《疫组织化学技术》PPT课件.ppt

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1、免疫组织化学技术免疫组织化学技术Immunohistochemistry,IHCImmunocytochemistry,ICCn n基本原理基本原理 利用免疫学中利用免疫学中利用免疫学中利用免疫学中抗原与抗体特异性结合抗原与抗体特异性结合抗原与抗体特异性结合抗原与抗体特异性结合的特点的特点的特点的特点以及组织化学的原理，在组织或细胞标本中加入以及组织化学的原理，在组织或细胞标本中加入以及组织化学的原理，在组织或细胞标本中加入以及组织化学的原理，在组织或细胞标本中加入特定的特定的特定的特定的标记抗体标记抗体标记抗体标记抗体，然后对标记物进行显示，从而，然后对标记物进行显示，从而，然后对标记物进行

2、显示，从而，然后对标记物进行显示，从而对组织或细胞内的抗原物质进行定性、定位或定对组织或细胞内的抗原物质进行定性、定位或定对组织或细胞内的抗原物质进行定性、定位或定对组织或细胞内的抗原物质进行定性、定位或定量研究。量研究。量研究。量研究。免疫酶技术显示显示Caspase-3免疫荧光技术显示显示MOR抗原：抗原：可被T、B细胞识别，并启动特异性免疫应答的物质。即抗原可作用于T、B细胞的抗原识别受体，促使其增殖、分化，产生免疫效应物质产生免疫效应物质（抗体或致敏淋巴细胞）并并与之结合与之结合，从而发挥免疫效应。抗原的两种特性：抗原的两种特性：免疫原性：免疫原性：即能刺激机体产生免疫应答（产生特异性

3、抗体或致敏T 细胞）；抗原性：抗原性：指能与其所诱生的抗体或致敏T细胞特异性结合。完全抗原完全抗原：同时具备免疫原性和抗原性半抗原半抗原：只具备抗原性而不具备免疫原性抗原决定簇抗原决定簇或表位：或表位：决定抗原特异性的基本结构或化学基团，是免疫应答特异性的物质基础。抗原分子表面能够与抗体结合的表位数量称为抗原的价，完全抗原一般均为多价。共同抗原共同抗原：两种不同的抗原分子所具有的相同或相似的抗原决定簇称为共同抗原或共同决定簇。亲缘关系很近的生物之间的共同抗原称为类属抗原；抗体对具有相同或相似决定簇的不同抗原的反应称为交叉反应交叉反应。影响免疫原性的因素：影响免疫原性的因素：1.理化特性理化特性

4、（大分子蛋白质可含有大量不同的抗原决定簇，是强免疫原；多糖是重要的天然抗原，如细菌内毒素脂多糖、血型抗原；核酸多无免疫原性，但与蛋白结合形成核蛋白则有免疫原性；多肽类激素如胰岛素也有免疫原性）、分子量分子量（抗原的分子量一般10kD，且分子量越大，免疫原性越强）、结构的复杂性结构的复杂性（免疫原性物质还须具备复杂的化学组成与特殊的化学基团，如含大量芳香族氨基酸）、分子构象和抗原决定簇的易接近性分子构象和抗原决定簇的易接近性等。2.宿主方面的因素：异种性异种性（“非已”异种、同种异体、自体抗原抗原来源与宿主关系越远，免疫原性越强）、遗传因素遗传因素（个体差异）、年龄、性别与健康状态。年龄、性别与

5、健康状态。3.抗原进入机体的方式：抗原的剂量抗原的剂量（低剂量和高剂量都不易引起免疫应答）、进入机体的途径进入机体的途径（皮内皮下肌肉 腹腔静脉）、免疫次数免疫次数（强的免疫应答需要多次注射）、佐剂佐剂（可先于抗原或同时与抗原混合注射动物，以增强抗原的免疫原性，即起辅佐抗原作用的物质，如弗氏佐剂）。抗体（antibody,Ab）机体免疫细胞被抗原激活后，由分化成熟的终末B 细胞浆细胞合成、分泌的一类能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。是介导体液免疫的重要效应分子。典型的免疫球蛋白分子呈Y字型，由两条相同的重链（heavy chain,H）和两条相同的轻链（light chain,L）

