《醋酸纤维薄膜电泳》PPT课件.ppt

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1、实验五实验五 醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白质1一、目的一、目的 掌握醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白的原理和掌握醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白的原理和掌握醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白的原理和掌握醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白的原理和 方法方法方法方法二、原理二、原理uu血清中含有多种蛋白质，其等电点均低于血清中含有多种蛋白质，其等电点均低于血清中含有多种蛋白质，其等电点均低于血清中含有多种蛋白质，其等电点均低于pH7.pH7.pH7.pH7.0 0 0 0uu在在在在的缓冲液中，它们电离出负离子，带正电荷，的缓冲液中，它们电离出负离子，带正电荷，的缓冲液中，它

2、们电离出负离子，带正电荷，的缓冲液中，它们电离出负离子，带正电荷，在电场中向正极移动在电场中向正极移动在电场中向正极移动在电场中向正极移动uu各种蛋白质的等电点不同，在同一各种蛋白质的等电点不同，在同一各种蛋白质的等电点不同，在同一各种蛋白质的等电点不同，在同一pHpHpHpH值下所带值下所带值下所带值下所带电荷量不同电荷量不同电荷量不同电荷量不同uu分子的大小不同，因此在电场中的泳动速度不分子的大小不同，因此在电场中的泳动速度不分子的大小不同，因此在电场中的泳动速度不分子的大小不同，因此在电场中的泳动速度不同，这样可将各种血清蛋白质分离同，这样可将各种血清蛋白质分离同，这样可将各种血清蛋白质

3、分离同，这样可将各种血清蛋白质分离开开开开 2三、三、实验材料及设备实验材料及设备1 1 1 1、样品：新鲜牛血清、样品：新鲜牛血清、样品：新鲜牛血清、样品：新鲜牛血清（无溶血）（无溶血）（无溶血）（无溶血）2 2 2 2、仪器：、仪器：、仪器：、仪器：DYY-DYY-DYY-DYY-2 2 2 2型常压电泳型常压电泳型常压电泳型常压电泳仪仪仪仪、卧式电泳、卧式电泳、卧式电泳、卧式电泳槽槽槽槽3 3 3 3、器材：、器材：、器材：、器材：醋酸纤维薄膜醋酸纤维薄膜醋酸纤维薄膜醋酸纤维薄膜(8(8(8(8 2cm)2cm)2cm)2cm)；点样器；点样器；点样器；点样器；培养皿；培养皿；培养皿；培

4、养皿；滤纸；滤纸；滤纸；滤纸；直尺、直尺、直尺、直尺、铅笔；镊子；剪刀；铅笔；镊子；剪刀；铅笔；镊子；剪刀；铅笔；镊子；剪刀；和铅笔和铅笔和铅笔和铅笔4 4 4 4、试剂：巴比妥、试剂：巴比妥、试剂：巴比妥、试剂：巴比妥-巴比妥钠缓冲液巴比妥钠缓冲液巴比妥钠缓冲液巴比妥钠缓冲液 漂洗液漂洗液漂洗液漂洗液 染色液染色液染色液染色液 3四、操作步骤四、操作步骤1 1 1 1、膜的润湿和选择、膜的润湿和选择、膜的润湿和选择、膜的润湿和选择uu迎着光辨别无和有光泽面，用镊子将薄膜无光泽迎着光辨别无和有光泽面，用镊子将薄膜无光泽迎着光辨别无和有光泽面，用镊子将薄膜无光泽迎着光辨别无和有光泽面，用镊子将薄

5、膜无光泽面向下，置巴比妥缓冲液中，自然浸泡面向下，置巴比妥缓冲液中，自然浸泡面向下，置巴比妥缓冲液中，自然浸泡面向下，置巴比妥缓冲液中，自然浸泡30min30min30min30minuu选择选择选择选择薄膜颜色一致而无白色斑点的薄膜颜色一致而无白色斑点的薄膜颜色一致而无白色斑点的薄膜颜色一致而无白色斑点的膜膜膜膜 2 2 2 2、制作电桥、制作电桥、制作电桥、制作电桥uu将电泳槽置于平台上，将缓冲液倒入电泳槽内，将电泳槽置于平台上，将缓冲液倒入电泳槽内，将电泳槽置于平台上，将缓冲液倒入电泳槽内，将电泳槽置于平台上，将缓冲液倒入电泳槽内，使两槽缓冲液平衡至同一水平面使两槽缓冲液平衡至同一水平面

