《分子流行病学全套》PPT课件.ppt

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1、分子流行病学分子流行病学MolecularEpidemiology 1 第一第一节 概述概述第二第二节 主要研究内容主要研究内容第三第三节 研究研究实例例2分子流行病学产生的背景分子流行病学产生的背景 疾病防治使流行病学遇到了一些新的挑疾病防治使流行病学遇到了一些新的挑战 传染病防治染病防治发现病原体耐病原体耐药性和性和变异异(流感疫苗流感疫苗)病原生物的多病原生物的多样性性(H5N1)慢性非慢性非传染病染病复复杂性状疾病的病因学性状疾病的病因学问题:基因基因-环境交互作用境交互作用3分子生物学理分子生物学理论和技和技术的的飞速速发展展1953-DiscoveryofDNAdoubleheli

2、x(Crick&Watson)1960s-DNAtranscriptionmechanism1972-RecombinantDNAtechnology1985-PCR(KaryMullis)1990s-HumanGenomeProject2000s-HumanHaplotypeProject4人人类基因基因组计划划1990年启年启动，2003年年发表完整的基因序列表完整的基因序列图5人人类单倍型倍型图谱计划划 reference samples:4 world populationsNigeria30 sets of triosJapan 45 unrelated individuals Ch

3、ina45 unrelated individuals U.S.30 sets of trios SNPs:computational candidates where both alleles were seen in multiple chromosomes genotypes:high-accuracy assays from various platforms;fast public data release http:/6分子流行病学的发展历程分子流行病学的发展历程国外：国外：1972年年-提出提出“流感分子流行病学流感分子流行病学”1993年年：美美国国Schulte出出版版了了世

4、世界界上上第第一一本本分分子子流流行行病病学学专著著分分子子流流行行病病学学-原原理理和和实践践(MolecularEpidemiology:PrinciplesandPractice)。1996年国年国际流行病学学流行病学学术会会议：狭狭义分子流行病学是分子流行病学是测量量作作为暴露或效暴露或效应的生物的生物标志志信息大分子：信息大分子：DNA、RNA和蛋白和蛋白质。从。从广广义上上包括任何包括任何实验的、生化的的、生化的测量。量。7NumbersofPaperswithSubjectWords“MolecularEpidemiology”onMedline2008,morethan2000

5、onPubMed!8国内：国内：1985年开始年开始,将分子生物学研究中一些技将分子生物学研究中一些技术应用于流行病中用于流行病中疾病疾病诊断以及追踪断以及追踪传染源的染源的调查研究。研究。1990年后年后在流行病学教材中正式列入分子流行病学一章。在流行病学教材中正式列入分子流行病学一章。从从1992年第年第4期起期起,中中华流行病学流行病学杂志志连续7期期发表文表文章，介章，介绍分子流行病学的分子流行病学的产生、定生、定义、研究内容、研究手、研究内容、研究手段及其段及其应用。用。9分子流行病学定义分子流行病学定义分分子子流流行行病病学学是是应用用先先进的的实验技技术测量量生生物物学学标志志，

6、结合合流流行行病病学学现场研研究究方方法法，从从分分子子水水平平阐明明疾疾病病的的病病因因及及其其相相关关的的致致病病过程程，并并提提出出与与评价价相相应防制措施防制措施的科学。的科学。(徐德忠，徐德忠，1998年年)分分子子流流行行病病学学是是阐明明疾疾病病和和健健康康状状态相相关关生生物物标志志（或或分分子子事事件件）在在人人群群和和生生物物群群体体中中的的分分布布及及其其影影响响因因素素，并并研研究究防防制制疾疾病病、促促进健健康康的的策策略略与与措措施施的的科学科学。(段广才，段广才，1999年年)10 分子流行病学是流行病学的一个分支分子流行病学是流行病学的一个分支(分子生物学？群体

