《蛋白质含量测定法》PPT课件.ppt

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1、蛋白质含量测定法蛋白质含量测定法考马斯亮兰法（考马斯亮兰法（Bradford法）法）n n实验原理n n考马斯亮蓝G-250染料+碱性芳香族氨基酸n n在磷酸的作用下，最大吸收为595nm(兰色）器材与试剂器材与试剂n n722型和753型可见光分光光度计n n漩涡混合器n n试管16支n n标准蛋白质溶液，用牛血清清蛋白（标准蛋白质溶液，用牛血清清蛋白（BSABSA），），配制成和。配制成和。n n考马斯亮兰考马斯亮兰G-250G-250染料试剂：称染料试剂：称100mg100mg考马考马斯亮兰，溶于斯亮兰，溶于50ml 95%50ml 95%的乙醇后，再加入的乙醇后，再加入120ml 85

2、%120ml 85%的磷酸，用水稀释至的磷酸，用水稀释至1 1升。升。实验方法实验方法 n n标准方法标准方法标准方法标准方法n n取取1010支试管，分别编号后按支试管，分别编号后按 表表1-1 1-1 剂量依剂量依次加入标准蛋白（或未知蛋白）、去离子次加入标准蛋白（或未知蛋白）、去离子水和考马斯亮兰染料。每支试管加完后，水和考马斯亮兰染料。每支试管加完后，立即在漩涡混合器上混合。立即在漩涡混合器上混合。n n加完染料加完染料20min20min后，使用后，使用722722分光光度计分光光度计（灵敏度（灵敏度4 4），塑料比色皿，在），塑料比色皿，在595nm595nm处测处测量吸光度量吸光

3、度A595A595。n n用标准蛋白浓度（用标准蛋白浓度（mg/mlmg/ml）为横坐标，用）为横坐标，用A595A595为纵坐标，进行直线拟合，得到标准为纵坐标，进行直线拟合，得到标准曲线。根据测得的未知样品的曲线。根据测得的未知样品的A595A595，查表，查表即可求得未知样品的蛋白质含量。即可求得未知样品的蛋白质含量。n n微量法微量法n n取10支试管，分别编号后按 表1-3 剂量依次加入稀释的标准蛋白（或未知蛋白）、去离子水和考马斯亮兰染料。其他步骤同上，不过使用753分光光度计（狭缝4）。n nSDS干扰实验干扰实验n n取取5 5支试管，分别编号后按表支试管，分别编号后按表1-5

4、1-5剂量依次剂量依次加入标准蛋白、加入标准蛋白、SDSSDS、去离子水和考马斯、去离子水和考马斯亮兰染料。每支试管加完后，立即在漩涡亮兰染料。每支试管加完后，立即在漩涡混合器上混合。混合器上混合。n n加完染料加完染料20min20min后，使用后，使用753753分光光度计分光光度计（狭缝（狭缝4 4），塑料比色皿，在），塑料比色皿，在595nm595nm处测量处测量吸光度吸光度A595A595。实验数据与结果分析实验数据与结果分析 n n标准方法的数据和图标准方法的数据和图表1 考马斯亮兰标准法实验表格管号12345678910标准蛋白质（1.03mg/ml）00.010.020.040

5、.060.080.10未知蛋白质（约0.5mg/ml）0.040.080.10蒸馏水0.10.090.080.060.040.0200.060.020考马斯亮兰G-250试剂3.03.03.03.03.03.03.03.03.03.0对应的吸光度A5950.2000.3110.3620.4830.6240.7520.8450.3870.5010.572根据表1，以A595为纵坐标，标准蛋白质量/（g）为横坐标，作图1。图1 考马斯亮兰标准法图图1 考马斯亮兰标准法考马斯亮兰标准法微量法的数据和图微量法的数据和图n n表表2 2 考马斯亮兰微量法实验表格考马斯亮兰微量法实验表格n n管号标准蛋白

