《酶活力测定方法》PPT课件.ppt

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1、2 2酶活力测定法酶活力测定法 1 1）基本）基本原理原理：酶活力是指酶催化一定化学反应的能力。酶活力是指酶催化一定化学反应的能力。酶活力测定实质上是测定一个被酶所催化的化酶活力测定实质上是测定一个被酶所催化的化学反应速度。酶反应速度越快所表示的酶活力学反应速度。酶反应速度越快所表示的酶活力越高。越高。酶反应速度可以用单位时间反应底酶反应速度可以用单位时间反应底物的减少或产物的增加来表示。物的减少或产物的增加来表示。通常酶活力测定时，先制备通常酶活力测定时，先制备酶反应酶反应进程曲线进程曲线和和酶浓度曲线酶浓度曲线。通过酶反应速。通过酶反应速度的测定，求得酶的浓度或含量。度的测定，求得酶的浓度

2、或含量。酶反应进程曲线酶反应进程曲线 纵坐标为底物或产物的变化纵坐标为底物或产物的变化量，横坐标为反应时间，曲线斜率表示反应速量，横坐标为反应时间，曲线斜率表示反应速度。从酶反应进程曲线求得反应的初速度。度。从酶反应进程曲线求得反应的初速度。酶浓度曲线酶浓度曲线 纵坐标为反应速度，横坐标为酶纵坐标为反应速度，横坐标为酶量。通过酶浓度曲线检验反应测定系统是否适量。通过酶浓度曲线检验反应测定系统是否适宜。宜。酶活力测定的酶活力测定的要求：要求：测得的反应速度测得的反应速度必须和酶浓度有线性的比例关系，这必须和酶浓度有线性的比例关系，这也是检验酶反应和测定系统是否适宜、也是检验酶反应和测定系统是否适

3、宜、正确的标准。正确的标准。2 2）酶促反应的）酶促反应的条件条件及及影响因素影响因素 底物的浓度底物的浓度：一般选用底物的浓度：一般选用底物的浓度S=100KS=100Km m。pHpH：选用一个适宜的缓冲离子和离子强度、：选用一个适宜的缓冲离子和离子强度、适宜的适宜的pHpH值的缓冲系统来控制值的缓冲系统来控制pHpH。温度温度：酶反应的温度通常选用：酶反应的温度通常选用2525、3030或或 37 37，实验中温度变动应控制在，实验中温度变动应控制在0.10.1以内。以内。辅助因子辅助因子：有些酶需要金属离子，有些需要：有些酶需要金属离子，有些需要 相应的辅酶。相应的辅酶。空白和对照试验

4、空白和对照试验：空白试验：是指杂质反应和自发反应引空白试验：是指杂质反应和自发反应引起的变化量，它提供的是未知因素的影响。起的变化量，它提供的是未知因素的影响。空白值可以通过不加酶，或不加底物，或二空白值可以通过不加酶，或不加底物，或二者都加（酶预先经过失效处理）。者都加（酶预先经过失效处理）。对照试验：是指用纯酶或标准酶制剂测对照试验：是指用纯酶或标准酶制剂测得的结果，主要作为比较或标定的标准。得的结果，主要作为比较或标定的标准。3 3）测定方法：）测定方法：取样测定法：取样测定法：连续测定法连续测定法：在反应过程中对反应系统进：在反应过程中对反应系统进行直接连续检测。行直接连续检测。检测方

5、法：检测方法：紫外紫外-可见分光光度法可见分光光度法 旋光法旋光法荧光分光光度法荧光分光光度法 电化学测定法电化学测定法 酶偶联测定法酶偶联测定法 离子选择性电极测定法等。离子选择性电极测定法等。示例：胰蛋白酶效价测定示例：胰蛋白酶效价测定胰蛋白酶胰蛋白酶 肽键、酰氨键、酯键（碱性氨基酸）肽键、酰氨键、酯键（碱性氨基酸）水解速率：酯键水解速率：酯键酰氨键酰氨键肽键肽键供试品溶液：供试品溶液：50506060单位单位/ml/ml底物溶液：底物溶液：N-N-苯甲酰苯甲酰-L-L-精氨酸乙酯精氨酸乙酯 浓度：浓度：A A：.0585.0585N-N-苯甲酰苯甲酰-L-L-精氨酸乙酯精氨酸乙酯 N-N

