘌呤的衍生物包括:l 6-BA(6-苄基氨基

14、嘌呤)l Kt(kinetin激动素)l Zt(zeatin玉米素)等。l 其中Zt活性最强，但非常昂贵，常用的是6-BA。 细胞分裂素有三个作用：诱导芽的分化促进侧芽萌发生长;细胞分裂素与生长素相互作用，当组织内细胞分裂素生长素的比值高时，诱导愈伤组织或器官分化出不定芽。促进细胞分裂与扩大。抑制根的分化。 因此，细胞分裂素多用于诱导不定芽的分化、茎、苗的增殖，而避免在生根培养时使用。 八、活性炭作用（1）减少一些有害物质的影响.例如防止酚类物质污染而引起组织褐化死亡。这在兰花组织培养中效果更明显。（2）活性炭使培养基变黑，有利于某些植物生根。 l 注意：但活性炭对物质吸附无选择性，既吸附有害

15、物质，也吸附有利物质，因此使用时应慎重考虑。九、pH值： 在灭菌之前培养基的pH值一般都是调节到 5.0-6.0。一般来说，当pH值高于6.0时培 养基将会变硬；低于5.0时，琼脂不能很好 地凝固。pH值对不同植物的影响会有差 异，如玉米胚乳愈伤组织在pH值7.0时鲜重 增加最快，在pH值6.1时干重增长最快。第四章 外植体第一节 外植体的选择 一、外植体的种类：选取性状优良的种质， 或特殊的基因型。对材料的选择要具有一定的代表性，提高成功机率，增加其实用价值。 基因型：草本木本双子叶植物单子叶植物二、外植体的来源1、生长健壮：在生长健壮的无病虫的植株上，选取发育正常的器官或组织。原因：代谢旺

16、盛，再生能力强（比较容易培养成功） 在幼树上采集外植体，以健壮的钉梢枝或侧枝为宜 2、不同部位 ：对于从成年大树上取外植体，不能去外围的枝叶,要取内堂枝. 三、取材季节：组织培养选择材料时要注意:植物的生长季节（生长最适季节），植物的生长发育阶段。l 如快速繁殖时应在植株生长的最适时期取材，这样不仅成活率高，而且生长速度快，增殖率高；l 花药培养应在花粉发育到单核期时取材，这时比较容易形成愈伤组织。三、取材季节冬季取来的枝条，清洗后放在温暖潮湿的环境下催芽，如果有培养箱，效果更好 四、选取适宜的大小 建立无菌材料时，取材的大小根据不同植物材料而异。l 材料太大:易污染，也不需要；l 材料太小:

17、多形成愈伤组织，甚至难于成活。l 一般选取培养材料的大小，在0.5cm-1.0cm。如果是胚胎培养或脱毒培养的材料，则应更小。幻灯片13 四、选取适宜的大小 外植体取来后，需要根据品种、特性进行修剪，取一定大小的芽体、茎段进行灭菌。l 四、选取适宜的大小 取大小适中的茎段、芽体进行清洗、灭菌，大了容易污染，小了不易成活 五、外植体的生理状态和发育年龄 沿植物主轴越向上的部分所形成的器官其生长的时间越短，生理年龄越老，越接近发育上的成熟，越易形成花器官，反之相反。幻灯片18二、外植体的灭菌方法 植物材料一般采取的预处理方法是，先对植物组织进行修整，去掉不需要的部分，将准备使用的植物材料在流水中冲

18、洗干净。经过预处理的植物材料，其表面仍有很多细菌和真菌，因此还需进一步灭菌。 常规的表面灭菌处理方法把材料放进70%的酒精中约30s。 用0.1%的升汞（HgCl2）中浸泡10min。 或用10%的漂白粉上清液中浸10min 15min。 无菌蒸馏水冲洗35次。 灭菌时进行搅动，使植物材料与灭菌剂有良好 的接触。 在灭菌剂里滴入数滴0.1%的Tween20（吐温） 或Tween80湿润剂，则灭菌效果更好。 幻灯片22第三节污染原因和预防措施一、污染的原因 污染：是指在组织培养过程中培养基和培养材料滋生杂菌，导致培养失败的现象。 污染的原因：从病源菌方面来分析主要有：细菌真菌从污染的途径而言主要

