《核苷酸与核酸》课件.ppt

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1、目目 录录第第 六六 章章核苷酸与核酸核苷酸与核酸Nucleotides and Nucleic Acids目目 录录核核 酸酸(nucleic acid)是以是以核苷酸核苷酸为基本组成单位的生为基本组成单位的生物大分子，携带和传递遗传信息。物大分子，携带和传递遗传信息。目目 录录l1868年年 Fridrich Miescher 从脓细胞中提取核素。从脓细胞中提取核素。l1944年年 Avery等人证实等人证实DNA是遗传物质。是遗传物质。l1953年年 Watson和和Crick发现发现DNA的双螺旋结构。的双螺旋结构。l1968年年 Nirenberg发现遗传密码。发现遗传密码。l197

2、5年年 Temin和和Baltimore发发现逆转录酶。现逆转录酶。l1981年年 Gilbert和和Sanger建建立立DNA测序方法。测序方法。l1985年年 Mullis发明发明PCR技术。技术。l1990年年 美国启动人类基因组计划美国启动人类基因组计划(HGP)。l1994年年 中国人类基因组计划启动。中国人类基因组计划启动。l2001年年 美英等国完成人类基因组计划。美英等国完成人类基因组计划。n核酸研究的发展简史核酸研究的发展简史目目 录录第一节第一节核酸核酸概述概述The Generality of Nucleic Acids 目目 录录一、核酸的基本结构单位是核苷酸一、核酸的

3、基本结构单位是核苷酸核酸核酸(DNA和和RNA)核苷酸核苷酸核苷和脱氧核苷核苷和脱氧核苷磷酸磷酸戊糖戊糖碱基碱基嘌呤嘌呤嘧啶嘧啶核糖核糖脱氧核糖脱氧核糖目目 录录二、核苷酸由碱基、戊糖、磷酸组成二、核苷酸由碱基、戊糖、磷酸组成目目 录录（一）核酸中的碱基（一）核酸中的碱基嘌呤嘌呤(purine)腺嘌呤腺嘌呤(adenine,A)鸟嘌呤鸟嘌呤(guanine,G)目目 录录嘧啶嘧啶(pyrimidine)胞嘧啶胞嘧啶(cytosine,C)尿嘧啶尿嘧啶(uracil,U)胸腺嘧啶胸腺嘧啶(thymine,T)目目 录录稀有碱基稀有碱基(rare base)(rare base)：核酸中含量甚少的

4、碱基。核酸中含量甚少的碱基。大多数都是甲基化碱基。大多数都是甲基化碱基。tRNAtRNA中含有较多的稀有碱基，可高达中含有较多的稀有碱基，可高达10%10%。DNARNA嘌呤嘌呤m7G 7-甲基鸟嘌呤甲基鸟嘌呤 N6,N6-2m6A N6,N6-二甲基腺嘌呤二甲基腺嘌呤N6-m6A N6-甲基腺嘌呤甲基腺嘌呤N6-m6A N6-甲基腺嘌呤甲基腺嘌呤m7G 7-甲基鸟嘌呤甲基鸟嘌呤嘧啶嘧啶 m5 C 5-甲基胞嘧啶甲基胞嘧啶DHU 二氢尿嘧啶二氢尿嘧啶hm5 C 5-羟甲基胞嘧啶羟甲基胞嘧啶T 胸腺嘧啶胸腺嘧啶核酸中部分稀有碱基核酸中部分稀有碱基目目 录录（二）核苷酸中的戊糖（二）核苷酸中的戊糖

5、（构成（构成RNA）12345核糖核糖(ribose)（构成（构成DNA）脱氧核糖脱氧核糖(deoxyribose)H目目 录录（三）核苷：（三）核苷：AR,GR,UR,CR嘌呤嘌呤N-9-9或或嘧啶嘧啶N-1-1与核糖与核糖C-1C-1 通过通过-N-糖糖苷键苷键相连形成相连形成核苷核苷(ribonucleoside)。NNNN9NH2OOHOHHHHCH2OHH12糖苷键糖苷键目目 录录嘌呤嘌呤N-9 或或嘧啶嘧啶N-1与脱氧核糖与脱氧核糖C-1 通过通过-N-糖苷键糖苷键相连形成相连形成脱氧核苷脱氧核苷(deoxyribonucleoside)。NNNN9NH2OHOHHHHCH2OHH