6、使两槽缓冲液平衡至同一水平面使两槽缓冲液平衡至同一水平面 uu于两电极槽各放入于两电极槽各放入于两电极槽各放入于两电极槽各放入2 2 2 2层纱布，一端浸人缓冲液中，层纱布，一端浸人缓冲液中，层纱布，一端浸人缓冲液中，层纱布，一端浸人缓冲液中，另一端贴附在电泳槽支架另一端贴附在电泳槽支架另一端贴附在电泳槽支架另一端贴附在电泳槽支架uu当纱布全部润湿后，用玻璃棒轻轻挤压在膜支架当纱布全部润湿后，用玻璃棒轻轻挤压在膜支架当纱布全部润湿后，用玻璃棒轻轻挤压在膜支架当纱布全部润湿后，用玻璃棒轻轻挤压在膜支架上的纱布以驱赶气泡上的纱布以驱赶气泡上的纱布以驱赶气泡上的纱布以驱赶气泡 4四、操作步骤四、操作

7、步骤3 3 3 3、点样、点样、点样、点样 uu点样模板的制点样模板的制点样模板的制点样模板的制作作作作 uu取出浸透的薄膜，夹在两层滤纸内吸干多余的取出浸透的薄膜，夹在两层滤纸内吸干多余的取出浸透的薄膜，夹在两层滤纸内吸干多余的取出浸透的薄膜，夹在两层滤纸内吸干多余的缓冲液，缓冲液，缓冲液，缓冲液，无光面朝上无光面朝上无光面朝上无光面朝上放在点样模板上放在点样模板上放在点样模板上放在点样模板上uu在点样器上均匀地沾上血清，将点样器轻轻地在点样器上均匀地沾上血清，将点样器轻轻地在点样器上均匀地沾上血清，将点样器轻轻地在点样器上均匀地沾上血清，将点样器轻轻地印在点样区印在点样区印在点样区印在点样

8、区内内内内 4 4 4 4、电泳、电泳、电泳、电泳uu将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上，另一端平贴在阳极端支架桥上，另一端平贴在阳极端支架桥上，另一端平贴在阳极端支架桥上，另一端平贴在阳极端支架上上上上uu连接好电泳仪，连接好电泳仪，连接好电泳仪，连接好电泳仪，接通电源，调节电压为接通电源，调节电压为接通电源，调节电压为接通电源，调节电压为100V100V100V100V，电流为电流为电流为电流为0.6 mA2n0.6 mA2n0.6 mA2n0.6 mA2n，电

9、泳，电泳，电泳，电泳60min60min60min60min5四、操作步骤四、操作步骤 5 5 5 5、染色与漂洗脱色、染色与漂洗脱色、染色与漂洗脱色、染色与漂洗脱色uu染色染色染色染色:电泳完毕后将膜条取下并放在染色液中浸电泳完毕后将膜条取下并放在染色液中浸电泳完毕后将膜条取下并放在染色液中浸电泳完毕后将膜条取下并放在染色液中浸泡泡泡泡10min10min10min10minuu漂洗脱色漂洗脱色漂洗脱色漂洗脱色:将膜条从染色液中取出后，移置到漂将膜条从染色液中取出后，移置到漂将膜条从染色液中取出后，移置到漂将膜条从染色液中取出后，移置到漂洗液中，洗液中，洗液中，洗液中，反复漂洗数次，直至背景

10、漂净为止反复漂洗数次，直至背景漂净为止反复漂洗数次，直至背景漂净为止反复漂洗数次，直至背景漂净为止，可可可可得到色带清晰的电泳图得到色带清晰的电泳图得到色带清晰的电泳图得到色带清晰的电泳图谱谱谱谱五、五、记录和分析实验结果记录和分析实验结果 uu把电泳图谱画在实验报告上把电泳图谱画在实验报告上把电泳图谱画在实验报告上把电泳图谱画在实验报告上uu并指出每条区带的种类并指出每条区带的种类并指出每条区带的种类并指出每条区带的种类 6六、注意事项六、注意事项1 1 1 1、薄膜的浸润与选膜是电泳成败的关键之一、薄膜的浸润与选膜是电泳成败的关键之一、薄膜的浸润与选膜是电泳成败的关键之一、薄膜的浸润与选膜

11、是电泳成败的关键之一2 2 2 2、点样时，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸、点样时，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸、点样时，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸、点样时，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸 去，吸水量以不干不湿为宜去，吸水量以不干不湿为宜去，吸水量以不干不湿为宜去，吸水量以不干不湿为宜3 3 3 3、点样时，动作要轻、稳，用力不能太大，以免、点样时，动作要轻、稳，用力不能太大，以免、点样时，动作要轻、稳，用力不能太大，以免、点样时，动作要轻、稳，用力不能太大，以免 损坏膜片或印出凹陷影响电泳区带分离效果损坏膜片或印出凹陷影响电泳区带分离效果损坏膜片或印出凹陷影响电泳区带分离效果损

