《核酸的制备与提取》PPT课件.ppt

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1、核酸的分离与鉴定核酸的分离与鉴定王宏伟南京大学医学院Email:第一部份、核酸的基本知识；第二部份、常用核酸制备方法；学习内容学习内容第一部份、核酸的基本知识第一节第一节 核酸核酸的研究历史；的研究历史；第二节第二节 核酸的化学组成；核酸的化学组成；第三节第三节 核酸的结构特点；核酸的结构特点；l1868年瑞士科学家米歇尔()发現细胞核內含高量磷的酸性物质，命名为核素(后改名为核酸)l早期的研究仅将核酸看成是细胞中的一般化学成分，没有人注意到它在生物体内有什么功能；第一节、核酸的发现第一节、核酸的发现核酸作为遗传物质的发現过程核酸作为遗传物质的发現过程20世纪初，德国生理学家柯塞尔(Kosse

2、l)证实了核酸是由四种不同的碱基所组成；美国科学家列文(Levene)又确定了核酸有两种,即DNA和RNA；1928英国科学家格里菲斯(Griffith)利用细菌的性狀转变实验，证明了遗传信息的可传递性；1944美国科学家艾佛瑞(Avery)证实了DNA造成细菌性狀转变的物质基础；1952美国科学家赫雪(Heishey)和蔡斯(Chase)证明遗传物质是DNA非蛋白质；1953年，英国科学家沃森和克里克发现了DNA的双螺旋结构；一一 核酸的概念和重要性核酸的概念和重要性(一)概念由核苷酸或脱氧核苷酸通过3，5-磷酸二酯键连接而成的一类生物大分子，具有非常重要的生物功能，主要是贮存遗传信息和传递

3、遗传信息。包括核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)两类。(二)重要性1.与生命活动关系密切，是重要的生命物质。生命的起源、生长、发育、衰老、死亡与之有关。2.核酸研究是现代生物医学研究的核心。第二节、核酸的组成第二节、核酸的组成二、核酸的类别、分布和组成（一）、类别：核酸(nucleic acid)分为:脱氧核糖核酸(DNA,deoxyribonucleicacid)与 核 糖 核 酸(RNA,ribonucleicacid)。核糖核酸（RNA）分成以下几类：1、信使RNA（mRNA）2、转移RNA（tRNA）3、核糖体RNA（rRNA）4、其他的非编码RNA(snRNA,microRN

4、A)（二）、核酸的分布：（二）、核酸的分布：1 1、DNADNA的分布的分布：真核生物细胞核，线粒体亦含有DNA.原核生物集中于核区，核外的质粒病毒含有DNA或RNA.2 2、RNARNA的分布的分布存在于细胞质和细胞核中。发现了许多新的具有特殊功能的RNA：如反义RNA，核酶等.病毒和亚病毒RNA有许多种：正链RNA、负链RNA病毒、类病毒、卫星病毒等.（三）核酸的组成1.组成的基本单位:核苷酸2.组成元素:C、H、O、N、PRNA为D-核糖，DNA为D-2-脱氧核糖，二者都是型。差别：2位羟基是否脱氧。（1）核酸中的糖）核酸中的糖（2）碱基：）碱基：a、嘌呤碱：腺嘌呤（Ade)、鸟嘌呤(G

5、ua)b、嘧啶碱：胞嘧啶(Cyt)、尿嘧啶(Ura)、胸腺嘧啶(Thy)（3）核苷）核苷：l戊糖与碱基通过-糖苷键相连，CN糖苷键。l糖C1与嘧啶碱N1与嘌呤碱N9相连，碱基与糖环垂直。l根据核苷中所含戊糖的不同，分为核糖核苷和脱氧核糖核苷。l核酸分子中的碱基或核苷酸的修饰非常常见，如DNA的甲基化，RNA的转录后修饰。碱基相连（核苷）酯键（4）核苷酸）核苷酸一切生物的遗传物质核酸核酸核酸脱氧核糖脱氧核糖核酸核酸（DNA）核糖核酸核糖核酸（RNA）基本组成单位基本组成单位主要在细胞核的染主要在细胞核的染色体上，少数在线色体上，少数在线粒体和叶绿体粒体和叶绿体主要在细胞质中主要在细胞质中基本组成