6、12糖苷键糖苷键脱氧核苷：脱氧核苷：dAR,dGR,dTR,dCR目目 录录（四）核苷酸：（四）核苷酸：AMP,GMP,UMP,CMP脱氧核苷酸：脱氧核苷酸：dAMP,dGMP,dTMP,dCMP NNNN9N H2OO HO HHHHC H2H1 2OPO-H OO糖苷键糖苷键酯键酯键目目 录录 腺嘌呤核苷三磷酸腺嘌呤核苷三磷酸 ATP腺腺 嘌嘌 呤呤 脱脱 氧氧 核核 苷苷 一一 磷磷 酸酸 dAMP目目 录录环式腺苷一磷酸环式腺苷一磷酸cAMP(环磷酸腺苷环磷酸腺苷)环式鸟苷一磷酸环式鸟苷一磷酸cGMP(环磷酸鸟苷环磷酸鸟苷)目目 录录鸟苷四磷酸鸟苷四磷酸 ppGpp目目 录录核苷酸的功

7、能核苷酸的功能脱脱氧氧核核苷苷酸酸：DNA的的组组成成成成分分，为为数数不不多多的参与代谢的调节。的参与代谢的调节。核核糖糖核核苷苷酸酸：RNA的的组组成成成成分分，还还以以多多种种方式参与细胞内的生理和生化过程。方式参与细胞内的生理和生化过程。目目 录录体内重要的游离核苷酸及其衍生物体内重要的游离核苷酸及其衍生物l 含核苷酸的生物活性物质：含核苷酸的生物活性物质：NADNAD+、NADPNADP+、CoACoA-SH-SH、FAD FAD 等都含等都含有有 AMPAMPl 多磷酸核苷酸：多磷酸核苷酸：NMP，NDP，NTPl 环化核苷酸环化核苷酸:cAMP，cGMPcAMPcAMPNADP+

8、NAD+目目 录录 三、核苷酸通过三、核苷酸通过3 3,5,5-磷酸二酯键磷酸二酯键连接成多聚核苷酸（核酸）连接成多聚核苷酸（核酸）3,5-磷酸二酯键是核酸的基本结构磷酸二酯键是核酸的基本结构键，键，多聚核苷酸链方向性。多聚核苷酸链方向性。目目 录录5端端3端端CGA3,5-磷酸二磷酸二酯键酯键多聚核苷酸链方向性多聚核苷酸链方向性 目目 录录 四、核酸分为核糖核酸和脱氧核糖核酸两类四、核酸分为核糖核酸和脱氧核糖核酸两类（一）（一）RNA是单链是单链多聚核糖核酸多聚核糖核酸（二）（二）DNA是单链或双链是单链或双链多聚脱氧核糖核酸多聚脱氧核糖核酸（三）组成（三）组成DNA和和RNA成分不同成分不

9、同（四）多聚核苷酸中（四）多聚核苷酸中核苷酸的排列顺序核苷酸的排列顺序是核苷酸是核苷酸的基本结构（一级结构）的基本结构（一级结构）目目 录录核酸的一级结构：核酸的一级结构：核酸中核酸中核苷酸的排列顺序核苷酸的排列顺序 核苷酸间的差异主要是碱基核苷酸间的差异主要是碱基不同，也称为碱基排列顺序。不同，也称为碱基排列顺序。即即碱基序列碱基序列。55端端3端端CGA目目 录录 3,5-磷磷酸二酯键酸二酯键目目 录录A G P5 P T PG PC PT P OH 3 书写方法书写方法5 pApCpTpGpCpT-OH 3 5 A C T G C T 3 目目 录录目目 录录核酸分子大小表示法核酸分子大

10、小表示法:单链单链DNA或或RNA:碱基数目碱基数目,base,kilobase.双链双链DNA或或RNA:碱基对数目碱基对数目,base pair(bp)kilobase pair(kb)小的核酸片段小的核酸片段(RNA、dsDNA ssDNA 粘度大，易断裂。粘度大，易断裂。沉降系数沉降系数：不同空间结构，沉降速率不同；不同空间结构，沉降速率不同；线性线性 环状环状 ssDNA（或（或RNA）dsDNA 目目 录录碱基的紫外吸收光谱碱基的紫外吸收光谱目目 录录1.DNA或或RNA的定量的定量OD260=1.0相当于相当于50g/ml双链双链DNA40g/ml单链单链DNA（或（或RNA）2