6、借二硫键连接而成。在氨基端，重链的1/4和轻链的1/2氨基酸序列变化很大，为可变区（variable region,V）；其他部分氨基酸序列相对恒定，为恒定区（constant region,C）。Fab即抗原结合片段抗原结合片段（fragment antigen binding），由一条完整的轻链和部分重链（VH和CH1）组成。该片段具有单价抗体活性，能与一个相应的抗原决定族特异性结合。Fc即可结晶片段可结晶片段（fragment crystalline），Fc段含有两条重链C端的一半，包含CH2和CH3两个功能区，它无抗体活性。Ig在异种间免疫所具有的抗原性抗原性主要存在于Fc段，同时Fc

7、段还具有活化补体、亲细胞、通过胎盘和介导与细菌蛋白结合等生物学活性。用木瓜蛋白酶水解IgG分子，可将其裂解为两个完全相同的Fab和一个Fc片段。多克隆抗体多克隆抗体（polyclonal antibody,PcAb）大多数天然抗原物质(如细菌或其分泌的外毒素以及各种组织成分等)往往具有多种不同的抗原决定簇，而每一决定簇都可刺激机体产生一种特异性抗体。多克隆抗体是多个抗原决定簇刺激机体后，由多个免疫淋巴细胞分泌的多种抗体的混多种抗体的混合物合物。PcAb 特异性差，易出现交叉反应。由单一克隆B细胞杂交骨髓瘤细胞产生的，只识别一种抗原表位的具有高度特异性的抗体。优点：结构均一、纯度高、特异性强、效

8、价高、易大量制备。制备单一表位特异性抗体的理想方法是获得针对单一表位的浆细胞克隆，使其在体外扩增并分泌抗体。但浆细胞在体外的寿命较短，也难以培养。于是，将可产生特异性抗体但短寿的浆细胞与无抗原特异性但长寿的恶性浆细胞瘤细胞融合，建立了可产生单克隆抗体的杂交瘤细胞和单克隆抗体技术。单克隆抗体单克隆抗体（monoclonal antibody,McAb）免疫组织化学方法免疫组织化学方法荧光标记免疫组织化学荧光标记免疫组织化学酶联免疫组织化学酶联免疫组织化学直接法直接法：用酶或其他标记物标记的特异性抗体直接与标本中的相应抗原结合，再与酶的底物作用产生有色产物，沉积在抗原抗体反应的部位，即可对抗原进行

9、定性、定位以至定量研究。Tissue AntigenLabeled Antibody间接法间接法：第一抗体不标记，使用与第一抗体种属相同的抗体Fc段（有种属特异性）作为抗原免疫动物，制备抗抗体，即第二抗体，并标记第二抗体。Tissue AntigenPrimary AntibodySecondary Antibody酶联免疫组织化学酶联免疫组织化学 ABC法法 S-P法法 亲合素亲合素生物素生物素过氧化物酶复合物法过氧化物酶复合物法（avidin-biotin-peroxidase complex method,ABC法）1.生物素与亲合素有很高的亲和力2.一个亲合素分子上有四个生物素结合位点

10、3.将亲合素作为“桥”将生物素化的抗体与生物素结合的酶连接起来，使抗原与抗体反应信号放大，以增强敏感性链霉亲合素链霉亲合素生物素生物素过氧化物酶复合物法过氧化物酶复合物法（streptavidin-biotin-peroxidase complex method,SABC法）此法为上述此法为上述ABC法的改良，是用法的改良，是用链霉链霉亲合素亲合素（streptavidin）代替代替ABC法中法中的的亲合素亲合素（avidin）Streptavidin链霉亲合素链霉亲合素avidin亲合素亲合素链霉亲合素为蛋白质，非糖蛋白，不链霉亲合素为蛋白质，非糖蛋白，不与其它分子结合，可降低背景。与其它分