6、单位基本组成单位脱氧核糖脱氧核糖核苷酸核苷酸核糖核苷酸核糖核苷酸五碳糖：脱氧核糖五碳糖：脱氧核糖碱基：碱基：磷酸磷酸A、G、C、T脱氧脱氧核糖核糖碱基碱基磷酸磷酸A腺嘌呤腺嘌呤G鸟嘌呤鸟嘌呤 脱氧核糖核苷酸脱氧核糖核苷酸C胞嘧啶胞嘧啶T胸腺嘧啶胸腺嘧啶五碳糖：核糖五碳糖：核糖碱基：碱基：磷酸磷酸A、G、C、U核糖核糖碱基碱基磷酸磷酸A腺嘌呤腺嘌呤G鸟嘌呤鸟嘌呤 核糖核苷酸核糖核苷酸C胞嘧啶胞嘧啶U尿嘧啶尿嘧啶一、核酸的一级结构一、核酸的一级结构（一）核酸中核苷酸的连接方式DNA、RNA中的脱氧核苷酸、核苷酸是通过3，5磷酸二酯键连接的。表示方法：书写顺序53。核酸的一级结构是指核酸分子中各核苷

7、酸残基以磷酸二酯键连接、沿多核苷酸链排列的顺序。第三节、核酸的结构第三节、核酸的结构核苷酸的组成与连接核苷酸的组成与连接DNADNA的的一一级级结结构构图图示示（二）一级结构的表示方法（二）一级结构的表示方法（1）线条式：竖线碳链、碱基、磷酸（2）文字式：5ppppppppp3DNA5ppppppppp3RNA此式可进一步简化为：53532、一级结构特点lDNA的相对分子量非常大，能编码的信息量十分巨大。l细菌的基因是连续的,无内含子功能相关基因组成操纵子，有共同的调控序列，较少重复序列。l真核生物的基因是断裂的，有内含子功能相关基因不组成操纵子，调控序列占比重大，有较大重复序列,又分为高度重

8、复、中度重复、单一序列。此外还有回文结构.l越是高等的真核生物其调控序列和重复序列的比例越大。1、DNA的一级结构lDNA的一级结构A、T、G、C通过3，5-磷酸二酯键连接，C1碱基，C2脱氧。l碱基：A、T、G、C；脱氧核糖；没有侧链二、DNA的二级结构（1）、模型建立的依据：Chargaff等科学家用纸层析及紫外分光光度技术分析了各种生物的DNA的碱基组成。结果显示：摩尔数A=T；G=C；A+C=G+T；A+G=C+T腺嘌呤腺嘌呤胸腺嘧啶胸腺嘧啶鸟嘌呤鸟嘌呤胞嘧啶胞嘧啶碱基之间形成氢键模型双螺旋平面图The double helix maintains a constant width b

9、ecause purines always face pyrimidines in the complementary A-T and G-C base pairs.The sequence in the figure is T-A,C-G,A-T,G-C.（2）DNA双螺旋的特点双螺旋的特点：A、两条反平行多核苷酸链绕中心轴缠绕，右手螺旋；B、骨架：内侧碱基垂直于纵轴；外侧-磷酸与戊糖、彼此通过3、5磷酸二酯键，糖环平面与纵轴平行。大沟宽，深；小沟宽，深；C、直径：2nm，二相邻碱基高度，二核苷酸夹角36度，旋转一周度，旋转一周10个个核苷酸，一周高度；三、DNA的三级、四级结构：细长的分子

10、以一种高度压缩状态存在于细胞中，双螺旋的进一步扭曲就构成了三级结构。超螺旋，三级结构中的一种。DNA压缩总原则：多级螺旋，4级压缩。真核真核原核原核基因基因A基因基因B基因区间基因区间四、四、RNARNA分子的结构与功能分子的结构与功能（一）、（一）、RNA的类别1 信使RNA(messenger RNA,mRNA);2 转移RNA(transfer RNA,tRNA);3 核糖体RNA(ribosomal RNA,rRNA);（二）、RNA结构的特点RNA与DNA结构十分相似，二者相比有几点不同：（1）核糖：（2）碱基：A、G、C、U（3）二者在三维结构上的区别RNA不具有规则的氢键结构，单

