《多糖药物检测方法》PPT课件.ppt

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1、多糖药物检测方法1、硫酸软骨素的含量测定酸性粘多糖，维持组织和免疫机能（1）长期应用于防治冠心病、心绞痛、冠状动脉粥样硬化、心肌缺血等疾病，无明显的毒副作用。在动脉和静脉壁上沉积的脂肪等脂质可以被有效地去除或减少，能显著降低血浆胆固醇。（2）用于治疗神经痛、神经性偏头痛、关节痛等。（3）预防和治疗链霉素引起的听觉障碍，效果显著。（4）应用于化妆品以及外伤伤口的愈合剂等。（5）鲨鱼软骨中的软骨素有抗肿瘤的作用。（6）硫酸软骨素还用于滴眼剂。家畜、鲨鱼类动物是主要的软骨来源。但家畜的软骨产量很低，鲨鱼多是靠天然捕获。因此,需要进一步寻求其它易得而又稳定的软骨来源,。鲟鱼的软骨含量相当高,而且鲟鱼养

2、殖技术已成熟。以匙吻鲟的软骨为原料,用稀碱-酶相结合的方法提取硫酸软骨素匙吻鲟软骨80恒温蒸煮6h洗净冷冻80烘干粉碎料液比16，3%碱提取，提取温度40滤液胰蛋白酶酶降解（用量10001.5，酶解温度45）氯仿萃取弃氯仿层95%乙醇沉淀（沉淀时的pH7.0）过滤60干燥成品硫酸软骨素提取率为36.52%、纯度为97%、蛋白质含量为0.075%、水分为10.52%。检测方法（1）比色法适量样品用6MHCL酸水解2小时，中和与乙酰丙酮反应25分钟，生成色原物质，冷却，然后再与无醛乙醇60反应1小时，525nm处测定吸光度,盐酸氨基葡萄糖做对照(2)紫外法样品与硫酸95共热水解1小时,288nm处

3、测吸光值。需做标准曲线（3）毛细细管电泳测定硫酸软骨素毛细管电泳条件：毛细管内径50m；有效长度50cm缓冲盐：50mM磷酸二氢钾溶液，进样量：5sec,毫升分离电压：28kV样品处理：称取各种待测样品约，用10mL乙腈分散，定容至100mL。氨基葡萄糖标准曲线（）：，硫酸软骨素标准曲线（）：y=344781x+58652，香菇多糖的测定香菇多糖的测定香菇多糖是主链是（13）糖苷链连接的葡聚糖。用这种多糖以2mg/kg剂量腹腔注射已移植肿瘤的大鼠连续5天，结果表明它对肉瘤的抑制率达83%，而相同剂量的经切支水解后得到的较小分子香菇多糖对肉瘤的抑制量更高，达97%以上。机理：有人合成了含有同位素

4、的香菇多糖，并在移植了肿有人合成了含有同位素的香菇多糖，并在移植了肿瘤的小鼠身上做示踪试验，结果发现它瘤的小鼠身上做示踪试验，结果发现它不具备直接杀伤肿不具备直接杀伤肿瘤细胞的能力瘤细胞的能力。随后的大量试验表明它是作为调节机体免。随后的大量试验表明它是作为调节机体免疫反应的疫反应的T细胞促进剂细胞促进剂，通过刺激抗体的产生提高机体的，通过刺激抗体的产生提高机体的免疫能力，从而达到抵抗肿瘤的作用免疫能力，从而达到抵抗肿瘤的作用。香菇多糖注射液香菇多糖注射液(治慢性肝炎及肿瘤治疗的辅助治慢性肝炎及肿瘤治疗的辅助药药);香菇多糖的测定香菇多糖的测定多糖水解成单糖进行测定（滴定法）多糖水解成单糖进行

5、测定（滴定法）含量含量=样品水解后单糖总含量样品水解后单糖总含量-未水解样品中单糖的未水解样品中单糖的含量含量香菇多糖的提取方法香菇多糖的提取方法1.预处理：取干香菇，捣碎。预处理：取干香菇，捣碎。2.提取：将捣碎的干香菇，在搅拌的条件下加提取：将捣碎的干香菇，在搅拌的条件下加67倍量水混倍量水混匀，加热至匀，加热至90，搅拌保温，搅拌保温60 min。降温至降温至40时转移到时转移到40水浴保温，水浴保温，p H64，搅拌，搅拌反应反应60 min，然后迅速升温到，然后迅速升温到90-100，灭活，灭活1min降温降温后纱布过滤，收集滤液。后纱布过滤，收集滤液。3.浓缩：将以上滤液浓缩至浓缩