11、子结合，可降低背景。亲合素是糖蛋白，含有约亲合素是糖蛋白，含有约7%的糖类，可与组织中含糖基的的糖类，可与组织中含糖基的物质起反应，造成背景着色。物质起反应，造成背景着色。链霉亲合素链霉亲合素-过氧化物酶法过氧化物酶法（streptavidin peroxidase，S-P法）Streptavidin链霉链霉亲合素亲合素酶标酶标链霉链霉亲合素亲合素链霉亲合素对组织的穿透性强，反应速度快；链霉亲合素对组织的穿透性强，反应速度快；链霉亲合素的等电点接近中性（链霉亲合素的等电点接近中性（6.7,而亲合素而亲合素为为10左右），所带负电荷少，不容易与组织中的左右），所带负电荷少，不容易与组织中的正电荷

12、发生相互吸引，因此可降低背景着色；正电荷发生相互吸引，因此可降低背景着色；S-P法的放大系统不含生物素，可免除内源性生法的放大系统不含生物素，可免除内源性生物素所造成的背景着色。物素所造成的背景着色。免疫组织化学酶类标记物满足条件：n n酶催化底物必须是特异的，并容易被显示（产物酶催化底物必须是特异的，并容易被显示（产物易于镜下观察）；易于镜下观察）；n n酶反应形成的终产物必须是稳定的沉淀，不能从酶反应形成的终产物必须是稳定的沉淀，不能从酶活性部位向周围组织弥散；酶活性部位向周围组织弥散；n n容易获取（纯）；容易获取（纯）；n n中性中性pHpH值时，具有稳定性；值时，具有稳定性；n n酶

13、标记至抗体上不影响酶和抗体的活性。酶标记至抗体上不影响酶和抗体的活性。常用酶类标记物n n辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase,HRPhorseradish peroxidase,HRP）H2O2和DAB（diaminobenzidine,diaminobenzidine,二氨基联苯胺）为其常用底物，产物为稳定的棕黄色沉淀n n碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,APalkaline phosphatase,AP）：BCIPBCIP (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate5-bromo-4-chloro-3-indo

14、lyl-phosphate，5-5-溴溴-4-4-氯氯-3-3-吲哚吲哚-磷酸盐磷酸盐)和和 NBTNBT（Nitro-Blue-TetrazoliumNitro-Blue-Tetrazolium，四唑氮蓝，四唑氮蓝）是）是APAP的的常用常用底物底物组合，组合，其中，其中，NBTNBT作为氧化剂作为氧化剂,BCIP,BCIP作为作为APAP底物。底物。BCIPBCIP被AP水解成一种蓝色的中间物，后者然后被NBT氧化形成二聚体（不溶性紫蓝色沉淀）。Double staining using DAB and BCIP/NBT 免疫组织化学技术的基本要求免疫组织化学技术的基本要求1、有高度特异性

15、；、有高度特异性；2、有高度敏感性；、有高度敏感性；3、不引起受检物质的移位和丢失；、不引起受检物质的移位和丢失；4、不影响抗原和抗体的免疫活性；、不影响抗原和抗体的免疫活性；5、不损伤组织和细胞的本来结构；、不损伤组织和细胞的本来结构；6、免疫结合物借标记物明显可见、免疫结合物借标记物明显可见免疫组织化学标本的制备免疫组织化学标本的制备一、一、组织的固定组织的固定 1 1、目的：、目的：固定抗原的定位固定抗原的定位 保存组织细胞的形态结构保存组织细胞的形态结构 2 2、常用固定剂和固定液：、常用固定剂和固定液：甲醛、多聚甲醛、戊二醛等甲醛、多聚甲醛、戊二醛等 3 3、作用和缺点：、作用和缺点

16、：固定组织和保存抗原固定组织和保存抗原 抗原易被掩盖抗原易被掩盖二、二、固定的方法固定的方法（一）方法：一）方法：推注推注，滴注滴注（二）（二）滴注滴注步骤：步骤：1 1、开胸、开胸 2 2、暴露心脏、暴露心脏 3 3、自心尖剪开左心室、自心尖剪开左心室 4 4、插入灌流针至主动脉弓、插入灌流针至主动脉弓 5 5、固定灌流针、固定灌流针 6 6、快速注入冲洗液（有时可免）、快速注入冲洗液（有时可免）7 7、先快后慢注入固定液、先快后慢注入固定液 8 8、慢注毕，将动物装入含慢注毕，将动物装入含 有少量固定液的塑料袋有少量固定液的塑料袋 置置44C C冰箱内静置冰箱内静置2 2h h后取材后取材

