实验一苏云金芽孢杆菌ICP基因的检测.ppt

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1、 微生物遗传部分微生物遗传部分实验四、实验四、T4噬菌体基因组噬菌体基因组rII 区域不同基因突变的互补区域不同基因突变的互补 导导 语语 T4T4是研究得最深入的一类大肠杆菌烈性噬菌体，其基因组是研究得最深入的一类大肠杆菌烈性噬菌体，其基因组是研究得最深入的一类大肠杆菌烈性噬菌体，其基因组是研究得最深入的一类大肠杆菌烈性噬菌体，其基因组是双链线性是双链线性是双链线性是双链线性DNADNA分子，约有碱基对，编码的蛋白质超过分子，约有碱基对，编码的蛋白质超过分子，约有碱基对，编码的蛋白质超过分子，约有碱基对，编码的蛋白质超过135135种。种。种。种。T4T4基因组的两端具有约基因组的两端具有约

2、基因组的两端具有约基因组的两端具有约3 36kb6kb的正向重复序列，的正向重复序列，的正向重复序列，的正向重复序列，全长比其头部长全长比其头部长全长比其头部长全长比其头部长650650倍，意味着倍，意味着倍，意味着倍，意味着T4 DNAT4 DNA是高度螺旋、紧是高度螺旋、紧是高度螺旋、紧是高度螺旋、紧密折叠地装配在头部中。密折叠地装配在头部中。密折叠地装配在头部中。密折叠地装配在头部中。T4T4基因组基因组基因组基因组rIIrII区域有区域有区域有区域有2 2个基因个基因个基因个基因rIIArIIA和和和和 rIIB rIIB，这，这，这，这2 2个基因突变均表现为快速溶菌，这种快速溶个基

3、因突变均表现为快速溶菌，这种快速溶个基因突变均表现为快速溶菌，这种快速溶个基因突变均表现为快速溶菌，这种快速溶菌突变型的生长对大肠杆菌的不同品系具有选择性：突变菌突变型的生长对大肠杆菌的不同品系具有选择性：突变菌突变型的生长对大肠杆菌的不同品系具有选择性：突变菌突变型的生长对大肠杆菌的不同品系具有选择性：突变型若感染型若感染型若感染型若感染 C C菌株，可以形成大而透明的噬菌斑，因此将菌株，可以形成大而透明的噬菌斑，因此将菌株，可以形成大而透明的噬菌斑，因此将菌株，可以形成大而透明的噬菌斑，因此将 C C菌株称为受纳性寄主；突变型若感染菌株称为受纳性寄主；突变型若感染菌株称为受纳性寄主；突变型

4、若感染菌株称为受纳性寄主；突变型若感染 K K菌株，则不能复制菌株，则不能复制菌株，则不能复制菌株，则不能复制其其其其DNA,DNA,因此不能形成噬菌斑，因此将因此不能形成噬菌斑，因此将因此不能形成噬菌斑，因此将因此不能形成噬菌斑，因此将 K K菌株称为限制性菌株称为限制性菌株称为限制性菌株称为限制性寄主。巧妙地利用这一特点设计了经典的互补实验，首次寄主。巧妙地利用这一特点设计了经典的互补实验，首次寄主。巧妙地利用这一特点设计了经典的互补实验，首次寄主。巧妙地利用这一特点设计了经典的互补实验，首次证明顺反子（证明顺反子（证明顺反子（证明顺反子（CistronCistron即基因）是一个必须保持

5、完整才具即基因）是一个必须保持完整才具即基因）是一个必须保持完整才具即基因）是一个必须保持完整才具有正常生理功能的遗传物质最小的功能单位。一个基因或有正常生理功能的遗传物质最小的功能单位。一个基因或有正常生理功能的遗传物质最小的功能单位。一个基因或有正常生理功能的遗传物质最小的功能单位。一个基因或一个顺反子是一个完整的结构，所以属于同一基因的两个一个顺反子是一个完整的结构，所以属于同一基因的两个一个顺反子是一个完整的结构，所以属于同一基因的两个一个顺反子是一个完整的结构，所以属于同一基因的两个突变型不能互补，如果两个突变型能够互补，就说明它们突变型不能互补，如果两个突变型能够互补，就说明它们突

