《分子克隆实验设计》PPT课件.ppt

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1、分子克隆实验原理分子克隆实验原理分子克隆实验原理qq一、菌种保存和活化一、菌种保存和活化qq二、质粒提取和保存二、质粒提取和保存qq三、感受态细胞的制备三、感受态细胞的制备qq四、载体的制备四、载体的制备qq五、基因的制备五、基因的制备qq六、连接六、连接qq七、转化七、转化qq八、重组克隆的筛选八、重组克隆的筛选菌种保存和活化一一一一.甘油菌保存甘油菌保存甘油菌保存甘油菌保存：qq1 1、100 ul 100 ul菌液菌液100 ul100 ul灭菌甘油灭菌甘油 【混匀】【混匀】qq2 2、多制备几管，做上标记【菌名，质粒，时间】、多制备几管，做上标记【菌名，质粒，时间】qq3 3、20 2

2、0 可保存半年；【可保存半年；【80 80 可长期保存】可长期保存】二、甘油菌活化二、甘油菌活化：qq1 1、取一管甘油菌，混匀；、取一管甘油菌，混匀；qq2 2、用接种针接种并在培养平板上划线；、用接种针接种并在培养平板上划线；qq3 3、37 37 倒置培养倒置培养12 h12 h；qq4 4、挑单克隆于、挑单克隆于2.5ml LB(2.5ml LB(视情况加抗生素），视情况加抗生素），37 37 振荡培养振荡培养12 h.12 h.qq【注明：甘油菌用完后，最好扔掉，反复冻融易死亡。】【注明：甘油菌用完后，最好扔掉，反复冻融易死亡。】质粒的提取原理碱裂解法qq三种溶液：三种溶液：溶液溶液

3、1 1：50 m mol/l 50 m mol/l 葡萄糖葡萄糖-维持渗透压，防止维持渗透压，防止DNADNA受机械损伤降解；受机械损伤降解；25 m mol/l Tri 25 m mol/l Tri Cl Cl（pH 8.0)-pH 8.0)-维持维持 pH pH;10 m mol/l EDTA(pH 8.0)-10 m mol/l EDTA(pH 8.0)-螯合螯合CaCa2+2+,DNase,DNase 失活，保失活，保护护DNADNA溶液溶液溶液溶液2 2：0.2 mol/NaOH-0.2 mol/NaOH-核酸核酸变变性（性（pH12pH12或或pH3)(pH3)(解解链链）1%SD

4、S-1%SDS-蛋白蛋白变变性，裂解性，裂解细细胞胞。溶液溶液3 3：7.5 mol/L NH 7.5 mol/L NH4 4AC AC（pH 7.6)-pH 7.6)-沉淀蛋白，大分子核酸，沉淀蛋白，大分子核酸，调节调节pH,pH,使小分子核酸复性（可溶）。使小分子核酸复性（可溶）。qq其它溶液：其它溶液：（1 1）2M 2M NHNH4 4AC-AC-沉淀蛋白，溶解核酸沉淀蛋白，溶解核酸；(2)(2)异丙醇异丙醇-沉淀质粒沉淀质粒 （3 3）7070乙醇乙醇-沉淀质粒，除去异丙醇，盐分。沉淀质粒，除去异丙醇，盐分。(4)RNase-(4)RNase-除去细菌除去细菌RNARNA质粒的提取原

5、理碱裂解法qqProtocal:Protocal:(1)(1)1.5 ml 1.5 ml 菌液，菌液，12000 rpm *1 min,12000 rpm *1 min,弃上清弃上清 （repeat)repeat)收集细菌收集细菌 (2)(2)溶液溶液1(200 1(200 ulul),),剧烈混匀剧烈混匀提供缓冲液提供缓冲液(3)(3)溶液溶液2(400 2(400 ulul)，温柔混匀，冰中，温柔混匀，冰中5 min;5 min;裂解细胞，蛋白核酸变性裂解细胞，蛋白核酸变性(4)(4)溶液溶液3(300 3(300 ulul),),温柔混匀，冰中温柔混匀，冰中10 min;10 min;质