17、三、组织包埋和切片三、组织包埋和切片（一）（一）石蜡包埋切片石蜡包埋切片（二）恒冷箱切片（二）恒冷箱切片 （一）石蜡包埋切片（一）石蜡包埋切片（二）恒冷箱切片：（二）恒冷箱切片：防冰晶防冰晶 1 1、骤冻、骤冻 2 2、1030%蔗糖溶液蔗糖溶液异戊烷异戊烷干冰干冰组织块组织块冰冻切片包埋模具配冰冻切片包埋模具配套包埋剂使用套包埋剂使用 免疫组织化学染色程序免疫组织化学染色程序以以ABC法法为例为例组织抗原组织抗原生物素生物素化化二抗二抗ABC一抗一抗染色程序染色程序:组织采用石蜡切组织采用石蜡切片或恒冷箱切片片或恒冷箱切片,片厚片厚510 m或者或者10 15 m。若若石蜡切片石蜡切片则脱则

18、脱蜡到水蜡到水 1、PBS漂洗漂洗,10 min；染色程序染色程序:2、10%NSS（或者（或者3%BSA）,30 min；3、1%Triton X-100,3%H2O2处理，处理，30 min;4、兔抗血清兔抗血清孵育过夜；孵育过夜；4、PBS漂洗漂洗,3 5 min；5、生物素化羊抗兔生物素化羊抗兔IgG 孵育孵育,60 min；6、PBS漂洗，漂洗，3 5 min；载玻片载玻片标签标签组织组织切片切片生物素化生物素化二抗二抗生物素生物素染色程序染色程序:7、ABC复合物复合物孵育孵育,60 min；8、PBS漂洗漂洗,3 5 min；9、DABH2O2显色液显显色液显 色，至深棕色为止，

19、色，至深棕色为止，约约510 min；（DABH2O2 临用前配制）临用前配制）ABC标签标签组织组织切片切片ABC染色程序染色程序:10、先后经自来水冲洗、先后经自来水冲洗 和双蒸水浸洗；和双蒸水浸洗；11、常规脱水、透明、常规脱水、透明、树胶封片。树胶封片。染色结果：染色结果：镜下观察。镜下观察。阴性对照试验：阴性对照试验：1、常用空白试验：即用稀释常用空白试验：即用稀释一抗一抗的稀释液，的稀释液，如如10%NSS等，或等，或 PBS替代一抗，反应应呈阴性；替代一抗，反应应呈阴性；2、替代试验：正常兔血清或替代试验：正常兔血清或 正常羊血清代替正常羊血清代替兔抗血清兔抗血清或或羊抗兔羊抗兔

20、IgG，反应应呈阴性；，反应应呈阴性；3、吸附试验：吸附试验：一抗血清一抗血清经相经相 应抗原预吸附处理后孵育组织应抗原预吸附处理后孵育组织切片，反应应呈阴性。切片，反应应呈阴性。切切 片片n n载玻片的清洁：n n切片粘合剂的使用：（1 1 1 1）多聚赖氨酸（分子量）多聚赖氨酸（分子量）多聚赖氨酸（分子量）多聚赖氨酸（分子量300KD300KD300KD300KD）：）：）：）：0.5%0.5%0.5%0.5%浓度涂片。浓度涂片。浓度涂片。浓度涂片。（2 2 2 2）APESAPESAPESAPES 干净载玻片干净载玻片干净载玻片干净载玻片丙酮丙酮丙酮丙酮5min 5min 5min 5m

21、in 用镊子夹住浸入用镊子夹住浸入用镊子夹住浸入用镊子夹住浸入APESAPESAPESAPES试剂试剂试剂试剂（1ml+50ml1ml+50ml1ml+50ml1ml+50ml丙酮）丙酮）丙酮）丙酮）1 1 1 13 3 3 3次次次次纯丙酮洗二次纯丙酮洗二次纯丙酮洗二次纯丙酮洗二次干燥玻干燥玻干燥玻干燥玻片片片片(37(37(37(37过夜过夜过夜过夜)用铝箔包好，室温或用铝箔包好，室温或用铝箔包好，室温或用铝箔包好，室温或4444保存备用。保存备用。保存备用。保存备用。（3 3 3 3）铬矾明胶液：铬矾）铬矾明胶液：铬矾）铬矾明胶液：铬矾）铬矾明胶液：铬矾0.5g 0.5g 0.5g 0.