6、变型不能互补，如果两个突变型能够互补，就说明它们突变型不能互补，如果两个突变型能够互补，就说明它们属于不同的基因突变，影响的不是同一功能。属于不同的基因突变，影响的不是同一功能。属于不同的基因突变，影响的不是同一功能。属于不同的基因突变，影响的不是同一功能。导导 语语 T4噬菌体是一类专性寄生的原核生物，噬菌体是一类专性寄生的原核生物，只能在寄主细胞内繁殖。噬菌体比细菌繁只能在寄主细胞内繁殖。噬菌体比细菌繁殖速度快得多，典型的细菌一般在殖速度快得多，典型的细菌一般在30min内由内由1个变为个变为2个，而个，而1个个T4噬菌体在相同噬菌体在相同的时间内可以形成将近的时间内可以形成将近100个左

7、右的子代个左右的子代噬菌体，因此噬菌体，因此2h后当细菌和噬菌体都繁殖后当细菌和噬菌体都繁殖了了4代时，细菌的数目是代时，细菌的数目是2416，而噬菌，而噬菌体的数目却是体的数目却是1004108！导导 语语 自从自从自从自从19171917年发明在平板上观察噬菌斑（年发明在平板上观察噬菌斑（年发明在平板上观察噬菌斑（年发明在平板上观察噬菌斑（plaqueplaque）的方法后）的方法后）的方法后）的方法后一直延续至今，噬菌体浓度的测定也是通过计数噬菌斑的一直延续至今，噬菌体浓度的测定也是通过计数噬菌斑的一直延续至今，噬菌体浓度的测定也是通过计数噬菌斑的一直延续至今，噬菌体浓度的测定也是通过计

8、数噬菌斑的多少。多少。多少。多少。100100个细菌在平板上会形成个细菌在平板上会形成个细菌在平板上会形成个细菌在平板上会形成100100个菌落，若个菌落，若个菌落，若个菌落，若108108个细个细个细个细菌在平板上会融合在一起形成一个浑浊层，称为菌在平板上会融合在一起形成一个浑浊层，称为菌在平板上会融合在一起形成一个浑浊层，称为菌在平板上会融合在一起形成一个浑浊层，称为“lawn”“lawn”，为使菌体能形成均匀的一层，首先将细菌混合在少量热，为使菌体能形成均匀的一层，首先将细菌混合在少量热，为使菌体能形成均匀的一层，首先将细菌混合在少量热，为使菌体能形成均匀的一层，首先将细菌混合在少量热的

9、液体琼脂中，然后倒在固体平板的上层，这一液体琼脂的液体琼脂中，然后倒在固体平板的上层，这一液体琼脂的液体琼脂中，然后倒在固体平板的上层，这一液体琼脂的液体琼脂中，然后倒在固体平板的上层，这一液体琼脂称为称为称为称为Top agarTop agar或或或或 Soft agar Soft agar，它会迅速凝固形成一个光滑的，它会迅速凝固形成一个光滑的，它会迅速凝固形成一个光滑的，它会迅速凝固形成一个光滑的表层，细菌在这一薄层中会长得非常均匀。如果有表层，细菌在这一薄层中会长得非常均匀。如果有表层，细菌在这一薄层中会长得非常均匀。如果有表层，细菌在这一薄层中会长得非常均匀。如果有1 1个噬菌个噬菌

10、个噬菌个噬菌体存在，它将会感染细菌，随后被感染的细菌裂解后释放体存在，它将会感染细菌，随后被感染的细菌裂解后释放体存在，它将会感染细菌，随后被感染的细菌裂解后释放体存在，它将会感染细菌，随后被感染的细菌裂解后释放100100200200个子代噬菌体，它们又去感染附近的细菌，如此个子代噬菌体，它们又去感染附近的细菌，如此个子代噬菌体，它们又去感染附近的细菌，如此个子代噬菌体，它们又去感染附近的细菌，如此延续下去几个小时，噬菌体就会把这一区域的细菌全部吃延续下去几个小时，噬菌体就会把这一区域的细菌全部吃延续下去几个小时，噬菌体就会把这一区域的细菌全部吃延续下去几个小时，噬菌体就会把这一区域的细菌全

11、部吃光，在浑浊均匀层上形成一个清晰透明的洞，称为光，在浑浊均匀层上形成一个清晰透明的洞，称为光，在浑浊均匀层上形成一个清晰透明的洞，称为光，在浑浊均匀层上形成一个清晰透明的洞，称为plaque,plaque,因为因为因为因为1 1个噬菌体形成个噬菌体形成个噬菌体形成个噬菌体形成1 1个个个个plaqueplaque，故噬菌体的浓度便可以计，故噬菌体的浓度便可以计，故噬菌体的浓度便可以计，故噬菌体的浓度便可以计算出。噬菌体的浓度单位称为噬斑形成单位，表示：算出。噬菌体的浓度单位称为噬斑形成单位，表示：算出。噬菌体的浓度单位称为噬斑形成单位，表示：算出。噬菌体的浓度单位称为噬斑形成单位，表示：PF