11、0g/ml寡核苷酸寡核苷酸2.判断核酸样品的纯度判断核酸样品的纯度DNA纯品纯品:OD260/OD280=1.8RNA纯品纯品:OD260/OD280=2.0OD260的应用的应用目目 录录五、核酸具有五、核酸具有变性、复性和杂交行为变性、复性和杂交行为定义定义：在理化因素作用下，在理化因素作用下，DNA双链解开成两双链解开成两条单链的过程。条单链的过程。本质：本质：破坏氢键，改变空间结构。破坏氢键，改变空间结构。方法：方法：强酸、碱，加热，变性试剂（尿素、酰强酸、碱，加热，变性试剂（尿素、酰胺）、有机溶剂（乙醇、丙酮）等。胺）、有机溶剂（乙醇、丙酮）等。理化性质变化理化性质变化：ODOD26

12、0260增高增高.（一）核酸变性时空间构象破坏（一）核酸变性时空间构象破坏目目 录录DNADNA变性的本质是双链间氢键的断裂变性的本质是双链间氢键的断裂目目 录录变性引起紫外吸收值的改变变性引起紫外吸收值的改变DNA的紫外吸收光谱的紫外吸收光谱增色效应：增色效应：DNA变性时其溶液变性时其溶液OD260增高的现象增高的现象。目目 录录DNA的解的解链链曲线曲线连连续续加加热热DNA的的过过程程中中以以温温度度相相对对于于A260值值作作图图，所所得得的的曲曲线线称称为为解链曲线解链曲线。解解链链过过程程中中，紫紫外外吸吸光光度度的的变变化化达达到到最最大大变变化化值值的的一一半半时时所所对对应

13、应的温度。的温度。解链温度解链温度(melting temperature，Tm)热变性热变性目目 录录 解链温度解链温度 (melting temperature,Tm)：变性是在一个相当窄的温度范围内完成。变性是在一个相当窄的温度范围内完成。（二）（二）TmTm值是值是DNADNA变性的重要参数变性的重要参数 在变性温度范围在变性温度范围内，紫外吸收值达到内，紫外吸收值达到最大值的最大值的50%时的温时的温度称为度称为DNA的解链温的解链温度度，又称融解温度。，又称融解温度。目目 录录Tm值的影响因素：值的影响因素：1DNA均一性决定熔解温度范围大小：均一性决定熔解温度范围大小：均质均质D

14、NA Tm范围小、异质范围小、异质DNA Tm范围大。范围大。2G-C碱基对含量决定熔解温度高：碱基对含量决定熔解温度高：G-C与与Tm值呈正比值呈正比3介质中的离子强度影响变性：介质中的离子强度影响变性：离子强度低、易变性，离子强度低、易变性，Tm低；低；高盐保存。高盐保存。目目 录录（三）变性的核酸可以复性与分子杂交（三）变性的核酸可以复性与分子杂交 DNA复性复性(renaturation)：在适当条件下，变性在适当条件下，变性DNA的两条互补链可恢的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为复天然的双螺旋构象，这一现象称为复性复性。退火退火(annealing)：热变性的热变性的D

15、NA经缓慢冷却后复性，这一过经缓慢冷却后复性，这一过程称为程称为退火退火。1变性的核酸可复性变性的核酸可复性 目目 录录减色效应：减色效应：DNA复性时，其溶液复性时，其溶液OD260降低降低。DNA复性影响因素复性影响因素：分子量大、浓度小、重复序列多，复性快分子量大、浓度小、重复序列多，复性快目目 录录2.具有同源序列的核酸分子可相互杂交具有同源序列的核酸分子可相互杂交核酸分子杂交（核酸分子杂交（hybridyzation）：不不同同来来源源，但但具具互互补补序序列列的的核核酸酸，按按碱碱基配对原则形成基配对原则形成杂化双链杂化双链的过程。的过程。杂化双链：杂化双链：DNA与与DNA分子，

16、分子，DNA与与RNA分子，分子，RNA与与RNA分子间形成。分子间形成。目目 录录DNA-DNA杂交双链分子杂交双链分子变性变性 复性复性 不同来源的不同来源的DNA分子分子目目 录录目目 录录目目 录录核酸分子杂交的应用核酸分子杂交的应用（1 1）SouthernSouthern印迹印迹可检测可检测DNADNA（2 2）NorthernNorthern印迹印迹用于检测用于检测RNARNA WesternWestern印迹印迹用于检测蛋白质用于检测蛋白质（3 3）斑点印迹杂交）斑点印迹杂交(Dot blot)(Dot blot)（4 4）DNADNA芯片芯片(DNA microarray)(