22、5g 明胶明胶明胶明胶5g H5g H5g H5g H2 2 2 2O 1000mlO 1000mlO 1000mlO 1000ml 细胞爬片制作细胞爬片制作n n将处理好的盖玻片放入接种了细胞的培养将处理好的盖玻片放入接种了细胞的培养瓶或六孔板内。瓶或六孔板内。n n待细胞生长达到待细胞生长达到6060以上后取出玻片。以上后取出玻片。n n用用4%4%的多聚甲醛固定的多聚甲醛固定2h2h以上。以上。n n可加甘油封存置于零下可加甘油封存置于零下2020度保存。度保存。细胞涂片制作细胞涂片制作n n离心将细胞收集出来，用预冷的离心将细胞收集出来，用预冷的PBSPBS洗洗2 23 3遍，最后用遍

23、，最后用PBSPBS将细胞将细胞重悬。重悬。n n吸取吸取303050ul50ul（可根据细胞量调整）（可根据细胞量调整）滴至处理过的载玻片上，然后涂抹滴至处理过的载玻片上，然后涂抹均匀。均匀。n n待稍微风干以后加待稍微风干以后加4 4多聚甲醛溶液多聚甲醛溶液覆盖细胞，固定覆盖细胞，固定2 24 4小时。小时。n n在细胞上加一层甘油放在细胞上加一层甘油放-20-20-20-20保存。保存。保存。保存。细胞离心涂片机是利用液动与气动原理,将收集的细胞样本进行了细胞分散,过滤从其混悬液中分离出来,均匀的喷涂在玻片上。抗原修复抗原修复免疫组织化学方法成功与否关键在于抗原决免疫组织化学方法成功与否

24、关键在于抗原决定簇的保存和暴露。组织经甲醛固定，甲醛定簇的保存和暴露。组织经甲醛固定，甲醛的醛基与抗原蛋白的氨基交联，使抗原决定的醛基与抗原蛋白的氨基交联，使抗原决定簇被掩盖，从而影响对蛋白表达的检测。要簇被掩盖，从而影响对蛋白表达的检测。要充分暴露抗原决定簇，通常用到抗原修复。充分暴露抗原决定簇，通常用到抗原修复。加热抗原修复法加热抗原修复法酶消化法酶消化法n n高压加热修复法高压加热修复法 切片脱蜡至水切片脱蜡至水切片脱蜡至水切片脱蜡至水;0.3%H 0.3%H 0.3%H 0.3%H2 2 2 2O O O O2 2 2 2甲醇处理切片甲醇处理切片甲醇处理切片甲醇处理切片10min;10

25、min;10min;10min;蒸馏水洗蒸馏水洗蒸馏水洗蒸馏水洗;切片放入切片放入切片放入切片放入0.01M 0.01M 0.01M 0.01M 柠檬酸盐缓冲液（）中，柠檬酸盐缓冲液（）中，柠檬酸盐缓冲液（）中，柠檬酸盐缓冲液（）中，连同容器放入高压锅中加热至沸腾。盖上压连同容器放入高压锅中加热至沸腾。盖上压连同容器放入高压锅中加热至沸腾。盖上压连同容器放入高压锅中加热至沸腾。盖上压力阀至喷汽后持续力阀至喷汽后持续力阀至喷汽后持续力阀至喷汽后持续1 1 1 14min;4min;4min;4min;待修复液恢复至室温后，待修复液恢复至室温后，待修复液恢复至室温后，待修复液恢复至室温后，PBSP

26、BSPBSPBS洗洗洗洗3 3 3 3次，随后次，随后次，随后次，随后按选好的免疫组织化学染色方法进行染色。按选好的免疫组织化学染色方法进行染色。按选好的免疫组织化学染色方法进行染色。按选好的免疫组织化学染色方法进行染色。n n电炉加热修复法电炉加热修复法 切片脱蜡至水切片脱蜡至水切片脱蜡至水切片脱蜡至水;0.3%H 0.3%H 0.3%H 0.3%H2 2 2 2O O O O2 2 2 2甲醇处理切片甲醇处理切片甲醇处理切片甲醇处理切片10min;10min;10min;10min;蒸馏水洗蒸馏水洗蒸馏水洗蒸馏水洗;将切片放入抗原修复液中于电炉上加热，不时将切片放入抗原修复液中于电炉上加热

