植物组织培养操作流程.ppt

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1、 第第三三讲讲 植物组织培养操作流程植物组织培养操作流程一一 实验目的实验目的 植物细胞和组织培养的技术性强，要求植物细胞和组织培养的技术性强，要求无菌操作，通过本实验可使同学初步掌无菌操作，通过本实验可使同学初步掌握常规的组织培养技术，加深对无菌操握常规的组织培养技术，加深对无菌操作的了解。作的了解。二二 实验原理实验原理1.1.植植物物的的全全能能性性：植植物物体体的的任任何何一一个个细细胞胞都都具具有有生生长长分分化化成成为为一一个个完完整整植植株株的的能能力力，称称为为植植物物的的全全能能性性。植植物物组组织织培培养养就就是是利利用用植植物物的的全全能能性性进进行行离体无菌植物培养的一

2、门技术。离体无菌植物培养的一门技术。2 2、植物组织培养的发展、植物组织培养的发展v19041904年，德国植物胚胎学家年，德国植物胚胎学家HaningHaning用用萝卜和辣根的胚进行培养，首次获得萝卜和辣根的胚进行培养，首次获得组培的成功。组培的成功。v19221922年，豌豆、玉米和棉花的茎尖培年，豌豆、玉米和棉花的茎尖培育获得成功育获得成功v19331933年，我国李继侗等进行银杏离体年，我国李继侗等进行银杏离体胚培养获得成功。胚培养获得成功。3 3、植物组织培养的应用、植物组织培养的应用l在作物育种上的应用（单倍体植株、种在作物育种上的应用（单倍体植株、种间杂交、细胞融合、细胞突变、

3、种质保间杂交、细胞融合、细胞突变、种质保存和基因工程）。存和基因工程）。l在作物脱毒和快速繁殖上的应用。在作物脱毒和快速繁殖上的应用。l在遗传、生理生化和病理研究上的应用。在遗传、生理生化和病理研究上的应用。4 4、植物组织培养的内容、植物组织培养的内容 植物组织培养包括以植物和它的离植物组织培养包括以植物和它的离体器官、组织、细胞和原生质体为外植体器官、组织、细胞和原生质体为外植体的离体无菌培养，拥有几种不同水平体的离体无菌培养，拥有几种不同水平的培养技术，即整体的、器官的、组织的培养技术，即整体的、器官的、组织的、细胞和原生质的培养技术。的、细胞和原生质的培养技术。（植株植株培养、胚胎培养

4、、器官培养、组织培养、培养、胚胎培养、器官培养、组织培养、细胞培养、原生质体培养细胞培养、原生质体培养）石石斛斛植植物物的的芽芽培培养养长长春春花花的的胚胚性性细细胞胞培培养养黄黄芪芪的的发发状状根根固固体体培培养养黄黄芪芪发发状状根根的的液液体体培培养养5 5、植物组织培养中的重要概念、植物组织培养中的重要概念l愈伤组织：愈伤组织：指由植物的一种组织或器官指由植物的一种组织或器官经历脱分化形成的原始胚样组织，它具经历脱分化形成的原始胚样组织，它具有再分化成为完整植物体的潜能；有再分化成为完整植物体的潜能；l外植体：外植体：植物组织培养中用来进行无菌植物组织培养中用来进行无菌培养的离体材料，可

5、以是器官、组织、培养的离体材料，可以是器官、组织、细胞和原生质体等；细胞和原生质体等；l无菌和消毒：无菌和消毒：烟草愈伤组织烟草愈伤组织诱导一周的烟草愈伤组织诱导一周的烟草愈伤组织长长春春花花的的胚胚性性细细胞胞培培养养三三 实验材料实验材料l烟草（烟草（Nicotiana）属茄科植物，是重要的）属茄科植物，是重要的工业原料，是组织培养中研究的最为广泛工业原料，是组织培养中研究的最为广泛的植物材料。的植物材料。l豌豆（豌豆（Pisum sativum）属豆科植物，是粮）属豆科植物，是粮食、饲料和重要的蔬菜作物，豌豆的根、食、饲料和重要的蔬菜作物，豌豆的根、茎、子叶、下胚轴、上胚轴、花芽等外植茎