12、坏膜片或印出凹陷影响电泳区带分离效果4 4 4 4、点样应点在薄膜的无光面上，点样量要适量、点样应点在薄膜的无光面上，点样量要适量、点样应点在薄膜的无光面上，点样量要适量、点样应点在薄膜的无光面上，点样量要适量5 5 5 5、电泳时将薄膜的点样端置于负极端，且点样面、电泳时将薄膜的点样端置于负极端，且点样面、电泳时将薄膜的点样端置于负极端，且点样面、电泳时将薄膜的点样端置于负极端，且点样面 向下向下向下向下6 6 6 6、控制染色时间、控制染色时间、控制染色时间、控制染色时间7 7 7 7、过程为防止指纹污染，应戴手套、过程为防止指纹污染，应戴手套、过程为防止指纹污染，应戴手套、过程为防止指纹

13、污染，应戴手套7七、七、思考题思考题 1 1、电泳图谱清晰的关键是什么？如何正确操作？电泳图谱清晰的关键是什么？如何正确操作？2 2、电泳时，点样端置于电场的正极还是负极？、电泳时，点样端置于电场的正极还是负极？为什么？为什么？尿中尿中17-17-羟皮质类固醇的测定羟皮质类固醇的测定89 相关知识相关知识1 1 1 1、电泳、电泳、电泳、电泳 uu带电颗粒在电场作用下向着与其电性相反的电极带电颗粒在电场作用下向着与其电性相反的电极带电颗粒在电场作用下向着与其电性相反的电极带电颗粒在电场作用下向着与其电性相反的电极移动，称为电泳移动，称为电泳移动，称为电泳移动，称为电泳(electrophore

14、sis(electrophoresis(electrophoresis(electrophoresis，EP)EP)EP)EP)uu电泳电泳电泳电泳是对混合物中带电离子的分离和鉴定技术是对混合物中带电离子的分离和鉴定技术是对混合物中带电离子的分离和鉴定技术是对混合物中带电离子的分离和鉴定技术2 2 2 2、基本原理、基本原理、基本原理、基本原理uu电荷的来源电荷的来源电荷的来源电荷的来源：由于本身的解离作用或表面上吸附由于本身的解离作用或表面上吸附由于本身的解离作用或表面上吸附由于本身的解离作用或表面上吸附其它带电质点，在电场中会向一定电极移动其它带电质点，在电场中会向一定电极移动其它带电质点

15、，在电场中会向一定电极移动其它带电质点，在电场中会向一定电极移动 uu迁移率迁移率迁移率迁移率：带电颗粒在单位电场强度下的电泳速带电颗粒在单位电场强度下的电泳速带电颗粒在单位电场强度下的电泳速带电颗粒在单位电场强度下的电泳速度度度度vv其泳动速度与所分离的物质所带的净电荷的其泳动速度与所分离的物质所带的净电荷的其泳动速度与所分离的物质所带的净电荷的其泳动速度与所分离的物质所带的净电荷的数量、颗粒的大小和形状有关数量、颗粒的大小和形状有关数量、颗粒的大小和形状有关数量、颗粒的大小和形状有关 10103、影响电泳迁移率的因素、影响电泳迁移率的因素t电场强度电场强度t溶液溶液pHpH t溶液的离子强

16、度溶液的离子强度 t温度温度t电渗电渗 t支持物支持物 11电泳的分类电泳的分类 t t按原理分按原理分l l区带电泳：在电泳过程中，不同离子成分在区带电泳：在电泳过程中，不同离子成分在区带电泳：在电泳过程中，不同离子成分在区带电泳：在电泳过程中，不同离子成分在均一的缓冲液体系分离成独立的区带均一的缓冲液体系分离成独立的区带均一的缓冲液体系分离成独立的区带均一的缓冲液体系分离成独立的区带 l l移界电泳：是在移界电泳：是在移界电泳：是在移界电泳：是在U U U U型管中进行的电泳型管中进行的电泳型管中进行的电泳型管中进行的电泳 l l等速电泳：等速电泳：等速电泳：等速电泳：当电泳达到平衡后，各