6、质（）未知蛋白质（约）蒸馏水管号标准蛋白质（）未知蛋白质（约）蒸馏水考马斯亮兰考马斯亮兰G-250G-250试剂对应的吸光度试剂对应的吸光度n n根据表根据表2 2，以，以A595A595为纵坐标，标准蛋白质量为纵坐标，标准蛋白质量/（gg）为横坐标，作图）为横坐标，作图2 2。图图2 考马斯亮兰微量法考马斯亮兰微量法SDS干扰数据和图干扰数据和图n n表3 考马斯亮兰SDS干扰实验表格n n管号123456标准蛋白质（）蒸馏水考马斯亮兰G-250试剂对应的吸光度n n根据表3，以A595为纵坐标，SDS浓度为横坐标，作图3。图3 考马斯亮兰SDS干扰实验n n由上图可以看出，十二烷基硫酸钠(

7、SDS)对考马斯亮兰法测蛋白质含量有干扰，同是的标准蛋白与考马斯亮兰，但随着SDS浓度的增加，其混合液的595nm处的吸收峰逐渐降低，而后有一小段回升，最后趋于渐近线。紫外吸收法紫外吸收法n n 实验原理实验原理实验原理实验原理 n n280nm280nm的光吸收法的光吸收法：蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和：蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在色氨酸在280nm280nm处有最大吸收。处有最大吸收。n n215nm215nm与与225nm225nm的吸收差法的吸收差法：蛋白质因为含量低而不能使：蛋白质因为含量低而不能使用用280nm280nm的光吸收测定时，可用的光吸收测定时，可用215

8、nm215nm与与225nm225nm吸收值之吸收值之差，通过标准曲线法来测定蛋白质稀溶液的浓度。差，通过标准曲线法来测定蛋白质稀溶液的浓度。n n肽键测定法肽键测定法：蛋白质溶液在：蛋白质溶液在238238处的光吸收强弱，与肽键处的光吸收强弱，与肽键的多少成正比。可以测的多少成正比。可以测238nm238nm处吸收值，通过标准曲线法处吸收值，通过标准曲线法来测定蛋白质稀溶液的浓度。来测定蛋白质稀溶液的浓度。器材与试剂器材与试剂n n（一）器材n n1SPECORD200分光光度计n n2漩涡混合器n n3试管12支n n（二）试剂n n标准蛋白质溶液，用牛血清清蛋白（BSA），配制成。实验数

9、据与结果分析实验数据与结果分析n n（一）紫外（一）紫外280nm吸收法数据和图吸收法数据和图n n表4 紫外280nm光吸收法n n管号123456BSA(1.03mg/ml)体积浓度（mg/ml）根据表4，以A280为纵坐标，SBA浓度为横坐标，作图4。图4 紫外280nm光吸收法n n根据直线拟和方程yx求解当标准蛋白（牛血清清蛋白）n n与文献值比较接近。n n紫外紫外紫外紫外215nm215nm与与与与225nm225nm的吸收差法的数据和图的吸收差法的数据和图的吸收差法的数据和图的吸收差法的数据和图表表表表5 5 紫外紫外紫外紫外215nm215nm与与与与225nm225nm的吸

10、收差法的吸收差法的吸收差法的吸收差法n n管号管号管号管号123456123456未知未知未知未知BSA(1.03mg/ml)BSA(1.03mg/ml)体积浓体积浓体积浓体积浓度吸收差度吸收差度吸收差度吸收差n n根据表根据表根据表根据表5 5，以吸收差，以吸收差，以吸收差，以吸收差为纵坐标，蛋白质浓度为纵坐标，蛋白质浓度为纵坐标，蛋白质浓度为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，作图为横坐标，作图为横坐标，作图为横坐标，作图5 5。图5 215nm与225nm吸收差法肽键测定法肽键测定法n n表6 肽键吸收法n n管号123456未知BSA(1.03mg/ml)体积浓度 n n根据表6，以A238为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，作图4。图6 肽键测定法