《高效液相色谱》PPT课件.ppt
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1、High Performance Liquid Chromatography(HPLC)高效液相色谱技术与应用高效液相色谱技术与应用主要内容l l酸性和碱性样品酸性和碱性样品l l酸碱平衡与反相保留酸碱平衡与反相保留l l缓冲液的选择缓冲液的选择l lpKapKa与化合物结构的关系与化合物结构的关系l l离子样品反相分离的优化离子样品反相分离的优化l l选择性的控制选择性的控制l l离子对色谱离子对色谱l l保留机制保留机制l l初始实验初始实验l l控制保留值范围和选择性控制保留值范围和选择性l l离子交换色谱离子交换色谱l l离子交换色谱离子交换色谱l l保留机制保留机制l l方法建立方法
2、建立l l硅胶柱硅胶柱酸性样品和碱性样品l l为方便讨论,我们定义为方便讨论,我们定义“离子溶质离子溶质”为在通常为在通常pHpH范围内含范围内含有一个或一个以上酸性或碱性官能团的有机分子。有一个或一个以上酸性或碱性官能团的有机分子。l l在在HPLCHPLC分离条件下,离子电荷随分离条件下,离子电荷随pHpH发生变化的化合物简发生变化的化合物简单地称作酸或碱。单地称作酸或碱。l l在反相色谱(在反相色谱(RPCRPC)中,疏水化合物样品的保留值较大。)中,疏水化合物样品的保留值较大。当某种酸(当某种酸(HAHA)或碱()或碱(B B)发生解离,其疏水性将会大大)发生解离,其疏水性将会大大减弱
3、。因此在减弱。因此在RPCRPC中的保留值中的保留值k k可能下降可能下降10201020倍。倍。几乎所有与几乎所有与pH相关的保留值变化均发生于相关的保留值变化均发生于pKa值单位的值单位的pH值范围内值范围内缓冲液的选择l l最好先调节缓冲剂的pH,再加入有机溶剂。l l选择具体缓冲剂时,应切记的几种因素:l l缓冲容量缓冲容量l lUVUV吸收度吸收度l l其它性质:溶解度、稳定性、与样品和其它性质:溶解度、稳定性、与样品和/或色谱或色谱柱的相互作用、挥发性、对柱的相互作用、挥发性、对HPLCHPLC系统的腐蚀系统的腐蚀等等缓冲容量l l缓冲容量由缓冲容量由pHpH、缓冲、缓冲剂剂pKa
4、pKa及其浓度决定及其浓度决定l l与样品化合物的情况与样品化合物的情况类似,缓冲剂发生解类似,缓冲剂发生解离的离的pHpH范围为。只有范围为。只有在此在此pHpH范围内缓冲剂范围内缓冲剂才能有效地控制才能有效地控制pHpH值。值。l l1050mM1050mM浓度的缓冲浓度的缓冲剂对剂对RPCRPC分离一般足分离一般足够够pKa与化合物结构的关系l l若不知样品组分的若不知样品组分的pKapKa值,可以通过样品的分子结构估计值,可以通过样品的分子结构估计出。出。较好的流动相pHl l样品中最常见的酸或碱取代基-NH2、-N(CH3)2等、碱性杂环和羧酸(-COOH)基团。l l与pH有关的保
5、留值变化最可能发生于pH36的范围内,不包括烷基胺化合物。l l无论已知还是未知样品,开始RPC方法建立时最好选用pH微小改变不影响分离的流动相(pH3)哪种HPLC法对离子样品最合适l lRPCRPC具有简单、应用范围广和较好的柱性能等特具有简单、应用范围广和较好的柱性能等特点,通常是首先的分离模式。点,通常是首先的分离模式。l l若分离不够理想,还可考虑在流动相中加入离子若分离不够理想,还可考虑在流动相中加入离子对试剂。对试剂。l l在离子对试剂浓度由零变至最大值时,会有在离子对试剂浓度由零变至最大值时,会有RPCRPCIPCIPC保留值的连续变化。所以起初的保留值的连续变化。所以起初的R
6、PCRPC实验实验有助于后面有助于后面IPCIPC分离条件的优化选择。分离条件的优化选择。l l对特殊分离目的,可以考虑从离子对或离子交换对特殊分离目的,可以考虑从离子对或离子交换色谱开始。色谱开始。优化离子样品的相分离l l离子样品反相分离的方法建立与中性样品有些相似,主要离子样品反相分离的方法建立与中性样品有些相似,主要差异为需用:差异为需用:l l经经pHpH缓冲的流动相缓冲的流动相l l硅羟基效应最小的反相柱硅羟基效应最小的反相柱l l当首次开始当首次开始HPLCHPLC方法建立时,并不知道合适的分离是否方法建立时,并不知道合适的分离是否需要改变需要改变pHpH,所以初始实验的流动相,
7、所以初始实验的流动相pHpH3 3最好。最好。l l下一步通过调节流动相强度(下一步通过调节流动相强度(%B%B),以使样品具有合适的),以使样品具有合适的保留值范围保留值范围0.5k200.5k20。l l离子样品不大可能被强保留,很可能获得较宽的离子样品不大可能被强保留,很可能获得较宽的k k值范围。因此方值范围。因此方法建立的最佳方案是初始运行用梯度洗脱。法建立的最佳方案是初始运行用梯度洗脱。l l梯度选用宽范围(如梯度选用宽范围(如5%5%100%B100%B),必须注意避免高),必须注意避免高%B%B时析出时析出缓冲盐缓冲盐l l调整峰间距,即尽量扩大样品的分离度或降价保留值范围,调
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