11、链形式存在，只是回折，局部配对，不配对形成突环。1、mRNA5Cap的功能：的功能：3PolyA的功能：的功能：Ala的tRNA结构示意图2、tRNA：转运氨基酸：转运氨基酸tRNA有有“接头接头”(adaptor)功能，具备双重功能，具备双重特性；特性；识别氨基酸识别氨基酸其其3末端末端的腺苷酸可与一氨基酸共的腺苷酸可与一氨基酸共价连接价连接识别密码子识别密码子反密码子反密码子与与mRNA中的密码子碱基中的密码子碱基配对。配对。6、rRNArRNA占 RNA总 量 的 80%以上，核糖体由大小两个亚基组成，大小亚基分别几种rRNA和数十种蛋白质组成。rRNA与几十种蛋白质组成的细胞颗粒核糖体

12、是细胞内合成蛋白质的工厂。核糖体上催化肽键合成的是rRNA，蛋白质只是维持rRNA的构象，起辅助作用。转录转录翻译翻译场所：核糖体场所：核糖体场所：细胞核场所：细胞核其他其他RNA的结构与功能的结构与功能l不均一核内不均一核内RNA(heterogeneousnuclearRNA,hnRNA)：hnRNA是是mRNA的未成熟前体。的未成熟前体。l细胞内有小核细胞内有小核RNA(smallnuclearRNA，snRNA)。它是真。它是真核生物转录后加工过程中核生物转录后加工过程中RNA剪接体剪接体(spilceosome)的主要的主要成分，参与成分，参与mRNA前体的加工过程。前体的加工过程。

13、l核仁小分子核仁小分子RNA(snoRNA)负责负责rRNA加工加工(切割和修饰切割和修饰)由由内含子编码。内含子编码。l染色质染色质RNA(chromosomeRNA),稳定基因组稳定基因组DNA的作用。的作用。第一节第一节 核酸分离纯化的设计及原则核酸分离纯化的设计及原则第二节第二节 基因组基因组DNADNA的分离纯化的分离纯化第三节第三节 质粒质粒DNADNA的提取与纯化的提取与纯化第四节第四节 RNA RNA的分离纯化的分离纯化第二章、核酸分离技术第二章、核酸分离技术第五节第五节 核酸的保存与鉴定核酸的保存与鉴定 1、保持核酸分子结构的完整性；2、尽量清除其它分子的污染，保证核酸纯度；

14、应尽量简化分离纯化步骤，缩短提取时间 尽量避免各种有害因素对核酸的破坏 第一节第一节 核酸分离纯化的设计及原则核酸分离纯化的设计及原则一、核酸分子提取的技术路线一、核酸分子提取的技术路线I.I.材料准备材料准备II.II.破碎细胞或包膜内容物释放破碎细胞或包膜内容物释放III.III.核酸分离、纯化核酸分离、纯化IV.IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质沉淀或吸附核酸，并去除杂质 V.V.核酸溶解在适量缓冲液或水中核酸溶解在适量缓冲液或水中（一）核酸的释放（一）核酸的释放细胞破碎的方法细胞破碎的方法机械法机械法高速组织捣碎机高速组织捣碎机玻璃匀浆器玻璃匀浆器研钵研钵物理法物理法超声匀浆器超声匀浆器

15、冻融法冻融法化学法化学法自溶法自溶法酶处理酶处理表面活性剂处理法表面活性剂处理法（二）核酸的分离与纯化：（二）核酸的分离与纯化：应该清除的杂质主要包括三部分应该清除的杂质主要包括三部分 1、非核酸的大分子污染物：蛋白质、多糖及脂类 物质等 2、非需要的核酸分子：分离某一特定的核酸分子 时，其它的核酸分子皆为杂质；3、加入的有机溶剂和某些金属离子（三）核酸的浓缩、沉淀与洗涤（三）核酸的浓缩、沉淀与洗涤l沉淀是浓缩核酸的最常用的方法l常用的盐类有醋酸钠、醋酸钾、醋酸铵、氯化钠、氯化钾及氯化镁l常用的有机溶剂则为乙醇、异丙醇和聚乙二醇l核酸沉淀常常含有少量共沉淀的盐，需用70%75%的乙醇洗涤去除二

