微生物学实验技术-乳酸菌的分离与纯化.ppt

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1、 一、目的要求：一、目的要求：学习微生物菌种分离技术学习微生物菌种分离技术学学习习从从新新鲜鲜酸酸乳乳中中分分离离纯纯化化乳乳酸酸菌菌的方法的方法学习乳酸的检测方法学习乳酸的检测方法酸乳中乳酸菌的分离纯化酸乳中乳酸菌的分离纯化二、基本原理：二、基本原理：选择适合于待分离微生物的生长条件，造成只利于选择适合于待分离微生物的生长条件，造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物；加入某种指示剂，使待分离微汰一些不需要的微生物；加入某种指示剂，使待分离微生物在培养基中形成具有明显特征的菌落。生物在培养基中形成具有明显特

2、征的菌落。微生物在固体培养基上生长形成单个菌落，挑取菌微生物在固体培养基上生长形成单个菌落，挑取菌落平板划线获得纯培养。落平板划线获得纯培养。通过吲哚试验和糖发酵试验以及小型发酵实验证明通过吲哚试验和糖发酵试验以及小型发酵实验证明该菌种为乳酸菌，杆状的叫做短乳杆菌，链球状的叫做该菌种为乳酸菌，杆状的叫做短乳杆菌，链球状的叫做乳链球菌。乳链球菌。三、实验器材：三、实验器材：菌种来源：菌种来源：市场销售的各种新鲜酸乳市场销售的各种新鲜酸乳培养基：培养基：BGC 牛乳培养基牛乳培养基乳酸菌培养基乳酸菌培养基蛋白胨水培养基蛋白胨水培养基糖发酵培养基糖发酵培养基BGC 牛乳培养基牛乳培养基（A）溶液：）

3、溶液：脱脂乳粉脱脂乳粉 100g，水，水500mL，加入加入1.6%溴甲酚绿溴甲酚绿()()乙醇溶液乙醇溶液1mL,80灭菌灭菌20min。（B）溶液：）溶液：酵母膏酵母膏10g，水，水500mLmL，琼脂，琼脂20g，,121灭菌灭菌20min。以无菌操作趁热将（以无菌操作趁热将（A）、（）、（B）溶液混合均匀）溶液混合均匀后倒平板。后倒平板。乳酸菌培养基乳酸菌培养基n牛肉膏5g，酵母膏5g，蛋白胨10g，葡萄糖10g，乳糖5g，氯化钠5g，水1000mL，pH：；1.6%溴甲酚绿溴甲酚绿蛋白胨水培养基蛋白胨水培养基n蛋白胨10g，氯化钠5g，水1000mL，pH：糖发酵培养基糖发酵培养基n

4、蛋白胨水培养基1000mL，1.6%溴甲酚紫乙醇溶液12mL，pH：，另配20%糖溶液（葡萄糖，蔗糖）各10mL。n制法：n1）将上述含指示剂的蛋白胨水培养基（pH：）分装于试管中，在每管内放一倒置的小玻璃管。n2）将已分装好的蛋白胨水培养基和20%的各种糖溶液分别灭菌，蛋白胨水培养基121灭菌20min，糖溶液112灭菌30min。n3)灭菌后，每管以无菌操作分别加入20%的糖溶液，则成1%的浓度。有关溶液：n1.6%溴甲酚紫乙醇溶液：溴甲酚紫溶于100mL乙醇中，贮存于棕色瓶中保存备用。n吲哚试剂：对二甲基氨基苯甲醛8g，95%乙醇760mL，浓盐酸160mL。n10%硫酸n2%高锰酸钾n

5、含氨的硝酸盐溶液：n称取硝酸银2g，蒸馏水100mL，待硝酸银溶解后，取出10mL备用，向其余的90mL硝酸银中滴加氨水，即可形成很厚的沉淀，继续滴加氨水至沉淀刚刚溶解成为澄清溶液为止，再将备用的硝酸银慢慢滴入，则溶液出现薄雾，但轻轻摇动后，薄雾状的沉淀又消失，继续滴入硝酸银，直到摇动后仍呈现轻微而稳定的薄雾状沉淀为止。四、操作步骤：四、操作步骤：（一）乳酸菌的分离纯化（一）乳酸菌的分离纯化 1.1.稀释分离稀释分离 培养基的配制培养基的配制 灭菌灭菌 倒平板倒平板 制备样品稀释液制备样品稀释液 接种（涂布法）接种（涂布法）培养培养每组准备下列器材每组准备下列器材（灭菌灭菌）1.培养基培养基