12、U/mLPFU/mL。一、实验目的一、实验目的通过实验了解基因互补的原理，并确定几个T4快速溶菌突变型是否属同一基因突变。二、实验原理二、实验原理 将将将将2 2个不同的个不同的个不同的个不同的T4 rIIT4 rII突变型共同感染限制性寄主突变型共同感染限制性寄主突变型共同感染限制性寄主突变型共同感染限制性寄主 K K菌株菌株菌株菌株,若若若若2 2个个个个突变的噬菌体不是影响相同的功能突变的噬菌体不是影响相同的功能突变的噬菌体不是影响相同的功能突变的噬菌体不是影响相同的功能,则可表现互补使其各自的则可表现互补使其各自的则可表现互补使其各自的则可表现互补使其各自的DNADNA在在在在 K K

13、菌株中得以复制菌株中得以复制菌株中得以复制菌株中得以复制,在复制过程中相互重组在复制过程中相互重组在复制过程中相互重组在复制过程中相互重组,进而形成进而形成进而形成进而形成了野生型的噬菌体了野生型的噬菌体了野生型的噬菌体了野生型的噬菌体,野生型的噬菌体经反复感染和裂解限制野生型的噬菌体经反复感染和裂解限制野生型的噬菌体经反复感染和裂解限制野生型的噬菌体经反复感染和裂解限制性寄主性寄主性寄主性寄主,便可形成清晰的噬菌斑。便可形成清晰的噬菌斑。便可形成清晰的噬菌斑。便可形成清晰的噬菌斑。将一系列表型相同的将一系列表型相同的将一系列表型相同的将一系列表型相同的rIIrII突变型突变型突变型突变型,双

14、双混合感染限制性宿主进行双双混合感染限制性宿主进行双双混合感染限制性宿主进行双双混合感染限制性宿主进行互补实验，全部互补实验，全部互补实验，全部互补实验，全部 rII rII突变型可以区分为突变型可以区分为突变型可以区分为突变型可以区分为 rIIA rIIA和和和和rIIBrIIB两个互补群，两个互补群，两个互补群，两个互补群，同属于同属于同属于同属于rIIArIIA或或或或rIIBrIIB的两个突变型在混合感染中没有互补作用，的两个突变型在混合感染中没有互补作用，的两个突变型在混合感染中没有互补作用，的两个突变型在混合感染中没有互补作用，任何一个任何一个任何一个任何一个rIIArIIA突变型

15、和任何一个突变型和任何一个突变型和任何一个突变型和任何一个rIIBrIIB突变型在混合感染中都有突变型在混合感染中都有突变型在混合感染中都有突变型在混合感染中都有互补作用，使表型恢复正常。一系列互补作用，使表型恢复正常。一系列互补作用，使表型恢复正常。一系列互补作用，使表型恢复正常。一系列rIIArIIA突变型在染色体上所突变型在染色体上所突变型在染色体上所突变型在染色体上所占的区域称为顺反子占的区域称为顺反子占的区域称为顺反子占的区域称为顺反子A A，一系列，一系列，一系列，一系列rIIBrIIB突变型在染色体上所占的突变型在染色体上所占的突变型在染色体上所占的突变型在染色体上所占的区域称为

16、顺反子区域称为顺反子区域称为顺反子区域称为顺反子B B，由于，由于，由于，由于rIIrII突变型均为点突变，故实验中必须突变型均为点突变，故实验中必须突变型均为点突变，故实验中必须突变型均为点突变，故实验中必须要有检测回复突变的对照。要有检测回复突变的对照。要有检测回复突变的对照。要有检测回复突变的对照。三、实验材料和用具三、实验材料和用具菌种：菌种：菌种：菌种：C(C(受纳性寄主受纳性寄主受纳性寄主受纳性寄主)和和和和 K K（限制性菌株）（限制性菌株）（限制性菌株）（限制性菌株）过夜培养物过夜培养物过夜培养物过夜培养物T4 rIIT4 rII突变型突变型突变型突变型2626，2828，29