17、区带相随当电泳达到平衡后，各区带相随当电泳达到平衡后，各区带相随当电泳达到平衡后，各区带相随分出清晰的界面，并以等速移动分出清晰的界面，并以等速移动分出清晰的界面，并以等速移动分出清晰的界面，并以等速移动l l等点聚焦：由于不同等电点的两性电解质载等点聚焦：由于不同等电点的两性电解质载等点聚焦：由于不同等电点的两性电解质载等点聚焦：由于不同等电点的两性电解质载体在电场中，自动形成体在电场中，自动形成体在电场中，自动形成体在电场中，自动形成pHpHpHpH梯度，使被分离物梯度，使被分离物梯度，使被分离物梯度，使被分离物移动到各自等电点的移动到各自等电点的移动到各自等电点的移动到各自等电点的pHp

18、HpHpH处聚集成很窄的区带处聚集成很窄的区带处聚集成很窄的区带处聚集成很窄的区带 12电泳的分类电泳的分类 t t按有无支持物分按有无支持物分 l l自电泳：在溶液中进行的一种电泳技术自电泳：在溶液中进行的一种电泳技术自电泳：在溶液中进行的一种电泳技术自电泳：在溶液中进行的一种电泳技术l l区带电泳：有支持物的电泳区带电泳：有支持物的电泳区带电泳：有支持物的电泳区带电泳：有支持物的电泳 t t纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳、纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳、纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳、纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶

19、电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳t t圆盘电由泳、平板圆盘电由泳、平板圆盘电由泳、平板圆盘电由泳、平板(垂直、水平垂直、水平垂直、水平垂直、水平)电泳、柱电泳、柱电泳、柱电泳、柱电泳电泳电泳电泳 13什么是醋酸纤维素薄膜什么是醋酸纤维素薄膜t t醋酸纤维是纤维素的醋酸酯，由纤维素的羟基醋酸纤维是纤维素的醋酸酯，由纤维素的羟基醋酸纤维是纤维素的醋酸酯，由纤维素的羟基醋酸纤维是纤维素的醋酸酯，由纤维素的羟基经乙酰化而成经乙酰化而成经乙酰化而成经乙酰化而成 t t厚度约以厚度约以厚度约以厚度约以0.1-0.15mm 0.1-0.15mm 0.1-0.15mm 0.1-0.15mm 什么是醋酸纤维素薄膜电泳什么

20、是醋酸纤维素薄膜电泳 t t以醋酸纤维素薄膜为支持物的电泳以醋酸纤维素薄膜为支持物的电泳以醋酸纤维素薄膜为支持物的电泳以醋酸纤维素薄膜为支持物的电泳 14醋酸纤维素薄膜电泳的特点醋酸纤维素薄膜电泳的特点l l吸附作用小，分离效果好吸附作用小，分离效果好吸附作用小，分离效果好吸附作用小，分离效果好 l l快速省时快速省时快速省时快速省时 l l灵敏度高，样品用量少灵敏度高，样品用量少灵敏度高，样品用量少灵敏度高，样品用量少l l应用面广应用面广应用面广应用面广l l易保存，易定易保存，易定易保存，易定易保存，易定量量量量15 16产品名称：双稳定时电泳产品名称：双稳定时电泳仪仪产品型号：产品型号

21、：DYY-6CDYY-6C型型5-600V 4-400mA 240W 17卧式电泳卧式电泳卧式电泳卧式电泳槽槽槽槽 18醋酸纤维薄膜电泳装置示意醋酸纤维薄膜电泳装置示意图图1、滤纸桥；2、电泳槽；3、醋酸纤维素薄膜；4、电泳槽膜支架；5、电极室中央隔板 19醋酸纤维素薄膜规格及点样位置示意醋酸纤维素薄膜规格及点样位置示意图图（虚线处为点样位置）（虚线处为点样位置）（虚线处为点样位置）（虚线处为点样位置）20血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳图谱示意血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳图谱示意图图 1、清蛋白，2、1球蛋白 3、2球蛋白 4、球蛋白 5、球蛋白 6、为点样原点 2122232425点样模板的制点样模板的制作作 2627优点优点l微量微量l快速快速l简便简便l分离清晰分离清晰l对样品无吸附现象对样品无吸附现象 应用应用广泛用于血清蛋白、糖蛋白、脂蛋白、血红蛋广泛用于血清蛋白、糖蛋白、脂蛋白、血红蛋白、酶的分离和免疫电泳等方白、酶的分离和免疫电泳等方面面 28血清中各种蛋白质的等电点及相对分子质血清中各种蛋白质的等电点及相对分子质量量 蛋白质名称 等电点（pI）相对分子质量/Mr 白蛋白1-球蛋白2-球蛋白-球蛋白-球蛋白4.885.065.065.126.85-7.3069 000200 000300 00090 000-150 000156 000-300 000293031