《基因工程工具酶》PPT课件.ppt

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1、基因工程工具酶生物与食品工程学院脱氧核糖核酸酶（DNase）n特征：特征：非特异性的随机水解双链或单链DNA 的内切核酸酶。n需要二价阳离子作为辅助因子n作用方式与辅助因子相关外切核酸酶n是一类能从DNA或RNA链的一端开始按顺序催化磷酸二酯键，产生单核苷酸的核酸酶。n5 3n3 5n两端切割限制性内切核酸酶n专一性地识别双链DNA上的特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开。n生理功能：保护n基因工程功能：剪刀甲基化酶n功能：功能：使核苷酸的碱基甲基化。n甲基化酶同限制性内切核酸酶有完全相同的识别序列。n可以用限制性内切核酸酶的名称来命名甲基化酶。限制性内切核酸酶的命名n生物属名的第一

2、个字母n生物种名的第一、二个字母n菌株代号中的一个字母n先后次序 罗马数字限制性内切核酸酶的识别序列n长度 6n二重互补对称 回文结构n可以通过电脑软件查找限制性内切核酸酶的识别序列限制性内切核酸酶切割特点n黏性末端n平末端n同尾酶限制性内切酶的一些特点n有些限制性内切核酸酶可以识别两种以上的核苷酸序列n同裂酶同裂酶 不同的酶有相同的识别序列nStarStar活性活性 在特定的条件下，在不是识别序列处切割DNA限制性内切核酸酶的活性n底物纯度n分子构型n侧面序列n偏爱位点 侧面序列对切割效率会有影响n甲基化限制性内切核酸酶反应系统n酶的用量n缓冲液n反应温度n（中文）限制性图谱nDNA分子上限

3、制性内切核酸酶识别序列的分布图。也称为物理图谱。n当一种DNA分子的核苷酸序列被完全测定后，便可以绘出DNA分子上每种限制性内切核酸酶的限制性图谱。限制性图谱n双酶切法n1.用一系列限制性内切核酸酶分别切割目的DNA分子。n2.确定任一点为一种酶的切割位点。n3.推断其它酶的切割位点。限制性图谱n逐步切割DNA片段法n核酸外切酶n电泳条带前移n推算DNA连接酶n催化DNA分子链的相邻3羟基与5磷酸基团形成磷酸二酯键。n分为 1.依赖ATP 2.依赖NAD+DNA连接酶nE.coli DNA连接酶n催化双链DNA片段互补黏性末端的连接，不能催化平末端链接。n最适反应温度30，但为了提高氢键的稳定

4、性，实际反应温度控制在415，适当延长反应时间。DNA连接酶nT4DNA连接酶n既可以连接黏性末端的连接，也可以用于平末端的连接。n依赖于ATP，反应温度控制在415,平末端需要在较高的温度下进行。DNA片段的连接方法n互补黏性末端n平末端黏性末端修饰成平末端平末端修饰成互补的黏性末端加连杆或衔接头逆转录酶n依赖RNA的DNA合成酶n用于体外cDNA的合成n构建cDNA文库，从中筛选特异的目的基因。末端脱氧核苷酸转移酶n功能：功能：将脱氧核苷酸分子一个一个的加到DNA片段的3羟基上，不依赖于模板，dNTP中的任何一种都可以作为反应的前体利用此性质，可以给平末端DNA片段的3羟基加上同聚物。碱性

5、磷酸酯酶n功能：功能：催化核酸分子脱掉5磷酸基。n避免在DNA重组时的自我连接。DNA聚合酶n功能：催化以DNA单链为模板，4种脱氧核糖核苷酸为底物，合成与模板链互补的DNA新链。n5-3 方向的聚合酶活性n3-5外切核酸酶活性RNA聚合酶n依赖DNA的RNA聚合酶n这些RNA聚合酶只能转录含有它们各自特异启动子序列的DNA，转录出相应的RNA。溶菌酶n功能：水解细菌细胞壁肽聚糖支架。n以鸡蛋清中含量最多3.43.5%蛋白酶 Kn高活性，非特异性的蛋白水解酶，在很宽的PH范围内（）有活性，最适PH为7.512对热稳定。纤维素酶n将纤维素水解成纤维二糖和葡萄糖的一组酶作业：n1.限制性内切核酸酶 和DNA连接酶的催化功能n2.限制性内切核酸酶切割DNA后可能会出现什么样的DNA片段末端n3.DNA连接酶有那些连接方法Thank You