17、29：点样浓度为：点样浓度为：点样浓度为：点样浓度为1x108/ml,1x108/ml,倒平板浓度为倒平板浓度为倒平板浓度为倒平板浓度为1x109/ml1x109/mlHAHA平板平板平板平板9 9块（效价测定用块（效价测定用块（效价测定用块（效价测定用5 5块）块）块）块）HSAHSA试管试管试管试管 3mL x 9 3mL x 9只只只只2020 l l、200200 l l移液器各一支，移液器各一支，移液器各一支，移液器各一支，TipTip48 oC48 oC水浴水浴水浴水浴 四实验方法和内容四实验方法和内容（一）噬菌体T4裂解液的制备 1 1双层平板法制备裂解液双层平板法制备裂解液双层

18、平板法制备裂解液双层平板法制备裂解液（1 1）将）将）将）将 C C接种接种接种接种3mL HB3mL HB中，中，中，中，3737 震荡培养震荡培养震荡培养震荡培养5656小时。小时。小时。小时。（2 2）制备）制备）制备）制备HAHA平板，待凝固后置平板，待凝固后置平板，待凝固后置平板，待凝固后置5050 烘烘烘烘3030分钟备用。分钟备用。分钟备用。分钟备用。（3 3）取小试管一只，加菌悬液，加浓度为）取小试管一只，加菌悬液，加浓度为）取小试管一只，加菌悬液，加浓度为）取小试管一只，加菌悬液，加浓度为105105106106的的的的 T4 T4储存储存储存储存液，再加入液，再加入液，再加

19、入液，再加入3mL 503mL 50 左右的左右的左右的左右的HSAHSA（软琼脂培养基），混合均（软琼脂培养基），混合均（软琼脂培养基），混合均（软琼脂培养基），混合均匀后倒在匀后倒在匀后倒在匀后倒在HAHA平板上层，凝固后平板上层，凝固后平板上层，凝固后平板上层，凝固后3737培养过夜。培养过夜。培养过夜。培养过夜。（4 4）用涂棒）用涂棒）用涂棒）用涂棒 将将将将HAHA平板上层软琼脂刮入离心管，加入平板上层软琼脂刮入离心管，加入平板上层软琼脂刮入离心管，加入平板上层软琼脂刮入离心管，加入3mL HB3mL HB，静置，静置，静置，静置3030分钟，加分钟，加分钟，加分钟，加2323滴氯

20、仿，剧烈震荡半分钟。滴氯仿，剧烈震荡半分钟。滴氯仿，剧烈震荡半分钟。滴氯仿，剧烈震荡半分钟。（5 5）4000 rpm 4000 rpm 离心离心离心离心15 min15 min，取出上清液，加几滴氯仿，取出上清液，加几滴氯仿，取出上清液，加几滴氯仿，取出上清液，加几滴氯仿，4 4冰箱保存备用。冰箱保存备用。冰箱保存备用。冰箱保存备用。（一）噬菌体T4裂解液的制备2液体法制备裂解液液体法制备裂解液（1）将）将 C 接种接种3mL HB中，中，37震荡培震荡培养养23小时。小时。（2）加入）加入1%体积的体积的 T4储存液（或单噬储存液（或单噬斑斑1个），继续震荡培养个），继续震荡培养5小时，一

21、般应测小时，一般应测OD600 值，当值，当OD值下降又回升时停止培值下降又回升时停止培养。养。（3）加）加23滴氯仿，震荡半分钟，滴氯仿，震荡半分钟，4000rpm离心离心15分钟，取上清液加几滴氯分钟，取上清液加几滴氯仿，置仿，置4冰箱保存备用。冰箱保存备用。（二）裂解液效价测定将将将将 C C 接种接种接种接种3mL HB3mL HB中，中，中，中，3737震荡培养震荡培养震荡培养震荡培养5 5小时。小时。小时。小时。制备制备制备制备HAHA平板，待凝固后置平板，待凝固后置平板，待凝固后置平板，待凝固后置5050 烘烘烘烘3030分钟备用。分钟备用。分钟备用。分钟备用。将将将将T4T4裂

22、解液依次稀释至裂解液依次稀释至裂解液依次稀释至裂解液依次稀释至10-7 10-7。取一只小试管，加入取一只小试管，加入取一只小试管，加入取一只小试管，加入0.2mL C0.2mL C，加入，加入，加入，加入T4T4裂解液裂解液裂解液裂解液（10-610-6，10-710-7），每个稀释度两只试管，再加入），每个稀释度两只试管，再加入），每个稀释度两只试管，再加入），每个稀释度两只试管，再加入2.5mL HAS2.5mL HAS（5050左右），左右），左右），左右），混合均匀后迅速倒在混合均匀后迅速倒在混合均匀后迅速倒在混合均匀后迅速倒在HAHA平板上层，凝固后，平板上层，凝固后，平板上层，凝