27、，不时将切片放入抗原修复液中于电炉上加热，不时将切片放入抗原修复液中于电炉上加热，不时用温度计测量温度，当达用温度计测量温度，当达用温度计测量温度，当达用温度计测量温度，当达92929292后，即可拔离电源，后，即可拔离电源，后，即可拔离电源，后，即可拔离电源，当温度低于当温度低于当温度低于当温度低于92929292时，再插上电源，如此反复持续时，再插上电源，如此反复持续时，再插上电源，如此反复持续时，再插上电源，如此反复持续至至至至10min10min10min10min左右左右左右左右;待抗原修复液降至室温后，待抗原修复液降至室温后，待抗原修复液降至室温后，待抗原修复液降至室温后，PBSP

28、BSPBSPBS洗洗洗洗3 3 3 3次，随后按次，随后按次，随后按次，随后按选定的免疫组化染色方法进行染色。选定的免疫组化染色方法进行染色。选定的免疫组化染色方法进行染色。选定的免疫组化染色方法进行染色。Steaming temperature between 95 C-98 C which is optimal for most of antigens.set the Timer for 40 minutes that is sufficient for retrieving most antigens(some antigens need longer steaming time so

29、optimal steaming time should be determined by user).IHC-TekTMEpitopeRetrievalSteamerSet n n微波修复法微波修复法 切片脱蜡至水切片脱蜡至水切片脱蜡至水切片脱蜡至水;0.3%H 0.3%H 0.3%H 0.3%H2 2 2 2O O O O2 2 2 2甲醇处理甲醇处理甲醇处理甲醇处理10min;10min;10min;10min;蒸馏水洗柠檬酸盐缓冲液（），于微波蒸馏水洗柠檬酸盐缓冲液（），于微波蒸馏水洗柠檬酸盐缓冲液（），于微波蒸馏水洗柠檬酸盐缓冲液（），于微波炉内微波辐射炉内微波辐射炉内微波辐射炉内微

30、波辐射10min;10min;10min;10min;待修复液降至室温后，待修复液降至室温后，待修复液降至室温后，待修复液降至室温后，PBSPBSPBSPBS洗洗洗洗3 3 3 3次，随后次，随后次，随后次，随后按选好的免疫组织化学染色方法进行染色。按选好的免疫组织化学染色方法进行染色。按选好的免疫组织化学染色方法进行染色。按选好的免疫组织化学染色方法进行染色。Heat-inducedEpitopeRetrieval(HIER)HIER is believed to reverse some cross-links and allows for restoration of secondary

31、 or tertiary structure of the epitope.The protocol must be optimized for each tissue,fixation method,and antigen to be studied.In general,HIER has a much higher success rate than PIER.HIER is performed using microwave ovens,pressure cookers,vegetable steamers,autoclaves,or water baths.Microwaves are

32、 an increasingly popular appliance for HIER.These protocols tend to involve 5 minute periods of heat followed by replacement of the buffer.For all HIER methods,slides must be cooled before commencing IHC/ICC incubations.HIER is especially time-,temperature-,buffer-,and pH-sensitive,and the best meth

33、od must be determined empirically.R&D Systems offers reagents to improve tissue antigen detection and enhance immunoreactivity.During initial optimization,investigators can compare samples treated with Universal Antigen Retrieval Solution(Catalog#CTS015)with a slide of the same tissue without antige

34、n retrieval.Subsequent tests using acidic or basic antigen retrieval solutions may be necessary depending on the tissue.At R&D Systems,we find that treatment with Basic Antigen Retrieval reagent(pH 9.5,Catalog#CTS013)is frequently successful.We also offer Acidic(pH 5.0,Catalog#CTS014)and Sampler(Cat

35、alog#CTS016)Antigen Retrieval Reagents.Acidic and basic antigen retrieval solutions are more likely to affect tissue morphology than a neutral solution.The time,temperature,and pH must also be optimized for each appliance(i.e.5-10 minutes at 92-95 C in a water bath,versus 1-5 minutes at 120 C in a p

