实验一蛋白质的两性反应及等电点的测定.ppt

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1、实验一实验一 蛋白质的两性反应蛋白质的两性反应及等电点的测定及等电点的测定一、实验目的一、实验目的1、了解蛋白质的两性解离性质。、了解蛋白质的两性解离性质。2 2、初步学会测定蛋白质等电点的方、初步学会测定蛋白质等电点的方法。法。3 3、学会正确使用吸量管吸量试液。、学会正确使用吸量管吸量试液。二、实验原理二、实验原理 蛋白质分子除含有一定的自由氨基和羧基外，蛋白质分子除含有一定的自由氨基和羧基外，还含有酚基、巯基、胍基、唑基等，因此，蛋白还含有酚基、巯基、胍基、唑基等，因此，蛋白质和氨基酸一样也有两性电离的性质。在溶液中，质和氨基酸一样也有两性电离的性质。在溶液中，蛋白质的解离状态受溶液酸碱

2、度影响，酸性溶液蛋白质的解离状态受溶液酸碱度影响，酸性溶液中蛋白质解离成阳离子，碱性溶液中则解离成阴中蛋白质解离成阳离子，碱性溶液中则解离成阴离子。等电点时，蛋白质分子所携带的正负电荷离子。等电点时，蛋白质分子所携带的正负电荷相等，以兼性离子存在，在电场中不向正负电极相等，以兼性离子存在，在电场中不向正负电极移动，在溶液中溶解度最小，容易沉淀析出。移动，在溶液中溶解度最小，容易沉淀析出。不同的蛋白质等电点不同，可利用溶解度来不同的蛋白质等电点不同，可利用溶解度来测定其等电点。向各种不同测定其等电点。向各种不同pHpH值的缓冲溶液中加值的缓冲溶液中加入酪蛋白，以沉淀出现最多的缓冲液的入酪蛋白，以

3、沉淀出现最多的缓冲液的pHpH值为酪值为酪蛋白的等电点。蛋白的等电点。等电点时，蛋白质以兼性离子存在，容易沉淀析出等电点时，蛋白质以兼性离子存在，容易沉淀析出。三、试剂和器材三、试剂和器材1 1 1 1、试剂、试剂、试剂、试剂 （1 1 1 1）0.5%0.5%0.5%0.5%酪蛋白溶液酪蛋白溶液酪蛋白溶液酪蛋白溶液 （2 2 2 2）酪蛋白乙酸钠溶液：称取纯酪蛋白克，加蒸馏水）酪蛋白乙酸钠溶液：称取纯酪蛋白克，加蒸馏水）酪蛋白乙酸钠溶液：称取纯酪蛋白克，加蒸馏水）酪蛋白乙酸钠溶液：称取纯酪蛋白克，加蒸馏水20202020毫升毫升毫升毫升及及及及1.00 mol/L1.00 mol/L1.00

4、 mol/L1.00 mol/L氢氧化钠溶液氢氧化钠溶液氢氧化钠溶液氢氧化钠溶液5 5 5 5毫升毫升毫升毫升(必须准确必须准确必须准确必须准确)，摇荡使酪蛋白，摇荡使酪蛋白，摇荡使酪蛋白，摇荡使酪蛋白溶解。然后加溶解。然后加溶解。然后加溶解。然后加1.00 mol/L1.00 mol/L1.00 mol/L1.00 mol/L醋酸醋酸醋酸醋酸5 5 5 5毫升毫升毫升毫升(必须准确必须准确必须准确必须准确)，倒人，倒人，倒人，倒人50505050毫升毫升毫升毫升容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，混匀，结果是酪蛋白溶于容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，混匀，结果是酪蛋白溶于容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度

5、，混匀，结果是酪蛋白溶于容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，混匀，结果是酪蛋白溶于0.10 mol/L0.10 mol/L0.10 mol/L0.10 mol/L乙酸钠溶液中，酪蛋白的浓度为乙酸钠溶液中，酪蛋白的浓度为乙酸钠溶液中，酪蛋白的浓度为乙酸钠溶液中，酪蛋白的浓度为0.5%0.5%0.5%0.5%。（3 3 3 3）溴甲酚绿指示剂。（）溴甲酚绿指示剂。（）溴甲酚绿指示剂。（）溴甲酚绿指示剂。（4 4 4 4）0.02 mol/L0.02 mol/L0.02 mol/L0.02 mol/L盐酸溶液。盐酸溶液。盐酸溶液。盐酸溶液。（5 5 5 5）0.10 mol/L0.10 mol/L0.10

6、 mol/L0.10 mol/L醋酸溶液。醋酸溶液。醋酸溶液。醋酸溶液。（6 6 6 6）0.01 mol/L0.01 mol/L0.01 mol/L0.01 mol/L醋酸溶液。醋酸溶液。醋酸溶液。醋酸溶液。（7 7 7 7）1.00 mol/L1.00 mol/L1.00 mol/L1.00 mol/L的醋酸溶液的醋酸溶液的醋酸溶液的醋酸溶液 （8 8 8 8）0.02 mol/L0.02 mol/L0.02 mol/L0.02 mol/L氢氧化钠溶氢氧化钠溶氢氧化钠溶氢氧化钠溶液。液。液。液。剂i2 2、仪器、仪器（1 1）恒温水浴箱）恒温水浴箱（2 2）温度计）温度计（3 3）100

