实时荧光定量PCR技术-全面分析.ppt

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1、 实时定量实时定量PCR技术技术 目录目录实时定量实时定量PCRPCR基本原理基本原理实时定量实时定量PCRPCR的实验设计和数据处理的实验设计和数据处理实时定量实时定量PCRPCR两种相对定量方法比较两种相对定量方法比较实时定量实时定量PCRPCR实验实例分析实验实例分析实时定量实时定量PCRPCR常见故障排查常见故障排查实时定量实时定量PCRPCR的新应用的新应用实时定量实时定量PCR基本原理基本原理常规常规vsvs实时实时常规常规PCR：借助电泳对扩增反应的：借助电泳对扩增反应的终产物终产物进行半进行半定定量及定性量及定性分析分析定量定量PCR技术：利用技术：利用荧光信号的变化实时检测荧

2、光信号的变化实时检测PCRPCR扩增反应中扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化每一个循环扩增产物量的变化，最终精，最终精确的对确的对起始模板起始模板的定量分析的定量分析常规常规vsvs实时实时优缺点比较优缺点比较 定量PCR 常规PCR灵敏度高高精确度安全省时只能进行半定量或定性分析不安全易污染费时费力定量定量PCR三个基本概念三个基本概念扩增曲线扩增曲线指数增长期 平台期线性增长期背景期阈值与阈值与C(t)值值阈值：阈值：是循环开始是循环开始315个循环的荧光信号的标准偏差的个循环的荧光信号的标准偏差的1010倍，设定在倍，设定在扩增曲线扩增曲线指数增长期C(t)值：荧光信号（扩增产物）到达

3、阈值时所经过的值：荧光信号（扩增产物）到达阈值时所经过的扩增循环次数Threshold line C(t)value C(t)value18.12+/-0.04Threshold line C(t)value C(t)value18.12+/-0.04C(t)value18.12+/-0.04C(t)value18.12+/-0.04定量定量PCR的数学原理的数学原理理想的理想的PCRPCR反应：反应：X Xn n=X=X0 022n n非理想的非理想的PCRPCR反应：反应：X Xn n=X=X0 0(1+Ex)(1+Ex)n n方程式两方程式两边同同时取取对数得数得:log Xn=log(

4、X0(1+Ex)n)整理方程式得整理方程式得:log X0=(-log(1+Ex)n+log Xn将将C(t)C(t)和达到和达到C(t)C(t)值时终产物的量值时终产物的量Xc(t)带入上式得：带入上式得：logX0=(-log(1+Ex)C(t)+logXc(t)初始浓度的对数与循环数呈线性关系初始浓度的对数与循环数呈线性关系n n：扩增反应的循环次数：扩增反应的循环次数X Xn n：第：第n n次循环后的产物量次循环后的产物量X X0 0：初始模板量：初始模板量ExEx：扩增效率：扩增效率荧光强度荧光强度-循环数曲线循环数曲线初始模板量对数初始模板量对数-C(T)循环数标准曲线循环数标准

5、曲线10410310610510210C(t)与初始模板含量与初始模板含量初始模板量越多，初始模板量越多，C(t)C(t)值越小值越小C(t)C(t)与初始模板浓度的对数值成线性关系与初始模板浓度的对数值成线性关系定量原理定量原理浓度的对数值浓度的对数值与与循环数循环数呈呈线性关系，根据样品扩增线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数（达到域值的循环数（Ct值）值）就可分析样品中起始模板就可分析样品中起始模板量量化学原理化学原理化学方法分类化学方法分类非特异性非特异性SYBRGreenI法法特异性特异性TaqMan探针法探针法SYBRGreenI法法结合双链结合双链DNADNA分子小沟分子小沟延