36、ressure cooker).n n胃蛋白酶消化法胃蛋白酶消化法 切片脱蜡至水切片脱蜡至水切片脱蜡至水切片脱蜡至水;0.3%H 0.3%H 0.3%H 0.3%H2 2 2 2O O O O2 2 2 2甲醇处理切片甲醇处理切片甲醇处理切片甲醇处理切片10min;10min;10min;10min;蒸馏水洗蒸馏水洗蒸馏水洗蒸馏水洗;PBS PBS PBS PBS洗洗洗洗3 3 3 3次次次次;滴上配制好或商品化的胃蛋白酶，处理切片滴上配制好或商品化的胃蛋白酶，处理切片滴上配制好或商品化的胃蛋白酶，处理切片滴上配制好或商品化的胃蛋白酶，处理切片20min20min20min20min左右左右左

37、右左右;PBS PBS PBS PBS冲洗冲洗冲洗冲洗3 3 3 3次次次次;按选择好的免疫组化该法进行染色。按选择好的免疫组化该法进行染色。按选择好的免疫组化该法进行染色。按选择好的免疫组化该法进行染色。Protease-inducedEpitopeRetrieval(PIER)In the PIER method,enzymes including Proteinase K,Trypsin,and Pepsin have been used successfully to restore the binding of an antibody to its epitope.The mecha

38、nism of action is thought to be the cleavage of peptides that may be masking the epitope.The disadvantages of PIER are the low success rate for restoring immunoreactivity and the potential for destroying both tissue morphology and the antigen of interest.n n胰蛋白酶消化法胰蛋白酶消化法 切片脱蜡至水切片脱蜡至水切片脱蜡至水切片脱蜡至水;0.

39、3%H 0.3%H 0.3%H 0.3%H2 2 2 2O O O O2 2 2 2甲醇处理切片甲醇处理切片甲醇处理切片甲醇处理切片10min;10min;10min;10min;蒸馏水洗蒸馏水洗蒸馏水洗蒸馏水洗;PBS PBS PBS PBS洗洗洗洗3 3 3 3次次次次;滴上自配的或商品化的胰蛋白酶，处理切片滴上自配的或商品化的胰蛋白酶，处理切片滴上自配的或商品化的胰蛋白酶，处理切片滴上自配的或商品化的胰蛋白酶，处理切片20min20min20min20min左右左右左右左右;PBS PBS PBS PBS洗洗洗洗3 3 3 3次次次次;按选好的免疫组化染色方法进行染色。按选好的免疫组化染

40、色方法进行染色。按选好的免疫组化染色方法进行染色。按选好的免疫组化染色方法进行染色。注意事项一、抗体的保存一、抗体的保存 浓缩抗体：有效期内，只需放在浓缩抗体：有效期内，只需放在浓缩抗体：有效期内，只需放在浓缩抗体：有效期内，只需放在 4 4 4 4冰箱内，保存时间可达冰箱内，保存时间可达冰箱内，保存时间可达冰箱内，保存时间可达1-31-31-31-3年。年。年。年。即用型抗体：理论上在即用型抗体：理论上在即用型抗体：理论上在即用型抗体：理论上在4444冰箱内冰箱内冰箱内冰箱内 可保存半年左右。可保存半年左右。可保存半年左右。可保存半年左右。PBSPBSPBSPBS或抗体稀释液稀释的抗体：一般

41、或抗体稀释液稀释的抗体：一般或抗体稀释液稀释的抗体：一般或抗体稀释液稀释的抗体：一般 只可放置只可放置只可放置只可放置1-1-1-1-2 2 2 2个月。个月。个月。个月。二、出现假阳性的原因二、出现假阳性的原因 组织切片质量不佳，造成假象，如组织切片质量不佳，造成假象，如 刀痕裂缝边缘的组织着色过深，不能作刀痕裂缝边缘的组织着色过深，不能作 为判断阳性的依据。为判断阳性的依据。出血和坏死：红细胞的内源性过氧出血和坏死：红细胞的内源性过氧 化物酶，坏死细胞释放的内源性过氧化化物酶，坏死细胞释放的内源性过氧化 物酶均可出现假阳性反应。物酶均可出现假阳性反应。抗体的交叉反应。抗体的交叉反应。三、出