7、分子生物学？群体遗传学？学？)分子流行病学的主要研究内容是各种生物分子流行病学的主要研究内容是各种生物标志物及相关志物及相关过程程分子流行病学的研究方法是随着分子生物学的分子流行病学的研究方法是随着分子生物学的进展不断更展不断更新的新的几个要点：几个要点：11 特点：特点：与与传统流行病学不同流行病学不同与分子生物学不同与分子生物学不同与与群体群体遗传学学不同不同宏宏观与微与微观相相结合的人群研究！合的人群研究！12暴露暴露疾病疾病？前瞻性研究前瞻性研究回回顾性研究性研究传统流行病学与分子流行病学的关系（流行病学与分子流行病学的关系（EDC模型）模型）（Schulte,1993）暴露暴露疾病疾

8、病13 研究内容研究内容生物生物标志探志探讨暴露暴露测量量(E,ID,BED)效效应测量量(EBE,ASF,CD,PS)易感性易感性测量量(DNA,RNA,Protein,Phenotype)14生物生物标志的概念志的概念生物生物标志志(biologicalmarkers,biomarkers)是指能代表生是指能代表生物物结构和功能的构和功能的可可识别物物质(Phenotype,可可测量量)。分子生物分子生物标志物志物(molecularbiomarkers)直接反映外来理直接反映外来理化因素与化因素与细胞靶分子胞靶分子,特特别是生物大分子如核酸和蛋白是生物大分子如核酸和蛋白质的相互作用及其后

9、果的相互作用及其后果,是生物是生物标志的主要部分。志的主要部分。生物标志生物标志15生物生物标志物的种志物的种类暴露暴露标志（志（exposuremarker,ME）与疾病或健康状与疾病或健康状态有关有关的暴露因素的生物的暴露因素的生物标志，称志，称为暴露暴露标志。志。外暴露外暴露标志志:暴露因素暴露因素进入机体之前的入机体之前的标志和志和剂量，如量，如病毒、病毒、细菌、吸烟烟菌、吸烟烟雾等。等。内暴露内暴露标志：志：暴露因素暴露因素进入机体之后的入机体之后的标志。志。16 1.体内体内剂量量标志（志（ID）：）：外源性物外源性物质于暴露后在体于暴露后在体内可内可测量到的量到的剂量量标志，表示

10、被人体吸收的外源志，表示被人体吸收的外源性物性物质（性（性质未改未改变的或其代的或其代谢产物）的数量。物）的数量。q吸烟吸烟-血或尿中的烟草代血或尿中的烟草代谢产物可的宁物可的宁浓度度q多多环芳芳烃-尿中的尿中的1-羟基芘水平基芘水平q饮食暴露食暴露-黄曲霉毒素黄曲霉毒素B1(AFB1)和尿中和尿中N-亚硝基化合硝基化合物的物的浓度度q工作暴露和工作暴露和环境境污染染-血清或脂肪血清或脂肪组织中的中的杀虫虫剂DDT、多、多氯联苯苯PCBs、二氧、二氧杂芑芑环氧化物含量氧化物含量172.生物有效生物有效剂量量标志（志（BED）：）：表示已与靶表示已与靶组织细胞内胞内DNA或蛋白或蛋白质相互作用的

11、外源性物相互作用的外源性物质或其反或其反应产物的含量。它是反映靶物的含量。它是反映靶细胞分子内接触胞分子内接触剂量量的生物的生物标志物志物,主要包括主要包括蛋白蛋白质加合物加合物(Proteinadduct)、DNA加合物加合物(DNAadduct)。18生物有效生物有效剂量量标志志DNA加合物加合物 苯并（苯并（a）芘）芘 白白细胞胞生物学生物学标志志环境暴露物境暴露物质生物材料生物材料蛋白蛋白质加合物加合物（血（血红蛋白）蛋白）环氧乙氧乙烯红细胞胞19效效应标志志（effectmarker,MEF）机机体体暴暴露露后后产生生功功能能性性或或结构构性性的的生生物物标志，称志，称为效效应标志。