6、伸结束，形成双链延伸结束，形成双链DNADNA，SYBR GreenSYBR Green结合到双螺旋小沟中，当受到适合光源结合到双螺旋小沟中，当受到适合光源激发，发射出荧光，反映产物浓度激发，发射出荧光，反映产物浓度优点优点使用方便，无需复杂的设计使用方便，无需复杂的设计成本较低成本较低缺点缺点与非特异性产物结合，无模板特异性与非特异性产物结合，无模板特异性试验方法较难优化试验方法较难优化灵敏度低灵敏度低TaqMan探针法探针法水解型水解型报告基团，淬灭基团报告基团，淬灭基团FRETFRET（荧光谐振能量传递）（荧光谐振能量传递）识别特异性产物识别特异性产物优点优点特异性高，可准确定量特异性高

7、，可准确定量灵敏度高灵敏度高设计不同标记的探针，可进行多重检测设计不同标记的探针，可进行多重检测缺点缺点一个探针只适用于一个目标一个探针只适用于一个目标价格较高价格较高探针设计较繁琐探针设计较繁琐两种化学的比较两种化学的比较化学试剂化学试剂工作原理工作原理有否淬灭剂有否淬灭剂信号检测阶段信号检测阶段SYBR Green ISYBR Green I结合于双链结合于双链DNADNA的小沟中的小沟中否否延伸延伸TaqManTaqMan水解型杂交探针（水解型杂交探针（5 5-3-3外切）外切）有有任何步骤任何步骤定量定量PCR的的实验设计和数和数据据处理理 绝对定量与相对定量绝对定量与相对定量绝对定量

8、与相定量与相对定量定量绝对定量：精确的计算初始反应的模板浓度（绝对定量：精确的计算初始反应的模板浓度（DNADNA，RNARNA）相对定量：计算初始反应模板的相对含量相对定量：计算初始反应模板的相对含量定量定量PCR-PCR-绝对定量绝对定量标准品，标准曲线标准品，标准曲线已知浓度的相应已知浓度的相应DNADNA模板，按不同浓度稀释模板，按不同浓度稀释根据实时根据实时PCRPCR反应得到相应的反应得到相应的C(t)C(t)，构建标准曲线，构建标准曲线样品样品与标准品同时进行与标准品同时进行PCRPCR反应得到未知浓度样品的反应得到未知浓度样品的C(t)C(t)值值unknown104103使用

9、定量使用定量PCRPCR进行绝对定量的优势进行绝对定量的优势敏感性高敏感性高检测低拷贝数样品：单拷贝检测低拷贝数样品：单拷贝大范围拷贝数样品同时检测大范围拷贝数样品同时检测10100 010101010省时有效省时有效定量定量PCR-PCR-相对定量相对定量相对定量的目的相对定量的目的比较基因在不同情况下的表达差异（倍数关系）比较基因在不同情况下的表达差异（倍数关系）相对定量的问题相对定量的问题样品材料不均一造成的差别样品材料不均一造成的差别内标基因内标基因内标通常是内标通常是b-actin、GAPDH、18SrRNA等看家基因（内等看家基因（内标基因的表达要相对恒定，表达不受处理因素影响）标

10、基因的表达要相对恒定，表达不受处理因素影响）对目的基因进行均一化：去除样本间加样量不同带来的对目的基因进行均一化：去除样本间加样量不同带来的误差误差SYBRGreenI法进行相对定量的问题法进行相对定量的问题问题：问题：SYBR Green I可以与非特异性双链结合可以与非特异性双链结合 非特异产物信非特异产物信号号 结果不准确结果不准确解决办法：解决办法：引入熔链曲线分析引入熔链曲线分析熔链曲线分析熔链曲线分析在在PCRPCR反应程序结束后，逐步提高温度，读取荧光反应程序结束后，逐步提高温度，读取荧光值，得到温度与荧光值的关系曲线值，得到温度与荧光值的关系曲线温度温度荧光信号强度荧光信号强度