16、、技术路线的设计二、技术路线的设计破碎细胞破碎细胞核酸从细胞中游离出来核酸从细胞中游离出来沉淀核酸沉淀核酸除去蛋白质除去蛋白质乙醇乙醇酚和氯仿酚和氯仿核酸的提取过程核酸的提取过程 基因组基因组DNADNA的特点：的特点：1.1.分子大，容易断裂分子大，容易断裂 2.2.容易污染其它来源的容易污染其它来源的DNADNA分离纯化方法：分离纯化方法：1.1.酚抽提法酚抽提法2.2.甲酰胺解聚法甲酰胺解聚法3.3.玻棒缠绕法玻棒缠绕法4.4.异丙醇沉淀法异丙醇沉淀法第二节第二节 真核基因组真核基因组DNADNA的分离纯化的分离纯化DNA酚抽提法示意图 一、酚抽提法一、酚抽提法基因组基因组DNA的提取的

17、提取-酚抽提法酚抽提法样品的准备细胞的裂解蛋白质变性DNA的抽提DNA的沉淀血基因组血基因组DNA试剂盒试剂盒酵母基因组酵母基因组DNA试剂盒试剂盒细菌基因组细菌基因组DNA试剂盒试剂盒细胞基因组细胞基因组DNA试剂盒试剂盒DNA柱层析法柱层析法示意图示意图第三节 质粒DNA的提取与纯化l质粒是细菌内独立于染色体并能自我复制的小环状DNA分子其大小范围从lkb至200kb以上不等已经在形形色色的细菌类群中发现质粒这些质粒都是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。l质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值，而质粒的分离与提

18、取则是最常用、最基本的实验技术。质粒特性质粒特性1.分子相对小2.含有高效的自主复制成分3.不相容性4.转移性5.选择的标记6.限制性内切酶单一切。质粒质粒DNADNA的提取和纯化的提取和纯化 1 1细菌的培养细菌的培养 先分离单个菌落，接种先分离单个菌落，接种到含少量适当抗生素的到含少量适当抗生素的培养基中扩增，随着细培养基中扩增，随着细菌的生长，质粒菌的生长，质粒DNADNA也也在自主复制。在自主复制。质粒质粒DNA的小量制备的小量制备2-5ml质粒质粒DNA的大量制备的大量制备500ml2细菌的收集l细胞生长过程中，排出大量代谢产物，为了提高质粒DNA的纯度，离心弃上清，细菌沉淀最好用S

19、TE或生理盐水悬浮，漂洗l-2次，离心管壁上的液体也应该仔细去除干净 碱裂解法碱裂解法 煮沸法煮沸法 SDS SDS裂解法裂解法 Triton-Triton-溶菌酶法溶菌酶法 3细菌的裂解方法方法4质粒DNA的提取-适用于大质粒适用于大质粒DNA-不适宜含糖高的菌株如不适宜含糖高的菌株如HB101l选择性地使用RNase的变性剂（如酚、氯仿及强烈的胍类变性剂）l设置专门RNA移液装置；l使用蛋白酶K和阴离子去污剂如SDS、十二烷基肌氨酸钠或脱氧胆酸钠;l准备溶液或缓冲液时，使用无RNA酶的器皿,DEPC处理水等;一、RNA制备的条件与环境第四节第四节 真核细胞真核细胞RNARNA的分离纯化的分

20、离纯化细胞细胞RNA的含量的含量每个细胞的每个细胞的RNA量约为量约为10-5g80%-85%rRNA10%-15%tRNA1%-5%mRNA其他其他RNA：hnRNA、snRNA、snoRNA核酸的鉴定核酸的鉴定浓度鉴定纯度鉴定完整性鉴定核酸的保存核酸的保存DNA的储存RNA的储存第五节第五节核酸的鉴定与保存核酸的鉴定与保存一、核酸的浓度鉴定一、核酸的浓度鉴定（1）紫外分光光度法紫外分光光度法：该法是基于核酸分子中的碱基具有共轭双键结构因而可以吸收紫外线，其最大吸收波长为260nm。DNA或RNA的定量，相当于l50g/ml双链双链DNAl40g/ml单链单链DNA（或（或RNA）l20g/