6、-苯甲酰苯甲酰-L-L-精氨酸精氨酸 253nm253nm处的处的A A随酶促反应递增，根随酶促反应递增，根据酶活力单位定义计算酶活力。据酶活力单位定义计算酶活力。酶活性单位酶活性单位：在最适的条件下，每分钟能：在最适的条件下，每分钟能转化一个微摩尔底物的酶量定为一个活性转化一个微摩尔底物的酶量定为一个活性单位。单位。测定测定：空白：底物溶液空白：底物溶液 HCl HCl 每每30s A30s A的改变：，呈线性关系的的改变：，呈线性关系的时间不得少于时间不得少于3min3min。A A每分钟改变，相当于每分钟改变，相当于1 1个胰蛋白酶单个胰蛋白酶单位。位。供试液的供试液的A A每分钟改变每

7、分钟改变相当于的单位数为相当于的单位数为每每mgmg供试品中含胰蛋白酶单位数为供试品中含胰蛋白酶单位数为 重组人白细胞介素重组人白细胞介素 11 11的胰蛋白酶切肽的胰蛋白酶切肽图分析图分析 肽图分析是评价重组产品蛋白质结构及肽图分析是评价重组产品蛋白质结构及其生产工艺稳定性的重要方法其生产工艺稳定性的重要方法,目前常用的目前常用的方法有裂解方法有裂解-微量微量肽图法和胰蛋白酶切肽图法和胰蛋白酶切 肽图法肽图法。1 1。酶切条件。酶切条件 取取浓浓度度为为3 3-1-1的的样样品品0 0 4 4对对1%1%4 43 3充充分分透透析析,然然后后取取透透析析样样品品250250至至微微量量进进样

8、样瓶瓶,加加0 0 3 3-1-1处处理理的的胰胰蛋蛋白白酶酶1010混混匀匀,于于3737温温控控自自动动进进样样器器酶酶切切,每每8080进进样样一一针针,进进样样量量66,用用3232色色谱谱软软件件选选择择214214进进行行分分析析,直直至至 1111完完全全酶酶解解。按按此此方方法法摸摸索索最最佳佳酶酶切切时时间间,在在第第1414针针后后 1111已已被被完完全全酶酶切切,酶酶切切时时间间在在18182222范范围围内内肽肽图图图图谱谱基基本本一致一致,即确定最佳酶切条件为即确定最佳酶切条件为3737保温保温2020。2 2。系统测试。系统测试 系系统统测测试试标标准准物物质质进

9、进样样后后呈呈3 3个个峰峰,12,12次次重重复复进进样样3 3个个峰峰保保留留时时间间的的分分别别为为0.0.4%,0 4%,0.6%.6%和和0.0.8%,8%,峰峰面面积积的的分分别别为为0 0.7%,0.7%,0.8%.8%和和0 0.8%.8%。1111对对照照品品3737酶酶切切2020后后于于44温温控控自自动动进进样样器器连连续续进进样样5 5次次,结结果果见见图图1 1。5 5个个色色谱谱图图完完全全重重叠叠在在一一起起,所所产产生生2121个个峰峰的的保保留留时时间间、峰峰高高和和峰峰面面积积的的均均分分别别小小于于1 1.0%,5.0%,5.4%.4%和和9.9.8%,

10、8%,表表明明本本系系统统误误差差小小,重重复性好复性好,可用于可用于1111的肽图分析。的肽图分析。3 3批批 1111制制品品的的 图图谱谱完完全全一一致致,说说明明该该厂厂 1111的的生生产产工工艺艺是是稳稳定定的的;与与公公司司生生产产的的 1111对对照照品品比比较较有有2020个个峰峰与与对对照照品品一一致致,但但第第6 6 峰峰的的峰峰高高和和峰峰面面积积均均明明显显较较小小,且且在在第第9 9和和第第10 10 峰峰之之间间多多一一个个峰峰,说说明明该该厂厂 1111蛋蛋白白质质结结构构与与公公司司生生产的产的 11 11比较存在细小差别。比较存在细小差别。返 回练习与思考练习与思考1 1何何谓谓：生生化化药药物物、生生物物技技术术药药物物、基因工程药物和生物制品？基因工程药物和生物制品？2 2生生化化药药物物和和基基因因工工程程药药物物各各分分哪哪几种？几种？3 3与与化化学学合合成成药药物物的的分分析析相相比比，生生物药物的分析有何特点？物药物的分析有何特点？返 回