11、TmTmTm值：值：值：值：DNADNA解链一半时的温度解链一半时的温度解链一半时的温度解链一半时的温度-dIdTTm熔链曲线分析熔链曲线分析决定退火温度决定退火温度Non-specific productspecific productspecific product实时定量定量PCR两种相两种相对定定量方法比量方法比较相对双标准曲线法和相对双标准曲线法和2-c(t)法法相对标准曲线法相对标准曲线法用目标基因和内标基因的标准品分别获得用目标基因和内标基因的标准品分别获得标准曲线标准曲线处理与未处理样品同时扩增目标基因和内标基因，获得处理与未处理样品同时扩增目标基因和内标基因，获得C(t)C(

12、t)值值用内标基因对目标基因用内标基因对目标基因均一化均一化处理样本与未处理样本目标基因处理样本与未处理样本目标基因C(t)C(t)值经内参基因均一化值经内参基因均一化后相除，即可得出处理样本与未处理样本的表达差异后相除，即可得出处理样本与未处理样本的表达差异适用范围适用范围目标基因与内标基因扩增效率差异较大目标基因与内标基因扩增效率差异较大扩增效率较低扩增效率较低2-c(t)法法公式推公式推导导M:目目标标基因，基因，N：内：内标标基因基因XC(t)M=X0M*2C(t)M=A(域域值值)(1)XC(t)N=X0N*2C(t)N=A(域域值值)(2)均一化均一化(1)/(2):X0M/X0N

13、=2C(t)N-C(t)M=2-C(t)处处理理2与与处处理理1相比：相比：(X0M2/X0N2):(X0M/X0N)=2-C(t)2-C(t)1=2-C(t)C(t)=(C(t)M2-C(t)N2)-(C(t)M1-C(t)N1)当有多个当有多个样样品品时时（如（如时间时间点），各点），各样样品均一化后都与同一品均一化后都与同一时间时间点相比点相比一般步骤一般步骤选定目标基因和内标基因选定目标基因和内标基因设计一步法或两步法设计一步法或两步法RT-PCRRT-PCR反应反应数据获得及处理数据获得及处理目标基因目标基因C(t)值（处理，未处理）值（处理，未处理）内标基因内标基因C(t)值（处理

14、，未处理）值（处理，未处理）计算计算2-c(t)作图作图适用范围适用范围当扩增效率较高，且目标基因和内标基因扩增效率当扩增效率较高，且目标基因和内标基因扩增效率比较一致比较一致不做标准曲线，高通量检测不做标准曲线，高通量检测目标基因和内标基因扩增效率的快速检测目标基因和内标基因扩增效率的快速检测通过并列跑两条扩增曲线，查看指数增长期的曲线之间是通过并列跑两条扩增曲线，查看指数增长期的曲线之间是否平行否平行验证试验验证试验目的基因和内参基因扩增效率一致性检测目的基因和内参基因扩增效率一致性检测 检测目标基因与内标基因在不同稀释浓度下的检测目标基因与内标基因在不同稀释浓度下的C(t)，以稀释倍数与

15、，以稀释倍数与C(t)作图，当直线的斜率近似于作图，当直线的斜率近似于0 0（绝对值要小于）时，说明目标基因与内标基因扩增效率（绝对值要小于）时，说明目标基因与内标基因扩增效率一致。一致。问题与解决问题与解决为保证扩增效率一致为保证扩增效率一致扩增子长度扩增子长度引物设计引物设计模板纯度、复杂度等模板纯度、复杂度等反应条件反应条件定量定量PCR实验实例分析例分析利用利用TaqManTaqMan法研究法研究ERBB2 ERBB2 在正常或乳腺肿瘤组在正常或乳腺肿瘤组织标本中的表达差异（织标本中的表达差异（相对标准曲线法相对标准曲线法）已知在已知在50%50%的乳腺肿瘤样本中，的乳腺肿瘤样本中，E