12、志。生生物物学学反反应标志志（BR）:反反映映了了由由于于结合合到到靶靶细胞胞的的外外源源性性物物质的的持持续作作用用，进一一步步引引起起细胞胞与与组织的的生生物物学学或或生生化化学学的的变化化。这些些变化化主主要要发生生在在细胞胞特特定定部部位位，尤尤其其在在基基因因的的某某些些特特定定序序列列；这些些变化化可可引起机体某些引起机体某些不可逆不可逆转的生物学效的生物学效应。疾病疾病标志（志（MD）健康状健康状态标志（志（MH）20生物学反生物学反应标志志生物学标志生物学标志环境暴露物质环境暴露物质生物材料生物材料染色体染色体诱变化学物诱变化学物畸变畸变苯并（苯并（a）芘）芘白细胞白细胞姊妹染

13、色体单体交换姊妹染色体单体交换苯并（苯并（a）芘）芘白细胞白细胞微核（微核（micronuci）苯并（苯并（a）芘）芘白细胞白细胞癌基因激活癌基因激活苯并（苯并（a）芘）芘组织组织原嘌呤比例升高原嘌呤比例升高铅铅红细胞红细胞乙酰胆碱脂酶降低乙酰胆碱脂酶降低有机磷杀虫剂有机磷杀虫剂血浆血浆21亚临床（早期）疾病的生物学床（早期）疾病的生物学标志志血清甲胎蛋白血清甲胎蛋白肝癌、肝癌、肠道疾病、胎儿神道疾病、胎儿神经管缺失管缺失癌胚抗原癌胚抗原胃胃肠道癌、其它胃道癌、其它胃肠道疾病道疾病肿瘤特异性抗原瘤特异性抗原各种癌症各种癌症生物学生物学标志志疾病疾病血清谷草血清谷草转氨氨酶心肌梗塞心肌梗塞22易

14、感性易感性标志（志（susceptibilitymarkers,MS）个体个体对疾病疾病发生、生、发展易感程度的生物展易感程度的生物标志。志。易感性主要与宿主的易感性主要与宿主的遗传特征特征,以及生以及生长发育、育、营养、免养、免疫、机体活疫、机体活动状状态等有关。等有关。不同疾病的不同不同疾病的不同阶段，都有段，都有可能具有不同的易感性可能具有不同的易感性标志。志。易感性影响着其它生物学易感性影响着其它生物学标志在机体内的水平志在机体内的水平；不同；不同个体的易感性不同，与之相关的其它生物学个体的易感性不同，与之相关的其它生物学标志的水平志的水平也可以不同。也可以不同。23突突变剂敏感性分析

15、敏感性分析24易感性基因易感性基因标志物：志物：1.人人类基因基因组多多态性性(SNPs,CNVs)2.基因基因组表表遗传修修饰(甲基化，乙甲基化，乙酰化化)25WhatisaSNP?WhatisaSNP?WhatisaSNP?26SNP是是指指在在人人群群中中出出现的的频率率 1%的的先先天天突突变。SNP存存在在于于整整个个人人类基因基因组中，可能每中，可能每100300bp就存在一个就存在一个SNP，估，估计总数在数百万个数在数百万个人人类基基因因组计划划研研究究结果果表表明明，不不同同个个体体的的基基因因99.9%是是一一样的的，但在序列上有极小但在序列上有极小(0.1%)的的遗传差异

16、，其中主要是差异，其中主要是SNP。研研究究表表明明，正正是是这0.1%的的差差异异授授予予你你我我他他特特有有的的表表型型；这个个小小小小的的差差异异还与与个个体体对疾疾病病(包包括括肿瘤瘤)的的易易感感性性、对药物物的的反反应性性差差别有有密密切切关系。关系。单核苷酸多核苷酸多态(Singlenucleotidepolymorphism,SNP)27SNP1(locus 1)SNP2(locus 2)GATC双倍型双倍型双倍型双倍型 基因型基因型 G/T A/C单单倍型倍型倍型倍型GATCSNPandHaplotype(单倍型倍型)Modified from Yang.28Haplotyp