6、、子叶、下胚轴、上胚轴、花芽等外植体，皆可形成愈伤组织，其中茎尖、幼胚、体，皆可形成愈伤组织，其中茎尖、幼胚、幼叶等器官可成功的再生成植株幼叶等器官可成功的再生成植株。四四 实验要求实验要求 1、实实验验开开始始前前，值值日日生生将将地地板板拖拖洗洗一一遍遍，所所有有同同学学将将自自己己的的实实验验台台擦擦洗洗一一遍遍，同同组组两两位位同同学学请请先先认认真真研研究究好好实实验验步步骤骤，明明确确合合作作和和分分工工，以以加加快快实实验验速速度度，减减少少染染菌菌机机会会，实实验验开开始始后后，请请尽尽量量不不要要走走动动，有有事请举手。事请举手。2、无无菌菌操操作作要要注注意意：每每次次操操

7、作作前前，将将双双手手用用酒酒精精棉棉球球擦擦拭拭消消毒毒；解解剖剖针针、解解剖剖刀刀等等金金属属工工具具用用火火焰焰烧烧过过灭灭菌菌，在在酒酒精精中中冷冷却却，再再将将酒酒精精烧烧去去方方可可使使用用；尽尽量量减减少少无无菌菌三三角角瓶瓶和和培培养养皿皿在在空空气气中中的的暴暴露露时时间间；所所有有无无菌菌操操作作尽尽量量快快速速完完成成，并并请请在在酒精灯附近进行。酒精灯附近进行。3、请请先先用用带带菌菌豌豌豆豆练练习习茎茎尖尖解解剖剖，经经检检查查无无误误，操操作作熟熟练练后后，再再进进行行无无菌菌解解剖剖及及接接种种，以以减减少少植植物物材材料料染菌或失水死亡的机率。染菌或失水死亡的机

8、率。五五 实验内容实验内容.烟草无菌苗的快速切繁烟草无菌苗的快速切繁继代继代 培养培养.豌豆苗的茎尖培养豌豆苗的茎尖培养组组 培培 实实 验验 用用 品品一、烟草无菌苗的快速切繁一、烟草无菌苗的快速切繁1 1、点点着着酒酒精精灯灯，双双手手擦擦拭拭消消毒毒，打打开开长长有有无无菌菌烟烟草草苗苗的的三三角角瓶瓶，三三角角瓶瓶瓶瓶口口使使用用前前后后需需在在酒酒精精灯灯外焰上烧过灭菌。外焰上烧过灭菌。cmcm的的小小段段，要要求求每每段段至至少少包包含含一一个个生生长长点点，接接入入盛盛有有MSMS培培养养基基的的三三角角瓶瓶中中，每每一一个个切切段段必必须须直直接接接接触培养基，三角瓶口重新烧过

9、灭菌，并重新封好。触培养基，三角瓶口重新烧过灭菌，并重新封好。3 3、在在光光照照培培养养箱箱中中，2525，1616小小时时光光照照条条件件下下培培养养4 4周，可长成完整植株。周，可长成完整植株。1 1、点着酒精灯、点着酒精灯2 2、双手擦拭消毒、双手擦拭消毒3 3、剪刀灭菌、剪刀灭菌外焰外焰4 4、酒精中冷却、酒精中冷却5 5、把酒精烧去、把酒精烧去6 6、打开三角瓶、打开三角瓶铝箔纸的拿法铝箔纸的拿法a a7 7、打开三角瓶、打开三角瓶铝箔纸的拿法铝箔纸的拿法b b8 8、瓶口在火焰上烧过、瓶口在火焰上烧过9 9、铝箔纸的放法、铝箔纸的放法1010、镊出烟草苗、镊出烟草苗a a1111