17、DNA microarray)技术也技术也是是利用核酸杂交原理设计的。利用核酸杂交原理设计的。目目 录录第第 五五 节节核核 酸酸 酶酶 Nucleases目目 录录核酸酶核酸酶是指所有可以水解核酸的酶是指所有可以水解核酸的酶一、核酸酶的分类有多种方法一、核酸酶的分类有多种方法（一）按底物专一性分类（一）按底物专一性分类DNA酶酶(deoxyribonuclease,DNase)：专一降解专一降解DNA。RNA酶酶(ribonuclease,RNase)：专一降解专一降解RNA。目目 录录（二）按对底物作用方式不同分类（二）按对底物作用方式不同分类核酸内切酶：核酸内切酶：限制性核酸内切酶限制性

18、核酸内切酶 非特异性限制性核酸内切酶。非特异性限制性核酸内切酶。核酸外切酶：核酸外切酶：5 3 或或3 5 核酸外切核酸外切酶。酶。（三）按对底物二级结构的专一性分类（三）按对底物二级结构的专一性分类双链酶：双链酶：作用于双链核酸作用于双链核酸单链酶：单链酶：作用于单链核酸作用于单链核酸目目 录录二、核糖核酸酶是一类二、核糖核酸酶是一类RNA内切酶内切酶（一）胰核糖核酸酶（一）胰核糖核酸酶(RNase1):嘧啶核苷酸嘧啶核苷酸（二）（二）RNaseT1:鸟嘌呤核苷酸鸟嘌呤核苷酸（三）（三）RNaseT2:腺嘌呤核苷酸腺嘌呤核苷酸 目目 录录 3种核酸酶作用位点种核酸酶作用位点Py:嘧啶嘧啶核苷

19、酸核苷酸;Pu:嘌呤嘌呤核苷酸核苷酸目目 录录三、脱氧核糖核酸酶是一类三、脱氧核糖核酸酶是一类DNA消化酶消化酶（一）胰（一）胰DNase：切割单链切割单链/双链，产物双链，产物DNA是是5-磷酸末端的寡聚核苷酸磷酸末端的寡聚核苷酸（二）脾二）脾DNase：产物是产物是3-磷酸末端的寡聚磷酸末端的寡聚核苷酸核苷酸（三）（三）BAL 31 核酸酶：核酸酶：DNA外切酶活性为主。外切酶活性为主。（四）限制性内切核酸酶：（四）限制性内切核酸酶：具有位点特异性。具有位点特异性。目目 录录四、四、N-糖苷酶可移去碱基糖苷酶可移去碱基N-糖苷酶（糖苷酶（glycosidase）：）：水水解解核核苷苷酸酸的

20、的N-糖糖苷苷键键，切切除除核核苷苷酸酸的的碱基。碱基。有碱基特异性或非特异性的糖苷酶。有碱基特异性或非特异性的糖苷酶。目目 录录第六节第六节重要的核酸分离、分析技术重要的核酸分离、分析技术Techniques for Isolation and Identification of Nuclear Acids目目 录录一一、分离核酸有多种方法、分离核酸有多种方法（一）酚抽提法是分离核酸的基本方法（一）酚抽提法是分离核酸的基本方法1酚抽提法可抽提酚抽提法可抽提DNA 2酚抽提法也可提取酚抽提法也可提取RNA（二）超速离心可分离核酸二）超速离心可分离核酸（三）凝胶电泳法分离核酸很常用（三）凝胶电泳

21、法分离核酸很常用（四）层析法分离核酸与分离蛋白质原理基（四）层析法分离核酸与分离蛋白质原理基本相同本相同1亲和层析法分离特异核酸亲和层析法分离特异核酸2凝胶过滤层析又称分子筛过滤凝胶过滤层析又称分子筛过滤目目 录录（一）（一）Sanger法又称双脱氧终止法法又称双脱氧终止法 （二）（二）Maxam和和Gilbert法是化学裂解测序法是化学裂解测序（三）（三）tRNA序列分析比序列分析比DNA测序更复杂测序更复杂 二、两种方法常用于核苷酸序列测定二、两种方法常用于核苷酸序列测定目目 录录 Sanger双脱氧法双脱氧法DNA测序测序返回目目 录录双脱氧三磷酸核苷酸双脱氧三磷酸核苷酸NNNN9 NH2OHHHHHC H2H1 2OPO-OOPO-OOPO-H OOddATP目目 录录目的和要求目的和要求掌握：掌握：核酸的组成与一级结构；核酸的组成与一级结构；DNADNA双螺旋结构模型特点；双螺旋结构模型特点；mRNAmRNA和和tRNAtRNA结构与功能；结构与功能；核酸理化性质及其应用。核酸理化性质及其应用。熟悉：熟悉：DNADNA超螺旋结构与超螺旋结构与DNADNA的功能；的功能；rRNArRNA的结构与功能；的结构与功能；核酸酶与核酶。核酸酶与核酶。