21、ml寡核苷酸寡核苷酸浓度鉴定紫外分光光度法：测定紫外分光光度法：测定DNADNA在在A A260nm260nm的光吸收值。的光吸收值。如计算如计算DNADNA浓度浓度A A260260稀释倍数稀释倍数5050 g/ml g/ml紫外分光光度法只用于测定浓度大于紫外分光光度法只用于测定浓度大于的核酸溶液。的核酸溶液。(A值等于1时，相当于50g/ml双链DNA，40g/ml单链DNA或RNA，20 g/ml单链寡核苷酸）荧光光度法荧光光度法：核酸的荧光染料溴化乙锭嵌入碱基平面后，本身无荧光的核酸在UV激发下发出红色荧光，且荧光强度的积分与溶液中核酸的含量呈正比。适用于低浓度核酸溶液的定量分析。（

22、1-5ng）3.DNA 分子片断的测定l应用凝胶电泳可以正确地测定应用凝胶电泳可以正确地测定DNADNA片段的分片段的分子大小。电泳完毕后，经澳化乙锭染色，照子大小。电泳完毕后，经澳化乙锭染色，照相，从照片上比较待测样品中的相，从照片上比较待测样品中的DNADNA片段与片段与标准样品中的哪一条带最接近，即可推算出标准样品中的哪一条带最接近，即可推算出未知样品中各片段的大小。未知样品中各片段的大小。紫紫外外分分光光光光度度法法：该法主要通过A260与A280 的比值来判定有无蛋白质的污染，比值升高与降低均提示不纯。判断核酸样品的纯度判断核酸样品的纯度lDNA纯品纯品:lRNA纯品纯品:二、核酸的

23、纯度鉴定二、核酸的纯度鉴定纯纯DNA DNA 比值，比值，1.8 Pr 1.8 Pr、苯酚污染、苯酚污染纯纯RNA RNA 比值，比值，2.0 DNA 2.0 DNA、Pr Pr、苯酚污染、苯酚污染荧光光度法：荧光光度法：用EB等荧光染料示踪的核酸电泳结果可判定核酸制品的纯度。DNA分子较RNA大得多，电泳迁移率低。DNA的完整性测定：的完整性测定：以EB为示踪剂的核酸凝胶电泳结果可判定核酸制品的完整性。基因组DNA片段的分子量很大，在电场中泳动很慢，如果发生降解，电泳图呈拖尾状。三、核酸的完整性鉴定三、核酸的完整性鉴定DNADNA片段的降解片段的降解质粒质粒DNA的完整性测定：的完整性测定：

24、l完整或降解很少的总RNA电泳图谱中，三条带荧光强度积分应呈特定的比值，沉降系数大的核酸区带，电泳迁移低，荧光强度积分高；反之，分子量小，电泳迁移率高，荧光强度积分低。l一般而言，28S（23S）RNA的荧光强度约为18S（16S）RNA的2倍，否则提示有RNA的降解。若在点样孔附近有着色条带，则说明存在DNA的污染。三三（2）RNA的完整性测定：的完整性测定：总总RNARNA电泳图谱电泳图谱正常时，正常时，28S RNA的荧光强度的荧光强度约为约为18S RNA的的2倍，否则提示倍，否则提示RNA的降解的降解1 1、短期贮存：、短期贮存：4 4或或-20-20存放于存放于TETE（trist

25、ris和和EDTAEDTA）缓冲液中。）缓冲液中。TETE缓缓冲冲液液的的PHPH与与DNA DNA 贮贮存存有有关关，PHPH为为8 8时时，可可减减少少DNADNA脱脱氨氨反反应应，PHPH低于时低于时DNADNA容易变性。容易变性。2 2、长期贮存：、长期贮存：TE TE缓冲液中缓冲液中-70-70保存数年；在保存数年；在DNADNA溶液中加一滴氯仿可有效防止细溶液中加一滴氯仿可有效防止细菌和核酸的污染。菌和核酸的污染。（二）核酸的保存-DNADNA的储存的储存RNA溶于的NaAc溶液或三蒸水中，-70保存。注意避免Rnase的污染；分装，避免反复冻融；如用DEPC处理过的水溶解RNA或

26、者在RNA溶液中加入RNasin或VRC，保存时间可延长。2、RNA的储存的储存格里菲斯的细格里菲斯的细菌性状转变实验菌性状转变实验肺炎双球菌S型有致病力R型无致病力老鼠死亡血液中分离出S型菌老鼠存活血液中分离不出R型菌格格里里菲菲斯斯的的细细菌菌性性状状转转变变实实验验活的S型菌活的R型菌死的S型菌活的R型菌加热杀死的S型菌活的S型菌艾佛瑞证实了艾佛瑞证实了DNA促使细菌转型促使细菌转型将将细细胞胞打打碎碎取出萃取物1.DNA分解酶2.RNA分解酶3.蛋白质分解酶假设：S型菌具有某种物质促使R型菌发生转型S型菌R型菌R型菌R型菌R型菌S型菌S型菌赫雪、蔡斯证实了赫雪、蔡斯证实了DNA为遗传物