17、eBlocks单倍型区段倍型区段人人类基因基因组是由呈是由呈现高度高度连锁不平衡不平衡(LD)的快状区的快状区段排列构成的段排列构成的这些区段是由小的低些区段是由小的低LD的的重重组热点区域分隔的点区域分隔的一个一个单倍型区段可以由一倍型区段可以由一些常些常见的的单倍型的倍型的组合来合来代表代表ChromosomesSNPSHaplotype BlockPatil,Science,200129分子流行病学的应用分子流行病学的应用1、疾病病因的探、疾病病因的探讨遗传因素起重要作用的疾病往往与因素起重要作用的疾病往往与基因基因有关，有关，这不言而不言而喻；而很多；而很多与与环境境因素有关的疾病，也

18、常常需从基因方面去研究，因因素有关的疾病，也常常需从基因方面去研究，因为环境因境因素可以通素可以通过宿主的基因突宿主的基因突变或异常表达引起疾病。或异常表达引起疾病。慢性非慢性非传染性疾病染性疾病肝癌肝癌黄曲霉毒素黄曲霉毒素（体内外（体内外检测）传染病染病AIDS、SARS（分子分型）（分子分型）302、疾病分布、疾病分布规律以及危律以及危险因素致病机理的研究因素致病机理的研究 分子流行病学不分子流行病学不仅研究研究环境与宿主体内的致病因子，境与宿主体内的致病因子，而且着重研究而且着重研究这些致病的危些致病的危险因素，特因素，特别是化学物是化学物质与生物与生物活性物活性物质从暴露开始至疾病从暴

19、露开始至疾病发生生全全过程程的各个的各个环节。慢性非慢性非传染性疾病染性疾病鉴定各种定各种恶性性肿瘤的危瘤的危险因素因素,并并根据个体暴露与根据个体暴露与遗传等易感因素的相互作用等易感因素的相互作用,确定危确定危险度度,筛选对特定致癌因子敏感的个体和特定致癌因子敏感的个体和亚群。群。传染病染病如确定如确定风疹病毒（疹病毒（RV）和巨）和巨细胞病毒（胞病毒（CMV）等在人群中母等在人群中母婴传播的危害程度有多大，播的危害程度有多大，诱发畸形或死畸形或死产、流流产的危的危险度如何等。度如何等。313、疾病易感性的疾病易感性的测定定 在相同的致病因素作用下，只有一部分人在相同的致病因素作用下，只有一

20、部分人发生某种疾病。生某种疾病。这是因是因为人群人群对致病因子的反致病因子的反应存在个体差异，只有一部分人存在个体差异，只有一部分人对其易感。其易感。慢性非慢性非传染性疾病染性疾病肿瘤的瘤的遗传易感性在暴露到疾病易感性在暴露到疾病发生的生的每一步都起作用，包括人群中每一步都起作用，包括人群中较常常见、低危、低危险度的度的遗传多多态性性和高外和高外显率、人群中罕率、人群中罕见的抑癌基因突的抑癌基因突变。传染病染病测定机体内是否存在某种特异性保定机体内是否存在某种特异性保护（中和）抗体（中和）抗体的方法了解其的方法了解其对某种某种传染病是否具有易感性或免疫力染病是否具有易感性或免疫力。324、防治

21、效果、防治效果评价价传染病染病预防防提出的控制措施更有提出的控制措施更有针对性，更有成效性，更有成效基因工程疫苗研制基因工程疫苗研制非非传染病的染病的预防防分子机理的探分子机理的探讨、易感、易感标志物的确定，志物的确定，为筛选和确定高和确定高危危险人群提供了科学依据，使慢性病的人群提供了科学依据，使慢性病的预防更具有防更具有针对性。性。可以可以缩短效果短效果评价周期价周期!33 研究方法研究方法测量指量指标的一般原的一般原则生物生物标志志应特异、特异、稳定；定；标本采集、本采集、储存方便；存方便；检测方法比方法比较简单、实用，而且操作用，而且操作规范，便于范，便于与同与同类研究研究结果比果比较