7、mL100 mL容量瓶容量瓶（4 4）50 mL50 mL容量瓶容量瓶（5 5）吸量管）吸量管（6 6）试管）试管（7 7）试管架等）试管架等四、操作方法四、操作方法（一）蛋白质的两性反应（一）蛋白质的两性反应 1 1 1 1、取、取、取、取1 1 1 1支试管，加酪蛋白溶液支试管，加酪蛋白溶液支试管，加酪蛋白溶液支试管，加酪蛋白溶液20202020滴和滴和滴和滴和0.01%0.01%0.01%0.01%溴甲酚绿指示剂溴甲酚绿指示剂溴甲酚绿指示剂溴甲酚绿指示剂57575757滴，混匀。观察溶液呈现的颜色，并说明原因。滴，混匀。观察溶液呈现的颜色，并说明原因。滴，混匀。观察溶液呈现的颜色，并说明

8、原因。滴，混匀。观察溶液呈现的颜色，并说明原因。2 2 2 2、用细滴管缓慢加入、用细滴管缓慢加入、用细滴管缓慢加入、用细滴管缓慢加入0.02 mol/L0.02 mol/L0.02 mol/L0.02 mol/L盐酸溶液，随滴随摇，直至盐酸溶液，随滴随摇，直至盐酸溶液，随滴随摇，直至盐酸溶液，随滴随摇，直至有明显的大量沉淀发生，此时溶液的有明显的大量沉淀发生，此时溶液的有明显的大量沉淀发生，此时溶液的有明显的大量沉淀发生，此时溶液的pHpHpHpH按近于酪蛋白的等电点。按近于酪蛋白的等电点。按近于酪蛋白的等电点。按近于酪蛋白的等电点。观察溶液颜色的变化。观察溶液颜色的变化。观察溶液颜色的变化

9、。观察溶液颜色的变化。3 3 3 3、继续滴入、继续滴入、继续滴入、继续滴入0.02 mol/L0.02 mol/L0.02 mol/L0.02 mol/L盐酸溶液，观察沉淀和溶液颜色的变盐酸溶液，观察沉淀和溶液颜色的变盐酸溶液，观察沉淀和溶液颜色的变盐酸溶液，观察沉淀和溶液颜色的变化并说明原因。化并说明原因。化并说明原因。化并说明原因。4 4 4 4、再滴入、再滴入、再滴入、再滴入0.02 mol/L0.02 mol/L0.02 mol/L0.02 mol/L氢氧化钠溶液进行中和，观察是否出现氢氧化钠溶液进行中和，观察是否出现氢氧化钠溶液进行中和，观察是否出现氢氧化钠溶液进行中和，观察是否出

10、现沉淀，解释其原因。继续滴入沉淀，解释其原因。继续滴入沉淀，解释其原因。继续滴入沉淀，解释其原因。继续滴入0.02 mol/L0.02 mol/L0.02 mol/L0.02 mol/L氢氧化钠溶液，为什么氢氧化钠溶液，为什么氢氧化钠溶液，为什么氢氧化钠溶液，为什么沉淀又会溶解？溶液的颜色如何变化沉淀又会溶解？溶液的颜色如何变化沉淀又会溶解？溶液的颜色如何变化沉淀又会溶解？溶液的颜色如何变化?说明了什么问题？说明了什么问题？说明了什么问题？说明了什么问题？剂i剂i （二）酪蛋白等电点的测定（二）酪蛋白等电点的测定 1 1、取、取7 7支粗细相近的干燥试管，支粗细相近的干燥试管，编号后按下表的顺

11、序准确地加入各编号后按下表的顺序准确地加入各种试剂。加入每种试剂后应混合均种试剂。加入每种试剂后应混合均匀。匀。剂i试试试试 管管管管 编编编编 号号号号1 12 23 34 45 56 67 7加加加加入入入入试试试试剂剂剂剂(ml(ml)蒸馏水蒸馏水蒸馏水蒸馏水3.23.22.02.03.03.03.53.51.51.52.752.751.00 mol/L1.00 mol/L醋酸醋酸醋酸醋酸0.80.80.10 mol/L0.10 mol/L醋酸醋酸醋酸醋酸4.04.02.02.01.01.00.50.50.01 mol/L0.01 mol/L醋酸醋酸醋酸醋酸2.52.51.251.25酪

12、蛋白乙酸酪蛋白乙酸酪蛋白乙酸酪蛋白乙酸钠钠钠钠1.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.0 溶液最终溶液最终溶液最终溶液最终pHpH3.83.84.14.14.44.44.74.75.05.05.35.35.65.6 沉淀出现情况沉淀出现情况沉淀出现情况沉淀出现情况剂i2 2、静置约、静置约2020分钟，观察每支试管中溶分钟，观察每支试管中溶液的混浊度，以一，十，十十，十十液的混浊度，以一，十，十十，十十十，十十十十符号表示沉淀的多少。十，十十十十符号表示沉淀的多少。根据观察结果指出哪一个根据观察结果指出哪一个pHpH是酪蛋白是酪蛋白的等电点？的等电点？该实验要求各种试剂的浓度和加入量该实验要求各种试剂的浓度和加入量必须相当准确。实验中应严格按照定必须相当准确。实验中应严格按照定量分析的操作进行。量分析的操作进行。剂i思思 考考 题题何谓蛋白质的等电点？何谓蛋白质的等电点？在等电点时蛋白质的溶解度为什么在等电点时蛋白质的溶解度为什么最低？请结合你的实验结果和蛋白最低？请结合你的实验结果和蛋白质的胶体性质加以说明。质的胶体性质加以说明。