19、是：外植体带菌培养基及器皿灭菌不彻底、操作人员未遵守操作规程等。幻灯片24细菌污染的特点：菌斑呈粘液状物，而且在接种后1-2天即可发现。 原因：材料带菌 培养基灭菌不彻底 操作人员未遵守操作规程 因此接种人员的手应经常用70%洒精擦净，镊子和接种针在使用前必须在火焰上烧红。幻灯片25真菌污染的特点：污染部分长有不同颜色的霉菌，在接种后3-10天才能发现。原因：周围环境不清洁 超净工作台的过滤装置失效 培养用器皿的口径过大等 为了减少损失，提高工作效率，必须在每个操作环节注意防止污染的发生。 幻灯片262外植体的灭菌（1）多次灭菌法：如咖啡成熟叶片的灭菌即用这种方法。首先：除去主脉（因主脉与支脉

20、交界处常有真菌休眠孢子存在），同时去掉叶的顶端、基部和边缘部分，这样可大大减少污染；其次：将切好的外植体放入1.3%的次氯酸盐溶液中（商品漂白粉25%的溶液），灭菌30min；幻灯片312外植体的灭菌第三：在无菌蒸馏水中冲洗3次；第四：将材料封闭在无菌的培养皿中过夜，保持一定温度；第五：次日将叶片用2.6%次氯酸钠灭菌30min，然后，用蒸馏水洗3次。 对层积过的种子也可用多次灭菌法，在种子吸胀前后都要灭菌，在层积贮藏的第一周还应增加1次灭菌处理。幻灯片32第一节 外植体的选择 ：优良种质、健壮植株 、最适的时期、适宜的大小。 第二节 外植体的消毒：9种常用灭菌药剂的使用及其效果 、外植体的灭

21、菌方法。 第三节 污染原因和预防措施：污染的原因、污染的预防措施（防止材料带菌、外植体的灭菌、器皿与金属器械的灭菌、布质制品的灭菌、无菌操作室的灭菌、操作人员在接种时一定要严格按照无菌操作的程序进行）。 幻灯片42第四节 外植体的接种外植体的接种：是把经过表面消毒后的植物 材料切碎或分离出器官、组织、细胞，并将它 们转放到无菌培养基上的全部操作过程。整个接种过程均须无菌操作。幻灯片43第五节 外植体的褐变及其预防措施一、褐变概念 二、褐变的原因三、影响褐变的因素四、褐变的预防措施 幻灯片52一、褐变概念 褐变是指外植体在培养过程，自身组织从表面向培养基释放出褐色物质，以致培养基逐渐变成褐色，外

22、植体也随之进一步变褐而死亡的现象。幻灯片53二、褐变的原因离体植物一旦离体很容易褐变原因是： 氧化 蛋白质氨基酸胶链酚醌(褐色物质) 衰老死亡。 （植物体的一种防卫作用，有杀伤病菌作用，同时也限制细胞的分裂与生长）醌类又会在酪氨酸酶等的作用下，与外植体组织中的蛋白质发生聚合，进一步引起其他酶系统失活，从而导致组织代谢紊乱，生长停滞不，最终衰老死亡。 幻灯片54三、影响褐变的因素1植物材料 2培养条件3培养基4转瓶周期1植物材料随着植物种类、基因型、外植体的部位及生理状况等的不同，褐变的程度也有所不同。 （1）基因型（2）材料年龄（3）取材部位（4）取材时期（5）外植体大小及受伤害程度（1）基因

23、型不同种植物同种植物不同类型不同品种在组织培养中褐变发生的频率、严重程度都存在很大差别。木本植物一般比草本植物容易发生褐变。原因： 木本植物（木质素）、单宁含量或色素含量高的植物容易发生褐变。这是因为酚类的糖苷化合物是木质素、单宁和色素的合成前体，酚类化合物含量高，木质素、单宁或色素形成就多，（2）材料年龄l 幼龄材料一般都有比成龄材料褐变轻的趋势。l 平吉成从小金海棠、八楞海棠和山定子刚长成的实生苗上切取茎尖进行培养，接种后褐变很轻，随着苗龄增长，褐变逐渐加重，取自成龄树上的茎尖褐变就更严重。l 幼龄材料褐变较轻与其酚类化合物含量少有关。（3）取材部位l 部位：顶芽、侧芽l （ Yu和Mer