23、固后，平板上层，凝固后，3737倒置培养。倒置培养。倒置培养。倒置培养。培养培养培养培养6 6小时后，便可以计数噬菌斑，计算裂解液效小时后，便可以计数噬菌斑，计算裂解液效小时后，便可以计数噬菌斑，计算裂解液效小时后，便可以计数噬菌斑，计算裂解液效价。价。价。价。检测回复突变，取一只小试管，加入检测回复突变，取一只小试管，加入检测回复突变，取一只小试管，加入检测回复突变，取一只小试管，加入0.2mL K0.2mL K，加，加，加，加入入入入T4T4裂解液（裂解液（裂解液（裂解液（10-510-5），再加入），再加入），再加入），再加入2.5mL HAS2.5mL HAS（5050左右），左右），

24、左右），左右），混合均匀后迅速倒在混合均匀后迅速倒在混合均匀后迅速倒在混合均匀后迅速倒在HAHA平板上层，凝固平板上层，凝固平板上层，凝固平板上层，凝固后，后，后，后，3737倒置培养。倒置培养。倒置培养。倒置培养。（三）互补实验（三）互补实验1）取取 K，接种于，接种于HB培养基，培养基，37oC，180rpm振荡培养过夜。振荡培养过夜。2）首先制备好）首先制备好4块块HA平板，将装有平板，将装有HSA（软琼脂）的试管置于（软琼脂）的试管置于48oC水浴保温。水浴保温。3）在每一）在每一HA平板的底部预先标记好以下内平板的底部预先标记好以下内容：容：No phage,26X,28X,29X

25、（三）互补实验（三）互补实验4 4）在每支）在每支）在每支）在每支HSAHSA试管中加试管中加试管中加试管中加0.2ml 0.2ml K K过夜培养物。过夜培养物。过夜培养物。过夜培养物。5 5）将第一支）将第一支）将第一支）将第一支HSAHSA试管倒到试管倒到试管倒到试管倒到“无噬菌体无噬菌体无噬菌体无噬菌体”的平板上，用的平板上，用的平板上，用的平板上，用做回复突变的对照。做回复突变的对照。做回复突变的对照。做回复突变的对照。6 6）往第二支）往第二支）往第二支）往第二支HSAHSA试管中加试管中加试管中加试管中加0.1ml rII 26(1x109/mL),0.1ml rII 26(1x

26、109/mL),混混混混合好后倒合好后倒合好后倒合好后倒“26x”“26x”平板，其它的噬菌体均以相同的平板，其它的噬菌体均以相同的平板，其它的噬菌体均以相同的平板，其它的噬菌体均以相同的方式倒好平板。方式倒好平板。方式倒好平板。方式倒好平板。7 7）将噬菌体）将噬菌体）将噬菌体）将噬菌体2626，2828，2929分别进行分别进行分别进行分别进行1010倍稀释。倍稀释。倍稀释。倍稀释。8 8）用接种环或用移液器吸取）用接种环或用移液器吸取）用接种环或用移液器吸取）用接种环或用移液器吸取3-53-5 l l各种稀释后的噬菌各种稀释后的噬菌各种稀释后的噬菌各种稀释后的噬菌体悬液（体悬液（体悬液（

27、体悬液（1x108/ml1x108/ml），小心点到每一平板相应的），小心点到每一平板相应的），小心点到每一平板相应的），小心点到每一平板相应的位置上。位置上。位置上。位置上。实验注意事项：实验注意事项：点样时应小心勿将琼脂划破！点样时应小心勿将琼脂划破！各种噬菌体的点样位点必须有一各种噬菌体的点样位点必须有一定间隔，防止连成片不易分析结定间隔，防止连成片不易分析结果！果！点完样后不要立即翻动平板，待点完样后不要立即翻动平板，待所点样品完全干后，再倒置平板所点样品完全干后，再倒置平板培养！培养！五实验报告五实验报告：（一）实验结果用+或表示，如点样位置上有较多的噬菌斑则为 ，无噬菌斑则为 ，但要与对照平板比较，检查每一 rII突变型单独感染K菌株是否形成噬菌斑，记录下观察的实验结果。（二）分析各T4噬菌体基因组rII突变型的基因互补关系，依据实验结果确定噬菌体26、28分别为哪一基因突变。六思考题六思考题1）互补实验的意义。）互补实验的意义。2）两个不同基因突变的）两个不同基因突变的T4噬菌噬菌体所发生的互补是基因产物体所发生的互补是基因产物的互补，为什么发生互补后的互补，为什么发生互补后会形成野生型的会形成野生型的T4噬菌体？噬菌体？