27、质为遗传物质l以T2噬菌体和大肠杆菌作为材料；l目的：欲知是何种物质可作为噬菌体的遗传物 质，DNA？还是蛋白质外鞘？l利用放射性同位素：35S标定噬菌体蛋白质 32P标定噬菌体DNA蛋白质外鞘DNA噬菌体侵染细菌的实验多基因表型多基因表型:肤色肤色多基因表型多基因表型:身高身高数量性状多基因表型核酸核酸遗传的物质基础遗传的物质基础基因是所有生物体遗传信息的载体基因是所有生物体遗传信息的载体，是决定生老，是决定生老病死等所有现象的基本元素。基因的物质基础是病死等所有现象的基本元素。基因的物质基础是核核酸分子酸分子。人类的健康是受人类的健康是受内因和外因内因和外因共同的影响。共同的影响。外外外外

28、因因因因：个个个个体体体体的的的的外外外外在在在在因因因因素素素素 6 60 0%内内内内因因因因：个个个个体体体体的的的的遗遗遗遗传传传传因因因因素素素素决决决决定定定定 4 40 0%遗传因素为主遗传因素为主遗传因素为主遗传因素为主外因为主外因为主外因为主外因为主血血血血友友友友病病病病高高高高血血血血压压压压肿肿肿肿瘤瘤瘤瘤一一一一型型型型糖糖糖糖尿尿尿尿病病病病外外外外伤伤伤伤所有疾病的发生都与基因密切相关所有疾病的发生都与基因密切相关叶绿体中含有环状DNA细菌等原核生物细菌等原核生物质粒质粒质粒质粒染色染色染色染色体体体体线粒体中含有环状DNA核苷酸的基本构造Monophosphat

29、eDiphosphateTriphosphateAdenineGuanineThymineCytosineUracilNucleoside (Adenosine)Nucleotide (Adenosine monophosphate,AMP)PurinePyrimidine核苷核苷酸磷 酸五环糖Ribose,Deoxyribose碱基12345高速捣碎法：将组织加盐水(约1312)装入捣碎机桶内。用10 000 rmin间断离心，每次3060 s，防止离心时间过长产生的热破坏抗原活性。高速组织捣碎机高速组织捣碎机 高速捣碎法高速捣碎法玻璃匀浆器玻璃匀浆器 研磨法用玻璃匀浆器。主要经过旋转、挤压

30、等方式将组织粉碎。用此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机高，对大分子的破坏也少。该法可用于粉碎少量软嫩材料（脑、胰、肝等）时常用的方法。玻璃匀浆器玻璃匀浆器 常用酶类：常用酶类：溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶等溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶等 方法：方法：在一定的条件下，能消化细菌和在一定的条件下，能消化细菌和 组织细胞。组织细胞。特点：特点：此法适用多种微生物；此法适用多种微生物；具有作用条件温和；具有作用条件温和；内含物成分不易受到破坏；内含物成分不易受到破坏；细胞壁损坏的程度可以控制。细胞壁损坏的程度可以控制。原理：原理：在适当的温度、在适当的温度、pHpH及低离子强度的条及低离子强度的条 件下，表面活

31、性剂能与脂蛋白形成微泡，件下，表面活性剂能与脂蛋白形成微泡，使膜的渗透性改变或使之溶解。使膜的渗透性改变或使之溶解。常用的有：常用的有：十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠(SDS,(SDS,阴离子型阴离子型)、二乙、二乙胺十六烷基溴（阳离子型）、聚山梨酯（非离子型）、胺十六烷基溴（阳离子型）、聚山梨酯（非离子型）、新洁尔灭等。新洁尔灭等。应用：应用：破碎细菌，且作用比较温和；破碎细菌，且作用比较温和；提取基因组或质粒提取基因组或质粒DNADNA的常用破碎方法。的常用破碎方法。各种碱基的紫外吸收光谱各种碱基的紫外吸收光谱EB与DNA的结合核酸的理化性质核酸的理化性质l在细胞内通常与蛋白质结合，以复合物