22、。检测方法灵敏度和特异度高。方法灵敏度和特异度高。34常用的常用的实验室室检测技技术核酸技核酸技术（DNA&RNA）核酸体外核酸体外扩增增（PCR）核酸核酸电泳泳图谱核酸核酸酶切切电泳泳图谱（RFLP）核酸分子核酸分子杂交交有原位有原位杂交、斑点交、斑点杂交、交、转印印杂交（包括交（包括Southernblot检测DNA和和Northernblot检测RNA）等。）等。核酸序列分析核酸序列分析蛋白蛋白质技技术蛋白蛋白质分离分离鉴定技定技术主要有：主要有：电泳、凝胶泳、凝胶电泳、蛋白泳、蛋白质转印印杂交交（Westernblot）、色）、色谱分析、蛋白分析、蛋白质测序等。序等。酶学技学技术包括定

23、性和定量包括定性和定量检测，要求一定，要求一定的条件。的条件。多位点多位点酶电泳（泳（multilocusenzymeelectrophoresis,MEE）法。）法。其它技其它技术免疫学技免疫学技术：酶联免疫吸附免疫吸附试验（ELISA）、）、荧光免疫光免疫试验（FIA）、）、放射免疫放射免疫试验（RIA）、免疫）、免疫细胞胞化学化学检测（ICC）等；）等；色色谱技技术：高效液相色：高效液相色谱技技术HPLC）、液相蛋白色）、液相蛋白色谱技技术（FPLC）等。）等。35AutomatedLiquidHandlerSpectroPREPTMNanoliterDispenserSpectroJE

24、TTMMALDI-TOFMassSpectrometerSpectroREADERTMAutomatedAnalysisSpectroTYPERTMMiniaturizedBiochipSpectroCHIPTMMassARRAYMassARRAYMassARRAYIntegrated ComponentsIntegrated ComponentsIntegrated Components36BloodSampleProcessingandBiomarkerAssayFlowChartPHAPHASpinSpinWholebloodWholebloodshort-termcultureshor

25、t-termculture1ml1ml1ml1ml1ml1mlMutagenMutagensensitivitysensitivityassayassayBPDEBPDE ControlControlBPDEBPDEGammaGamma1ml1mlBPDE-BPDE-InduceDNAInduceDNAadductsadductsassayassayDNADNAextractionextraction1ml1mlRT-PCRforRT-PCRforgeneexpressiongeneexpressionLong-termLong-termstoragestoragecDNAcDNADNADNA

26、1ml1mlRNARNAextractionextractionGenotypingGenotypingLymphocyteisolationLymphocyteisolation(frozen)(frozen)CATCATassaysassaysDNArepairDNArepaircapacitycapacity2ml2mleacheachTransfectionTransfectionHeparinized,10-30mlHeparinized,10-30ml SamplecollectionSamplecollection(casesandcontrols)(casesandcontro

27、ls)37实验室中的室中的质量控制量控制1一般一般实验质量控制量控制(1)标本采集和本采集和储存存(2)试剂和材料和材料(3)仪器器(4)实验方法方法(5)操作操作规范范2设立多重立多重对照照为保保证检测质量，可以量，可以设立多种立多种对照，而且可以采照，而且可以采取取“盲法盲法”。(1)标准准对照照(2)空白空白对照照(3)重复重复对照照3重复重复试验(1)实验室内重复室内重复试验(2)实验室室间重复重复试验38研究实例研究实例39年年龄调整整肺癌肺癌发病率病率2002(10万万-1)Parkinetal.CACancerJClin.200540中国烟草生中国烟草生产及及销售情况售情况资料来