24、edith在葡萄上从侧生蔓切取茎尖进行培养，比从延长蔓切取的茎尖更容易成活。l 而苹果则顶芽作外植体褐变程度轻，比侧芽容易成活。l 石竹和菊花也是顶端茎尖比侧芽茎尖更容易成活。分生部位接种后醌类物质形成少；l 分化部位接种后醌类物质形成多。（4）取材时期l 取材时期多酚氧化酶活性和酚类含量基本是对应的。l 春季较弱，随着生长季节的到来，酶活性逐渐增强，因而有人认为取材时期比取材部位更加重要。l Chever报道，欧洲栗在1月15日-30日醌类物质形成少，而在5月-6月醌类物质明显提高。 （5）外植体大小及受伤害程度l 金冠苹果茎尖小于0.5mm时褐变严重l 当茎尖长度在5mm-15mm时褐变较

25、轻,成活率可达85%。在苹果品种上试验结果表明，用5mm-10mm长的茎尖进行培养效果最好l 茎尖如果太小很容易发生褐变。l 取外植体时还要考虑其粗度，细的可切短些，粗的可切得长些。l 外植体切口：太大易褐变，尽量小2培养条件光照、温度温度过高光照过强均可使多酚氧化酶的活性提高，从而加速外植体的褐变。3培养基l （1）培养基状态l （2）无机盐l （3）植物生长调节物质l （4）抗氧化剂l （5）吸附剂l （6）pH值（1）培养基状态l 固体培养基、半固体培养基、液体培养基。l 液体培养基：可经有效克服外植体褐变，液体培养基再加上滤纸桥，效果就更好。在液体培养基中，外植体溢出的有毒物质可以很快

26、扩散，因而对外植体造成的伤害较轻。（2）无机盐培养基中无机盐浓度过高，酚类物质将会大量外溢，导致外植体褐变。 无机盐中的有些离子，如Mn2+、Cu2+是参与酚类合成与氧化酶类的组成成分或辅因子（3）植物生长调节物质l 细胞分裂素6-BA或KT不仅能促进酚类化合物的合成，而且还能刺激多酚氧化酶的活性，这一现象在甘蔗的组织培养中十分明显。l 而生长素类如2，4-D和IAA可延缓酚类化合物的合成，减轻褐变现象发生。 （4）抗氧化剂l 培养基中加入抗氧化剂可改变外植体周围氧化还原电势，从而抑制酚类氧化。l 减轻褐变。 幻灯片67（5）吸附剂l 活性炭和聚乙烯吡咯烷酮（PVP）作为吸附剂可以去除酚类氧化

27、造成的毒害效应。l 这在东北红豆杉、猪笼草、鸡蛋果、鹤望兰、杜鹃花、苹果、桃和倒挂金钟等植物上都有过报道。l 在倒挂金钟茎尖培养中只加入0.01%PVP便对褐变有抑制作用。 幻灯片68（6）pH值l pH值较低时：l 可降低多酚氧化酶活性和底物利用率，从而抑制褐变。l pH值升高则明显加重褐变。幻灯片694材料转瓶周期l 接种后转瓶时间长：对于易褐变的材料，伤口周围积累醌类物质增多，褐变加重，以致全部死亡。l 而缩短转瓶周期：可减轻褐变。l 在山月桂树的茎尖培养中，接种后12h24h，便转入液体培养基中，这之后的一周内，每天转一次瓶，褐变得到完全控制。l 在无刺黑莓上也有类似经验 。幻灯片70