32、形式存在在细胞内通常与蛋白质结合，以复合物形式存在l微溶于水，不溶于乙醇，氯仿等有机溶剂微溶于水，不溶于乙醇，氯仿等有机溶剂l在酸性溶液中容易降解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。在酸性溶液中容易降解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。lDNADNA溶液粘度很大，溶液粘度很大，RNARNA的粘度较小的粘度较小l在强大离心力的作用下，可以从溶液中沉降下来在强大离心力的作用下，可以从溶液中沉降下来DNA样品准备样品准备l常见的标本：血液、尿液、唾液、组织及培养细胞等；l需要对样本进行预处理；l生物组织：最好新鲜组织，若不能马上提取，应贮存70或液氮。lEDTA的作用：l二价金属螯合剂，抑制核酸酶；l降低细胞

33、膜的稳定性。lSDS的作用：l溶解膜蛋白和脂肪，从而是细胞膜破裂；l溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸释放出来；l对RNA、DNA酶有抑制作用；l与蛋白质形成R-O-SO3.R蛋白质复合物，使蛋白质变性。细胞的裂解细胞的裂解l蛋白酶K：水解蛋白质的作用，消化DNA酶和细胞中的蛋白质。l蛋白酶K与其他蛋白酶相比，它具有更强的水解能力，而且在SDS、EDTA存在时仍保持较高活性，可同时使用。蛋白质变性蛋白质变性DNA的抽提的抽提l酚可以使蛋白质变性沉淀、抑制DNA酶活性。l的Tris溶液可以似的抽提出的DNA进入水相，减少在蛋白质层滞留。l在酚或酚-氯仿中加入少许的异戊醇，是可以减少实验中的气泡的

34、产生，而且利于分相，保持分相的稳定性。DNA的沉淀的沉淀1.无水乙醇沉淀无水乙醇沉淀沉淀前往往加入沉淀前往往加入NaCl等盐离子，作用是中和核酸分子表面的负电荷，等盐离子，作用是中和核酸分子表面的负电荷，有助于分子之间的聚集。有助于分子之间的聚集。无水乙醇可以吸收分子之间的水，使无水乙醇可以吸收分子之间的水，使DNA沉淀析出，无水乙醇使用沉淀析出，无水乙醇使用前冰冻，可以减少前冰冻，可以减少DNA沉淀析出过程释放热量对沉淀析出过程释放热量对DNA的损伤。的损伤。2.异丙醇沉淀异丙醇沉淀除了使除了使DNA沉淀外，还可以溶解少量的小的沉淀外，还可以溶解少量的小的RNA分子。分子。l应用溴化乙锭一氯

35、化铯密度梯度平衡超离心，应用溴化乙锭一氯化铯密度梯度平衡超离心，很容易将不同构象的很容易将不同构象的DNA,RNADNA,RNA及蛋白质分开。及蛋白质分开。这个方法是目前实验室中纯化质粒这个方法是目前实验室中纯化质粒DNADNA时最时最常用的方法。如果应用垂直转头，每分钟常用的方法。如果应用垂直转头，每分钟6500065000转（转（Beckman LBeckman L一一7070超离心机），只要超离心机），只要6h6h可以完成分离工作。但是如果采用角转头，可以完成分离工作。但是如果采用角转头，转速为每分钟转速为每分钟45 00045 000转时，则需转时，则需16h16h。离心。离心完毕后，离心管中各种成分的分布可以在紫完毕后，离心管中各种成分的分布可以在紫外光照射下显示得一清二楚（图外光照射下显示得一清二楚（图1515一一2),2),蛋蛋白质漂浮在最上面，白质漂浮在最上面，RNARNA沉淀在底部，超螺沉淀在底部，超螺旋旋DNADNA沉降较快，开环及线型沉降较快，开环及线型DNADNA沉降较慢。沉降较慢。经染料经染料-氯化铯密度梯氯化铯密度梯度超离心后，质粒度超离心后，质粒DNA及各种杂质的分布及各种杂质的分布超螺旋超螺旋DNA闭环质粒闭环质粒DNA开环质及开环质及线型线型DNA蛋白质蛋白质石蜡油石蜡油5质粒DNA的纯化