10、、镊出烟草苗、镊出烟草苗b b12、放入培养皿中、放入培养皿中13、烟烟草草幼幼苗苗形形态态生生长长点点14、剪取茎段、剪取茎段15、剪好的烟草苗、剪好的烟草苗培养皿的拿法培养皿的拿法16、烟草茎段接种、烟草茎段接种a17、烟草茎段接种烟草茎段接种b18、接种好的烟草苗、接种好的烟草苗a19、接种好的烟草苗、接种好的烟草苗b20、重新封好瓶口、重新封好瓶口a21、重新封好瓶口、重新封好瓶口b22、重新封好瓶口、重新封好瓶口c23、重新封好瓶口、重新封好瓶口d24、写好班级和组号、写好班级和组号二二 烟草愈伤组织的培养烟草愈伤组织的培养、挑选生长健康的无菌烟草叶或茎，、挑选生长健康的无菌烟草叶或

11、茎，1cm1cm2 2的小块或相当大小的茎段的小块或相当大小的茎段(造成造成伤口伤口),),接种在盛有接种在盛有MSMS培养基的培培养基的培养皿中养皿中将培养皿用封口膜封住。将培养皿用封口膜封住。、在光照培养箱中，、在光照培养箱中，2525下下,16,16小小时光照，培养两周，可形成愈伤组时光照，培养两周，可形成愈伤组织。织。1、将烟草苗剪出伤口、将烟草苗剪出伤口2、剪好的烟草叶片和茎段、剪好的烟草叶片和茎段3、打开培养皿、打开培养皿4、烟草愈伤组织接种、烟草愈伤组织接种a5、烟草愈伤组织接种、烟草愈伤组织接种b6、培养皿封口、培养皿封口7、写好班级和组号、写好班级和组号8、酒精灯熄灯法、酒精

12、灯熄灯法a9、酒精灯熄灯法、酒精灯熄灯法b三、豌豆苗的茎尖培养三、豌豆苗的茎尖培养、取豌豆幼苗10株，剪取1cm左右的茎尖浸入70%的酒精1分钟消毒液中15分钟无菌水冲洗5次灭菌的滤纸上吸干放入灭菌的培养皿。、在双目解剖镜下，用灭菌的解剖针剥去幼叶露出生长锥，挑取带着两至三个叶原基的生长锥。移到盛有B5培养基的培育皿中，诱导愈伤组织形成，用封口膜将培养皿封好。、在恒温培养箱中，26下,培养六周，可形成簇生芽丛。1、豌豆幼苗形态、豌豆幼苗形态2、剪取豌豆茎尖、剪取豌豆茎尖茎尖茎尖3、剪好的豌豆茎尖、剪好的豌豆茎尖4、倒入、倒入70%酒精处理酒精处理1分钟分钟5、倒去酒精、倒去酒精6、倒入消毒液处

13、理、倒入消毒液处理15分钟分钟7、倒去消毒液、倒去消毒液8、无菌水冲洗、无菌水冲洗5次次9、取出茎尖、取出茎尖10、在滤纸上吸干水分、在滤纸上吸干水分11、双双目目解解剖剖镜镜下下解解剖剖豌豌豆豆茎茎尖尖显显微微解解剖剖镜镜使使用用图图解解目镜目镜放大倍数放大倍数旋钮旋钮物镜物镜 解剖载物台解剖载物台焦距旋钮焦距旋钮底光源开关底光源开关上光源调节上光源调节旋钮旋钮六、实验结果观察六、实验结果观察1、两周以后观察烟草愈伤组织的形成情况。、两周以后观察烟草愈伤组织的形成情况。2、四周后，观察烟草幼苗的成长情况。、四周后，观察烟草幼苗的成长情况。3、六周后，观察豌豆愈伤芽丛的生长情况。、六周后，观察豌豆愈伤芽丛的生长情况。4、每每人人一一份份实实验验报报告告，当当堂堂上上交交。（包括目的和对无菌概念的认识）（包括目的和对无菌概念的认识）解剖镜下剥取豌豆茎尖演示一解剖镜下剥取豌豆茎尖演示一