16、RBB2ERBB2表达异常，因此可以表达异常，因此可以作为一个检测标准作为一个检测标准选用选用GAPDHGAPDH作为内标基因作为内标基因FAMFAM标记的标记的ERBB2ERBB2探针探针VICVIC标记的标记的GAPDHGAPDH探针探针构建标准曲线构建标准曲线双重双重PCRPCR反应反应阴性对照阴性对照无无RNARNA对照（空白）对照（空白）无逆转录酶对照（基因组）无逆转录酶对照（基因组）标准曲线标准曲线Color 2-VIC detection for GAPDHColor 1 FAM detection for ERBB2样品扩增：正常样品扩增：正常vsvs肿瘤肿瘤PMT1-FAM

17、detection-ERBB2PMT2-VIC detection-GAPDH肿瘤肿瘤正常正常实验结果实验结果Multiplex Reactions:C(t)Healthy RNACarcinoma28.4027.3628.4627.1228.43 0.0426.24 0.17ERBB2表达Multiplex Reactions:C(t)Healthy RNACarcinoma23.2722.8123.4122.8628.34 0.1026.83 0.03GAPDH表达实验结果实验结果HealthyRNATumorRNAGAPDHERBB2109510522130249295500857301

18、36000130800Copies ng/l Total RNAERBB2 copies/GAPDH copiesHealthy RNATumor RNA80.018/0.0111.6300.20.40.60.811.21.41.61.82HealthyTissueCarc.TissueRelative Expression（2-c(t)法）法）C(t)=4.41-5.18=-2-c(t)=结果与双标准曲线法相结果与双标准曲线法相近近Healthy RNABBER2GAPDHC(t)28.4023.275.3128.4623.415.0528.43 0.0428.34 0.105.180.18

19、Carcinoma RNABBER2GAPDHC(t)27.3622.814.5527.1222.864.2626.24 0.1726.83 0.034.41 0.21实时定量定量PCR常常见故障排故障排查故障排故障排查-软件界面件界面扩增曲线扩增曲线标准曲线标准曲线原始数据原始数据扩增曲线扩增曲线异常扩增曲线异常扩增曲线扩增曲线扩增曲线基线设置是否正确 基线校准 基线开始值(3-10)基线终止值（指数期之前）阈值设置是否正确 设置在指数增长期(可自动或手动设置）标准曲线标准曲线原始数据原始数据常见问题常见问题抑制物抑制物 PCRPCR前前精密度差精密度差扩增曲线异常扩增曲线异常 PCRPCR

20、后后标准曲线差标准曲线差抑制物抑制物PCRPCR抑制物抑制物 多糖类、有机溶剂、蛋白酶多糖类、有机溶剂、蛋白酶K K等等样本质量样本质量 A260/A280-DNA:A260/A280-DNA:-RNA:-RNA:RTRT反应中的抑制物反应中的抑制物 -RNA -RNA标准曲线标准曲线 PCRPCR抑制物抑制物抑制物？样本质量样本质量起始模板量越高，抑制物含量越高RNA标准曲线标准曲线精密度差精密度差精密度高 精密度低 40次相同的重复 3次相同的重复 精密度低的原因精密度低的原因加样误差加样误差 操作、移液器、反应液未混匀操作、移液器、反应液未混匀体系配置方法体系配置方法 低拷贝数的样品（泊

21、松分布）低拷贝数的样品（泊松分布）没有使用没有使用ROXROX校准校准 扩增曲线异常扩增曲线异常平台期低平台期低样品浓度？引物二聚体或浓度？扩增曲线异常扩增曲线异常指数增长期异常指数增长期异常无指数增长期或指数增长期较短扩增曲线异常扩增曲线异常曲线不光滑曲线不光滑扩增时间开始较晚，定量不准确标准曲线评价标准曲线评价评价标准曲线：扩增效率(E)-90%-110%相关系数(R2)-大于 平行管重复性 -SD小于 标准曲线差标准曲线差可能的影响因素 稀释精度 加样精度 反应体系的优化 模板降解 定量定量PCR的新运用的新运用等位基因分型（等位基因分型（SNPSNP研究研究)MicroRNAMicroRNA分析分析基因拷贝数（基因拷贝数（CNV)CNV)分析分析蛋白质分析蛋白质分析