6、粒复性质粒复性(5)(5)13000 rpm*5 min,13000 rpm*5 min,取上清；取上清；除去细菌蛋白，基因除去细菌蛋白，基因DNADNA(6)(6)540 540 ulul 异丙醇，异丙醇，室温室温 10 min;10 min;沉淀质粒沉淀质粒(7)(7)14000 rpm*10 min,14000 rpm*10 min,弃上清；弃上清；除去可溶性杂质除去可溶性杂质(8)(8)100 100 ulul 2M 2M NHNH4 4ACAC(9)(9)13000 rpm*5 min,13000 rpm*5 min,取上清；取上清；(10)(10)100 100 ulul 异丙醇，

7、室温异丙醇，室温10 min;10 min;(11)(11)14000 rpm*10 min,14000 rpm*10 min,弃上清；弃上清；(12)(12)70%70%乙醇乙醇500 500 ulul,14000 rpm*10 min,14000 rpm*10 min,弃上清；弃上清；除去异丙醇，盐分除去异丙醇，盐分(13)(13)烘干烘干10-30 min,10-30 min,除去乙醇除去乙醇(14)(14)50 50 ulul ddH ddH2 2O(O(含含0.1 mg/ml 0.1 mg/ml RNaseRNase),37),37C*30 min.C*30 min.除去细菌除去细菌

8、RNARNA(15)(15)电泳鉴定电泳鉴定初抽精抽除去少量杂质蛋白质粒的保存q1.ddddH2O(可含EDTA)中可短期保存 4 保存1月;-20 可保存一年 2.75%乙醇可长期保存.3.烘干可长期保存(可能难溶)感受态细胞的制备qq1.1.菌种活化菌种活化qq2.2.取菌液至取菌液至50ml LB50ml LB培养液中；培养液中；qq3 3、37 37 ，振荡培养，振荡培养2h2h至对数期；至对数期；qq4 4、转至、转至50 ml50 ml无菌塑料管，无菌塑料管，0 0 *10 min;*10 min;qq5 5、5000 rpm*10 min*4 5000 rpm*10 min*4

9、qq6 6、取沉淀，加、取沉淀，加25ml 50mM CaCl25ml 50mM CaCl2 2【0 0，无菌无菌】qq7 7、5000 rpm*10 min*4 5000 rpm*10 min*4 qq8 8、取沉淀、取沉淀,加加 2 ml 2 ml 含含1515甘油的甘油的50 mM CaCl50 mM CaCl2 2重悬，重悬，200 ul/tube200 ul/tube分装，液氮速冻后至分装，液氮速冻后至80 80 冰箱保存（半年有效）。冰箱保存（半年有效）。【注意：（【注意：（1 1）需要做一个无质粒的对照）需要做一个无质粒的对照 （2 2）并用已知质粒转化，鉴定感受态细胞的转化效率

10、）并用已知质粒转化，鉴定感受态细胞的转化效率大约大约10106 6【1ug PUC 1ug PUC 质粒，产生克隆质粒，产生克隆10106 6 】载体的制备q1、酶切（放大体积100 ul，要充分)q2、胶回收（注意远紫外照射时间不能太长，防止DNA突变）q3、纯度，浓度测定。(电泳测定）基因的制备(*)q1、PCR扩增q2.酶切q3、胶回收q4、纯度，浓度测定连接q1、总体积为10 ul；q2、16 连接过夜；q3、基因mol/载体mol 10;【平端 15】转化qq1 1、连接产物、连接产物 5 ul 5 ul加入感受态细胞中；加入感受态细胞中；qq2 2、混匀，冰上、混匀，冰上30min