6、A 溶液（溶液（250ml三角瓶，内装三角瓶，内装125ml）2.培养基培养基 B 溶液（溶液（250ml三角瓶，内装三角瓶，内装125ml）3.试管试管7支（内装支（内装9ml水水）4.培养皿一包（培养皿一包（9个）个）刻度吸管刻度吸管7支支 1mL1mL琼脂培养基琼脂培养基每管各每管各9mL9mL无菌水无菌水 取市售新鲜酸乳稀释至取市售新鲜酸乳稀释至10-6，取其中的，取其中的10-4、10-5、10-6 3个稀释度的稀释液各，分别接入个稀释度的稀释液各，分别接入BGC 牛乳培养基琼脂平板上，用无菌玻璃刮刀牛乳培养基琼脂平板上，用无菌玻璃刮刀依次涂布，置依次涂布，置40培养培养48h，如出

7、现圆形稍扁平，如出现圆形稍扁平的黄色菌落及其周围培养基变黄者初步定为乳酸的黄色菌落及其周围培养基变黄者初步定为乳酸菌。菌。n2.2.划线分离划线分离n挑取单菌落平板划线，置40培养48h。挑选出乳酸菌进行连续6次以上的传代，以达到提纯。（二）鉴别n1吲哚试验n1）试管标记：取装有蛋白胨水培养基的试管n+1支，分别标记乳酸菌和空白对照。n2）接种培养：以无菌操作分别接种少量菌苔到标记乳酸菌的试管中，标记有空白对照的不接种，置37恒温箱中培养2448h。n3）观察记录：在培养基中加入乙醚12mL，经充分振荡，使吲哚萃取至乙醚中，静置片刻后乙醚层浮于培养液的上面，此时沿管壁缓慢加入510滴吲哚试剂，

8、如有吲哚存在，乙醚层呈玫瑰色，此为吲哚试验阳性反应，否则为阴性反应。n2.糖发酵试验n1）试管标记：取分别装有葡萄糖，蔗糖发酵培养液试管各n+1支，每种糖发酵试管中分别标记乳酸菌和空白对照。n2）接种培养：以无菌操作分别接种少量菌苔至以上各相应试管中，每种糖发酵培养液的空白对照均不接菌。将装有培养液的杜氏小管倒置试管中，置37恒温培养箱中培养24h，观察结果。n3）观察记录：与对照管比较，若接种培养液保持原由颜色，其反映结果为阴性；如果培养液呈黄色，反映结果为阳性。培养液中的杜氏小管内有气泡为阳性反应，杜氏小管内没有气泡为阴性反应。n3.乳酸的检测n选用已经分离的菌种做小型发酵实验，取发酵液的

9、上清液约10mL于试管中，加入10%硫酸1mL，再加2%高锰酸钾1mL，此时乳酸转化为乙醛，把事先在含氨的硝酸银溶液中侵泡的滤纸条搭在试管口中，微火加热试管至沸，观察滤纸变化。五、结果分析n1.乳酸菌的分离提纯n在平板上出现了圆形稍扁平的黄色菌落，周围培养基变为黄色，初步定为乳酸菌，取出少量在显微镜下观察到了链球状和杆状两种形状。n2.乳酸菌的鉴定n该菌种的菌落为圆形稍扁平的黄色菌落，有杆状和链球状两种形状。在吲哚试验中，加入菌种的试管无任何变化，证明为阴性反应n说明该菌不具有分解色氨酸产生吲哚的能力。也说明此菌种不是大肠杆菌，因为大肠杆菌的吲哚试验证明为阳性。n在糖发酵试验中，在加入葡萄糖的

10、发酵培养液中加入菌种后，培养液变为黄色，反应结果为阳性，且杜氏小管内无气泡n加入蔗糖的发酵培养液中加入菌种后的反应结果也为阳性且杜氏小管内无气泡n证明该菌种能分解葡萄糖和蔗糖而产酸。杜氏小管内没有气泡，说明该菌种分解糖后不产气。也证明此菌种不是大肠杆菌，因为如果是大肠杆菌除了产酸反应结果为阳性外，而且杜氏小管内会有气泡，因为大肠杆菌具有分解葡萄糖和蔗糖产酸并产气的能力。为了进一步鉴定该菌种，还做了小型发酵实验，通过滤纸条变黑，说明有乳酸存在n因为在发酵液的上清液中加入10%硫酸1mL和2%高锰酸钾1mL后，此时上清液中的乳酸转化为乙醛，加热后使乙醛挥发，因此使滤纸条变黑。以上种种特征均符合乳酸菌的特征。杆状的即为乳酸菌中的短乳杆菌，链球状的即为乳酸菌中的乳链球菌。此实验内容为自主设计实验，要求如下：此实验内容为自主设计实验，要求如下：1.通过查阅文献资料，了解乳酸菌的性质通过查阅文献资料，了解乳酸菌的性质乳酸的检测方法；乳酸的检测方法；2.设计实验方案，检测你所分离出的微生物设计实验方案，检测你所分离出的微生物是否产生乳酸。是否产生乳酸。3.完成实验报告。完成实验报告。整个实验过程整个实验过程