6、：将以上滤液浓缩至l/5体积。体积。4.沉淀：将浓缩液加沉淀：将浓缩液加1倍量乙醇，然后静置过夜。过滤得倍量乙醇，然后静置过夜。过滤得沉沉淀物淀物，滤液再加，滤液再加3倍量乙醇，得沉淀物。倍量乙醇，得沉淀物。5.二次沉淀：将沉淀物置于搪瓷缸中，加约二次沉淀：将沉淀物置于搪瓷缸中，加约70倍量的倍量的水，搅拌均匀，在猛烈搅拌下，滴加氢氧化十六烷水，搅拌均匀，在猛烈搅拌下，滴加氢氧化十六烷基三甲基胺水溶液，逐步调基三甲基胺水溶液，逐步调PH至时产生大量沉淀，至时产生大量沉淀，离心，离心，沉淀沉淀用乙醇洗涤，收集沉淀。用乙醇洗涤，收集沉淀。6.除蛋白：沉淀用氯仿、正丁醇洗涤去蛋白，水层加除蛋白：沉淀

7、用氯仿、正丁醇洗涤去蛋白，水层加3倍量乙醇沉淀，收集沉淀。倍量乙醇沉淀，收集沉淀。7.洗涤：沉淀依次用甲醇、乙醚洗涤，收集沉淀。洗涤：沉淀依次用甲醇、乙醚洗涤，收集沉淀。8.干燥：将沉淀置真空干燥器干燥，即为香菇多糖干燥：将沉淀置真空干燥器干燥，即为香菇多糖。灵孢多糖灵孢多糖灵芝，又称万年蕈、灵芝草，为灵芝属真菌,有着悠久的药用历史。目前，有关灵芝活性元素的研究主要集在：灵芝多糖类、灵芝三萜类等成分上。灵芝多糖可抑制肿瘤细胞的无限、快速分裂能力，还具有提高机体免疫力，提高机体耐缺氧能力，降血糖降血脂作用。灵芝多糖产品：灵芝多糖产品：灵芝多糖片、灵芝复方糖浆等灵芝多糖片、灵芝复方糖浆等(主要用于

8、肿瘤辅主要用于肿瘤辅助治疗，慢性气管炎、高血压、神经衰弱、糖尿助治疗，慢性气管炎、高血压、神经衰弱、糖尿病、高血脂等病、高血脂等);检测方法检测方法(1)对照品溶液的制备取葡萄糖，加水制成的溶液。(2)供试品溶液的制备取本品，加水定容至200ml。(3)标准曲线的制备精密量取对照品溶液，和，加水定容至100ml。各精密量取，分别置具塞试管中，置冰浴中，分别加入蒽酮试剂，摇匀，各试管加完后浸入沸水浴中，加热1min后，加塞。自水浴重新沸腾起，开始计时，10min后取出，用自来水冷却，室温放置10min，立即在620nm分别测定吸光度，以测得的吸光度对相应的浓度计算回归方程，相关系数不得低于。(4

9、)含量测定（含多糖以葡萄糖计）精密量取供试品，照标准曲线制备项下自“分别置具试管中”起，依法同步操作，测定吸光度，由回归方程计算多糖含量。肝素的检测1.结构与性质肝素分子是有六糖或八糖重复单位组成的线形分子，含2-硫酸艾杜糖醛酸6-硫酸-N-硫酸氨基葡萄糖及葡萄糖醛酸等残基。由不同链长的许多组分组成。肝素的N-硫酸基对酸水解敏感，与氧化剂反应，能被降解成酸性产物。肝素呈弱酸性，某聚阴离子与各种阳离子反应生成盐，与碱性染料反应，对染料的光吸收有影响。2.效价的测定（1）天青A法含氨基碱性染料（天青A、甲苯胺蓝、天青）有一定最大吸收，结合了肝素后，则最大吸收向短波移动。使用天青A比色测定肝素效价。

10、标准曲线绘制：精密量取肝素标准液（）1ml2ml3ml4ml5ml各以蒸馏水补足到5ml，在各加巴以妥缓冲液（）1ml及0.1%西黄耆胶溶液1ml，0.018%天青A溶液1ml，摇匀后，于505nm处测吸光度。以效价单位为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。供试品测定：精密称取供试品适量，按估计效价，以蒸馏水配每ml含肝素单位。取供试品溶液5ml，按标准曲线方法测吸光度，差曲线计算效价。（2）色原底物法此法原理是基于肝素与抗凝酶（AT-）的复合物对Xa因子（FXa）或凝血酶有抑制作用。残余的FXa或凝血酶用某些色原底物测出，量与肝素呈负相关。鉴于肝素的抗FXa活性对抗血栓效应的重要性，美国药典把色原底物测定用于肝素的质量控制肝素+At-At-肝素At-肝素+FXa（过量）At-肝素FXa+FXa（残余）Bz-Ile-Glu-Arg-PNA+H2oBz-Ile-Glu-Arg-OH+PNA(S-222)底物S-222的C一端结合了对硝基苯胺（PNA），水解放出的游离PNA在波长405nm处吸光度很高，而本身无色的底物在此基本无吸收