28、四、褐变的预防措施l 1选择适宜的外植体：l 外植体应选择分生能力较强的材料。l 如采用实生苗茎尖、枝条顶芽、幼胚等材料培养褐变程度比较轻。 幻灯片71四、褐变的预防措施l 2采用适宜的培养基和光温条件：l 培养基的无机盐成分、蔗糖浓度、激素水平、温度适宜及在黑暗条件下培养l 或在取外植体之前对母株进行遮光处理20d40d，可以显著减轻材料的褐变。 幻灯片72四、褐变的预防措施l 3在培养基中加活性炭、抗氧化剂和其他抑制剂可预防褐变：l 在培养基中加入0.1%0.5%的活性炭对吸附酚类氧化物的效果很明显。l 如在培养基中加抗坏血酸、血清白蛋白、有机酸、蛋白质、蛋白质水解产物、氨基酸、硫脲、二氨

29、基二硫代甲酸钠、亚硫酸氢钠、氰化钾、苏糖二硫醇等抗氧化剂和其他抑制剂l 或用它们进行材料的预处理或预培养，可有效地预防醌类物质的形成。 l 4缩短转瓶周期 这是组培中控制褐变常用且有效的方法。第五节 外植体的培养条件1光照 通常对愈伤组织的诱导，在黑暗条件下有利，在有光条件下培养的愈伤组织质地和颜色也有不同。 分化器官需要光照，并随着芽苗的生长需要加强光照。 普通培养室要求每日光照12h-16h，光照强度1000lx- 5000lx。2温度 不同的植物有不同的最适生长温度。 大多数植物最适温度在23C-32C之间。培养室一般所用的温度是25C2C。低于15C或高于35C，对生长都是不利的。幻灯

30、片773湿度l 组织培养中的湿度影响主要有两个方面：l 一是培养容器内的湿度：它的湿度条件常可保证100%。l 二是培养室的湿度：它的湿度变化随季节和天气而有很大变动。l 湿度过低：会造成培养基失水而干枯，或渗透压升高，影响培养物的生长和分化。l 湿度过高：会造成杂菌滋长，导致大量污染。因此，要求室内保持70%-80%的相对湿度。幻灯片784氧气植物组织培养中，外植体的呼吸需要氧气。在液体培养中，振荡培养是解决通气的良好办法。 愈伤组织 自然生长的植物受损伤时，在愈合伤口处长出的一团瘤状突起，瘤状突起内的细胞相对于植物体成熟细胞已发生脱分化的变化。 培养中的愈伤组织是指从外植体的内部或切口表面

31、形成的一团没有分化的组织，这种组织具有再分化的能力。 愈伤组织培养 愈伤组织培养 愈伤组织培养将母体植株上的各个部分切下作为外值体，接种到无菌的培养基上，进行愈伤组织诱导、生长和发育的一门技术。 一般情况下，植物组织均能诱发形成愈伤组织。 第一节 愈伤组织的诱导与分化一、愈伤组织的诱导 植物由细胞构成，细胞是生物结构和生命活动的基本单位，具有全能性，即一个植物细胞能产生一个完整植株的固有能力，或植物细胞具有全套遗传信息，不论是性细胞还是体细胞，在特定环境下能进行表达，而产生一个独立完整的个体。 幻灯片7 全能性的体现 一个已分化的细胞若要表现其全能性，首先要经历脱分化过程，然后再经历再分化过程

32、。 脱分化：一个已停止分裂的成熟细胞转变为分生状态，并形成未分化的愈伤组织的现象。 不同外植体的比较： 一般双子叶植物比单子叶和裸子植物诱导愈伤组织容易； 幼年细胞和组织比成年细胞和组织容易； 二倍体细胞比单倍体细胞容易。 愈伤组织诱导条件：1、离体：摆脱了原来所受到的遗传上的控制和生理上的制约。在一定的培养条件下就会发生一种回复变化，从而失去分化状态变为分生细胞。 2、培养条件：激素的种类和浓度， 2，4D、NAA、IAA和细胞分裂素等。3、组织的机械损伤：也作为一种刺激因素诱导细胞开始分裂，愈伤组织往往出现在伤口处。4、有些天然提取物对愈伤组织的诱导和维持十分有益：常用的有椰子汁（10），