11、-30min-cell cell 吸附吸附DNADNAqq3 3、42 42,90 s,90 s热击，促进热击，促进DNADNA进入进入cellcellqq4 4、冰上、冰上1 12min2min使细胞复原使细胞复原qq5 5、加、加1ml LB(1ml LB(无无 Amp)Amp)外源外源DNADNA还未表达还未表达qq6 6、37 37 培养培养1h1hAmpAmp抗性基因表达抗性基因表达qq7 7、6000rpm*30s6000rpm*30s，浓缩，浓缩100ul100ulqq8 8、涂板（、涂板（AmpAmp板）板）抗性筛选抗性筛选qq9 9、37 37 培养过夜。培养过夜。重组克隆的

12、筛选*qq1 1、抗性筛选；、抗性筛选；qq2 2、蓝白斑筛选；、蓝白斑筛选；qq3 3、酶切电泳筛选、酶切电泳筛选(*)(*)；qq4 4、PCRPCR筛选；筛选；qq5 5、测序验证；、测序验证；qq6 6、表达筛选；、表达筛选；qq7 7、生物活性筛选。、生物活性筛选。抗性筛选-质粒载体携带的筛选标记质粒载体携带的筛选标记qq1.Amp1.AmpR R（氨苄青霉素抗性）（氨苄青霉素抗性）qq2 2、TetTetR R(四环素抗性）四环素抗性）qq3 3、KanKanR R(卡那霉素抗性卡那霉素抗性)特点：特点：一般用抗性培养基做初级筛选，一般用抗性培养基做初级筛选，只能保证有载体转入，不

13、能只能保证有载体转入，不能保证外源基因插入。保证外源基因插入。克隆的克隆的AmpAmp抗性筛选抗性筛选蓝白斑筛选 半乳糖苷酶（半乳糖苷酶（Lac Z)Lac Z)的显色反应的显色反应qq一、一、互补：互补：LacZLacZ由由4 4个亚基构成；细菌表达一部分（无活性），个亚基构成；细菌表达一部分（无活性），载体表达一部分（无活性），合在一起构成有活性的载体表达一部分（无活性），合在一起构成有活性的LacZ,LacZ,可分可分解培养基平板中的底物解培养基平板中的底物X-gal,X-gal,生成蓝色物质。（需要生成蓝色物质。（需要IPTGIPTG诱导表诱导表达）蓝斑；达）蓝斑；qq二、外源基因插入

14、载体后，使载体部分二、外源基因插入载体后，使载体部分LacZLacZ失活，无法进行失活，无法进行 互互补白斑。（补白斑。（）qq三、特点：三、特点：qq1 1、未转入载体的细菌也会形成白斑，需同时用抗性筛选；、未转入载体的细菌也会形成白斑，需同时用抗性筛选；qq2 2、无法确定基因插入的方向；、无法确定基因插入的方向；qq3 3、特殊：基因过小，且读框正确，可能无法使载体部分、特殊：基因过小，且读框正确，可能无法使载体部分LacZLacZ失失活，将产生活，将产生 互补，产生蓝斑。互补，产生蓝斑。酶切电泳筛选(*)qq一、选用不同的酶切组合，通过电泳检测一、选用不同的酶切组合，通过电泳检测DNA

15、DNA片断的大小。片断的大小。qq二、特点：二、特点：qq1 1、可鉴定外源基因的重组和插入方向。、可鉴定外源基因的重组和插入方向。qq2 2、结果可靠但操作比较麻烦；、结果可靠但操作比较麻烦；qq3 3、无法检测基因内部的突变。、无法检测基因内部的突变。EcoR1和Xho1双酶切筛选PCR筛选qq1 1、通过特异引物扩增，电泳检测，筛选重组质、通过特异引物扩增，电泳检测，筛选重组质粒。粒。qq二、特点：二、特点：qq1 1、可用、可用2ul2ul菌液做模板，快速，方便，可批量菌液做模板，快速，方便，可批量检测。检测。qq2 2、不能检测基因插入方向、不能检测基因插入方向qq3 3、不能检测基