42、现假阴性的原因三、出现假阴性的原因固定时间过长，浸蜡、烤片温度过高，导致抗原丢失，固定时间过长，浸蜡、烤片温度过高，导致抗原丢失，固定时间过长，浸蜡、烤片温度过高，导致抗原丢失，固定时间过长，浸蜡、烤片温度过高，导致抗原丢失，无法补救。无法补救。无法补救。无法补救。固定液不合适或浓度不对，导致固定不佳。最好使用固定液不合适或浓度不对，导致固定不佳。最好使用固定液不合适或浓度不对，导致固定不佳。最好使用固定液不合适或浓度不对，导致固定不佳。最好使用10%10%10%10%中性福尔马林。中性福尔马林。中性福尔马林。中性福尔马林。抗体浓度过低。抗体浓度过低。抗体浓度过低。抗体浓度过低。孵育时间太短，

43、或孵育温度太低。孵育时间太短，或孵育温度太低。孵育时间太短，或孵育温度太低。孵育时间太短，或孵育温度太低。缓冲液缓冲液缓冲液缓冲液pHpHpHpH值不正确。值不正确。值不正确。值不正确。四、必须严格设置阳性对照和阴性对照。四、必须严格设置阳性对照和阴性对照。五、五、DABDAB有致癌性，用后不应随处倒弃。有致癌性，用后不应随处倒弃。n n1.Antigen retrieval 1.Antigen retrieval Proteolytic enzyme method and Heat-induced Proteolytic enzyme method and Heat-induced meth

44、odmethodn n2.Inhibition of endogenous tissue 2.Inhibition of endogenous tissue componentscomponents 3%H3%H2 2OO2 2,0.01%avidin,0.01%avidinn n3.Blocking of nonspecific sites 3.Blocking of nonspecific sites 10%normal serum 10%normal serum pretreatmentn nPositive Control It is to test for a protocol or

45、 procedure It is to test for a protocol or procedure used.used.It will be ideal to use the tissue of known It will be ideal to use the tissue of known positive as a control.positive as a control.n nNegative Control It is to test for the specificity of the It is to test for the specificity of the ant

46、ibody involved.antibody involved.ControlsExamplen n1.Prepareandfixtissue1.Prepareandfixtissuen n2.Antigenretrieval2.Antigenretrievaln n3.Suppressendogenousperoxidaseactivity3.Suppressendogenousperoxidaseactivityn n4.Blocknonspecificsitesinthetissues4.Blocknonspecificsitesinthetissuesn n5.Incubatethe

47、tissueswiththeprimaryantibody5.Incubatethetissueswiththeprimaryantibodyn n6.Incubatethetissueswiththesecondary6.Incubatethetissueswiththesecondaryantibodyantibodyn n7.IncubatethetissueswithSP7.IncubatethetissueswithSPn n8.AddDABandincubateuntildesiredstainingis8.AddDABandincubateuntildesiredstaining

48、isachievedachieved Troubleshooting1.WeakorNo Staining 2.Over-staining 3.HighBackground Weak or No Staining SourcesSourcesSolutionsSolutions InadequatedeparaffinizationInadequatedeparaffinization DeparaffinizesectionslongerorchangefreshxyleneDeparaffinizesectionslongerorchangefreshxyleneInactiveprima

49、ryantibodiesInactiveprimaryantibodiesReplacewithanewbatchofantibodiesReplacewithanewbatchofantibodiesAntibodiesdonotworkdueAntibodiesdonotworkduetoimproperstoragetoimproperstorageAliquotantibodiesintosmallervolumesandstoreinAliquotantibodiesintosmallervolumesandstoreinfreezer(-20to-70freezer(-20to-7

50、0)andavoidrepeatedfreezeand)andavoidrepeatedfreezeandthawcycles.thawcycles.AntibodyconcentrationwasAntibodyconcentrationwastoolowtoolowIncreasetheconcentrationofantibodies.OrrunaIncreasetheconcentrationofantibodies.Orrunaserialdilutiontesttodeterminetheoptimaldilutionserialdilutiontesttodeterminethe