33、0.5的酵母提取物，510的番茄汁。二、愈伤组织细胞的分化再分化 ：愈伤组织在一定的培养条件下：一、可以经过胚胎发生形成双极性的胚状体，二、经过器官发生形成单极性的芽或根，进而重新形成完整的植株，这后一段过程一般称为再分化。二、愈伤组织细胞的分化 从单个细胞或外植体上形成典型的愈伤组织，大致要经历三个时期： （一）诱导期 （二）分裂期 （三）分化期 二、愈伤组织细胞的分化 优良的愈组织通常具备以下4个特性中的2-3个特性：1、高度的胚性或再分化能力。2、容易散碎，建立优良的悬浮系，并能分离出全能性原生质体。3、旺盛的自我增殖能力。4、经过长期继代保存而不丧失胚性，以便有可能对它们进行各种遗传操

34、作。 二、愈伤组织细胞的分化 质地不同的两种愈伤组织有时是可互变的，有时是不可逆的。脆性愈伤组织由松散排列的细胞组成；而坚实愈伤组织则由紧密排列的细胞组成。 加入高浓度的生长物质，可使坚实的愈伤组织变为松脆； 减低或除去生长物质，则松脆愈伤组织可转变为坚实。 二、愈伤组织细胞的分化 影响愈伤组织培养的主要因素：1、选择适当的基因型和适当的外植体2、选择正确的培养基，特别是正确的植物激素的种类和浓度。3、采用某些特殊的理化因素改变愈伤组织诱导培养基和培养条件 第三节 愈伤组织的形态发生 从外植体形成器官或细胞无性系的形态发生，有以下两种情况： 不定芽和不定根的发生 体细胞胚的发生一、不定芽和不定

35、根的发生 在植物组织培养中，当外植体形成愈伤组织后，可以利用植物生长物质比例控制器官发生的模式，通过调整某些植物生长物质的比例促使芽和根的分化。 生长素：有利于愈伤组织形成根， 细胞分裂素：可促进愈伤组织形成芽。一、不定芽和不定根的发生愈伤组织的器官发生顺序有四种情况：（1）无芽的根或无根的芽：愈伤组织仅有芽或根器官的分别形成。（2）先芽后根：先形成芽，再在芽伸长后，在其茎的基部长出根而形成小植株，大多植物为这种情况； (3）先根后芽：先产生根，再从根的基部分化出芽形成小植株。（4）在不同部位分别形成芽和根：然后两者结合起来形成一株小植株，类似根芽的天然嫁接，但这种情况少见，而且一定在芽与根的

36、维管束是相通的情况下，才能得到成活植株。二、体细胞胚胎的形成 高等植物的体细胞在一定条件下所诱导形成的胚，称为体细胞胚，即所谓的胚状体。 植物的体细胞具有形成胚的潜力。在植物组织培养中，培养细胞经诱导分化出具有胚芽、胚根、胚轴的胚状结构，进而长成完整植株。 细胞经分化后，发生持续细胞分裂增殖，并顺次经过原胚期、球形胚期、心形胚期、鱼雷形胚和子叶期，进而成为成熟的有机体。 由胚状体形成完整植株，与不定芽和根发生相比，有以下三个特征： 第一、具有两极性，即在发育的早期阶段，从其方向相反的两端分化芽端与根端，而不定芽或不定根都为单向极性; 第二、胚状体的维管组织与外植体的维管织组织无解剖结构上的联系

37、，而不定芽或不定根往往总是与愈伤组织的维管组织相联系； 第三、胚状体的维管组织的分布是独立的“Y形，而不定芽的维管组织无此现象。 第四节 愈伤组织培养的应用 （1）加快了园艺植物新品种和良种繁育速度，特别是对于无性繁殖的果树、观赏树木等植物； （2）培养无病毒苗木，这在香蕉、马铃薯、柑橘、草莓等植物上均得到了成功应用； （3）获得倍性不同的植株，这对于无性繁殖园艺植物的育种，具有较大的利用价值因为愈伤组织形成过程中易发生染色体的核内加倍； （4）克服远缘杂交困难；幻灯片50 （5）利于种质资源长期保存和远距离运输，应用组织培养保存种质资源具有节约土地，节省人力、物力，手续简便，易于长远距离运输，而且不致受病虫害的侵袭，并便于交流的优点；