16、因内部突变。、不能检测基因内部突变。测序验证q一、选取阳性克隆，送公司测序；q二、特点：q 1、最可靠的检测方法。可确定基因的重组，插入的方向，基因内部的突变等。q 2、价格贵，适于12个克隆的验证。qq1 1、一次测序反应一般准确测定、一次测序反应一般准确测定500bp500bp左右左右(也有测准也有测准800bp,800bp,价格价格贵）贵）6060元左右。元左右。qq2 2、测定的序列靠近引物（起点）、测定的序列靠近引物（起点）2030bp2030bp不准，不准，500bp500bp后的序列后的序列也不准。也不准。qq3 3、（、（1 1）质粒测序：）质粒测序：测序引物公司提供测序引物公

17、司提供 （2 2）PCRPCR产物直接测序：产物直接测序：测序引物自己提供，理论上比质粒测序更可靠。测序引物自己提供，理论上比质粒测序更可靠。注意注意:A.:A.测序引物必须与模板完全配对；含有测序引物必须与模板完全配对；含有mixmix碱基的引物碱基的引物一般不能测序；一般不能测序；B.B.测序引物长度一般为测序引物长度一般为2020个碱基左右，个碱基左右，GCGC含量必须在含量必须在505060%60%左右。左右。测序验证测序验证表达筛选q一、SDS-PAGE筛选；q二、亲和筛选；q三、免疫筛选；SDS-PAGE筛选qq1 1、小量诱导表达；、小量诱导表达；qq2 2、全菌液裂解后进行、全

18、菌液裂解后进行SDS-PAGESDS-PAGE电泳；电泳；qq3 3、重组的表达克隆将在特定的位置出现、重组的表达克隆将在特定的位置出现较浓的蛋白条带。（需加不诱导的对照）较浓的蛋白条带。（需加不诱导的对照）qq特点：特点：qq1 1、可检测外源基因的表达。（一般基因、可检测外源基因的表达。（一般基因的插入，方向，读框都正确）的插入，方向，读框都正确）qq2 2、无法筛选不能有效表达的重组质粒。、无法筛选不能有效表达的重组质粒。亲和筛选qq1.50 ml1.50 ml菌液诱导表达，菌液诱导表达，qq2 2、超声破菌，、超声破菌，qq3 3、用少量亲和、用少量亲和beadsbeads吸附上清；吸

19、附上清；qq4 4、SDS-PAGESDS-PAGE检测，在特点位点将出现一条蛋白带。检测，在特点位点将出现一条蛋白带。qq特点：特点：qq1 1、适用于有亲和、适用于有亲和TaqTaq的融合蛋白的检测；的融合蛋白的检测；qq2 2、比、比SDS-PAGESDS-PAGE筛选更灵敏（富集），可靠；筛选更灵敏（富集），可靠；qq3 3、比较麻烦。、比较麻烦。免疫筛选q用抗体检测目标蛋白：qWestern blot（最准确）qELISA(可能会受到交叉反应的干扰）生物活性筛选q酶：测定酶活；q亲和蛋白：与亲和底物作用。q其它的生物活性。分子克隆流程qq1 1、分析基因，载体特点；、分析基因，载体特点；qq2 2、设计克隆策略；、设计克隆策略；qq3 3、检测基因，载体的正确性检测基因，载体的正确性；qq4 4、制备感受态细胞，目的基因，载体；、制备感受态细胞，目的基因，载体；qq5 5、连接，转化。、连接，转化。qq6 6、筛选克隆、筛选克隆 （1 1）AmpAmp抗性初筛；抗性初筛；（2 2）PCRPCR筛选（或酶切筛选）；筛选（或酶切筛选）；（3 3）表达筛选（）表达筛选（SDS-PAGESDS-PAGE和亲和筛选）；和亲和筛选）；（4 4）测序验证）测序验证 （5 5）生物活性筛选。）生物活性筛选。