28、源料来源:中国烟草中国烟草发展展报告告41Yangetal.JAMA1999中国人群年中国人群年龄和性和性别特异的吸烟率特异的吸烟率6.9%60.2%200135-74Guetal.AmJPublicHealth200410.6%42性性别特异的非吸烟者特异的非吸烟者“二手烟二手烟”暴露情况暴露情况2000-2001Guetal.AmJPublicHealth.2004 男性男性 女性女性43肺癌肺癌肺癌肺癌暴露暴露暴露暴露非肺癌非肺癌非肺癌非肺癌遗传易感性易感性?科学科学问题：为什么什么仅10%的吸烟者的吸烟者发生肺癌？生肺癌？44GeneticSusceptibilityGeneticSu

29、sceptibilityCancerRiskCancerRiskExposureExposureGeneralpopulationGeneralpopulationSusceptibleSusceptibleHereditaryHereditaryResistantResistant45“Geneticsloadsgun,butEnvironmentstrigger.”46CategoryofSNPsuCodingSNPs(cSNPs):non-synonymousSNPs(nsSNPs)synonymousSNPs(sSNPs)uNon-codingSNPs(ncSNPs):regulato

30、rySNPs(rSNPs)OtherintronicSNPs(iSNPs)rSNPs:locatedat3UTR/5UTR,promoterregionorexon-intronboundaryThelargenumberofotherintronicSNPs!Onlygeneticmarker?47CommongeneticvariantsinmiRNAsandflakingregionsHuZ,ChenJ,TianT,et al.JCI2008PNAS104(9):3300-3305,200748HuZ,ChenJ,TianT,et al.JCI2008CommonPre-miRNASNP

31、sandmiRNAsecondarystructurepredictionusingMfold3.249Genotype-phenotypecorrelationHuZ,ChenJ,TianT,et al.JCI200850Predictedtargetsofmir-196a23pandReportgeneassaysMiRNAsGenesFullnameorAlternativetitlesPvalue3pLSPLymphocyte-specific protein 12.73E-03KIFKinesin-like protein KIF2.89E-03PSMD1026S proteasom

32、e non-ATPase regulatory subunit 102.92E-03BAG3BAG family molecular chaperone regulator 33.14E-03ALOX15Arachidonate 15-lipoxygenase3.25E-03HuZ,ChenJ,TianT,et al.JCI200851Pre-miRNAsSNPsandNSCLCpatientssurvivalGenotypeTestSet,TSValidationSet,VSLog-rank Log-rank P P TS/VS/Merged TS/VS/Merged A A Adjuste

33、dHRB(95%CI)CPatientsDeathsPatientsDeaths(n=556)(n=223)(n=107)(n=45)miR-146ars2910164CC983424131.00 CG27210252231.05(0.75-1.47)GG186873190.229/0.377/0.5061.28(0.89-1.82)miR-149rs2292832GG66261051.00 GT2479553171.03(0.69-1.54)TT24310244230.306/0.106/0.0601.32(0.89-1.97)GG/GT31312163221.00 TT2431024423

34、0.129/0.055/0.0231.29(1.01-1.65)miR-196a2rs11614913TT1526132111.00 CT2649952201.09(0.81-1.46)CC1406323140.095/0.081/0.0161.86(1.32-2.62)TT/CT41616084311.00 CC1406323140.032/0.033/0.0041.76(1.34-2.33)miR-499 rs3746444AA41116280311.00 AG1315527141.11(0.84-1.46)GG146000.958/0.454/0.8591.24(0.55-2.83)HuZ,ChenJ,TianT,et al.JCI200852分子流行病学目前面分子流行病学目前面临的的问题和展望和展望1、干干扰或混或混杂因素的影响因素的影响2、生物、生物标志物的志物的应用局限性用局限性3、疾病位点的低外、疾病位点的低外显率率问题和高和高阶交互作用交互作用4、Epistatic疾病位点疾病位点5、生物、生物统计学方面的制肘学方面的制肘6、多中心合作和行、多中心合作和行业规范范53TraditionalEpidemiologyOne tree at a time54“-Omic”EpidemiologyForests&Mountains55谢谢!56