生物制药工艺学第10章离心技术.ppt

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1、第九章第九章 离心技术离心技术本章要求：本章要求：v基本概念：基本概念：v离心力，相对离心力，沉降速度，沉降系数。离心力，相对离心力，沉降速度，沉降系数。v掌握掌握：v相对离心力的计算相对离心力的计算v螺旋卸料离心机的特点螺旋卸料离心机的特点v影响沉降速度的因素影响沉降速度的因素v制备型离心机常用的转子制备型离心机常用的转子v差分离心法差分离心法v速度区带离心法及其特点，等密度离心法及其特点速度区带离心法及其特点，等密度离心法及其特点.v密度梯度离心常用的介质有哪几类：密度梯度离心常用的介质有哪几类：v密度梯度的制备方法密度梯度的制备方法v梯度的回收方法梯度的回收方法v了解：分析型离心技术：了

2、解：分析型离心技术：第一节第一节 基本原理和设备基本原理和设备一、沉降和离心一、沉降和离心 沉降作用：悬浮液静置时，在重力作用下，密度大沉降作用：悬浮液静置时，在重力作用下，密度大于周围溶液的固体颗粒逐渐下沉。于周围溶液的固体颗粒逐渐下沉。漂浮作用：漂浮作用：影响沉降的因素：颗粒大小、颗粒密度、溶液黏度影响沉降的因素：颗粒大小、颗粒密度、溶液黏度 离心技术离心技术:利用旋转产生的离心力代替重力，加速固利用旋转产生的离心力代替重力，加速固体沉降速度的一种分离方式体沉降速度的一种分离方式。离心技术有多种形式：离心技术有多种形式：1 1离心沉降离心沉降2 2离心过滤离心过滤3 3离心分离离心分离4离

3、心分析离心分析二二 离心力离心力 1 1 离心力离心力（centrifugal forcecentrifugal force，FcFc）：）：在一定角度速度下作圆周运动的任何物体都在一定角度速度下作圆周运动的任何物体都受到的向外的力。离心力（受到的向外的力。离心力（FcFc）的大小等于离的大小等于离心加速度心加速度2 2r r与颗粒质量与颗粒质量m m的乘积，即：的乘积，即：F=mF=m2 2r r相对离心力相对离心力（relative centrifugal force，RCF）由于各种离心机转子的半径或者离心管）由于各种离心机转子的半径或者离心管至旋转轴中心的距离不同，在相同转速下离心至旋

4、转轴中心的距离不同，在相同转速下离心力会变化，力会变化，RCF就是实际离心场转化为重力加就是实际离心场转化为重力加速度的倍数。速度的倍数。式中式中r为离心转子的半径距离，以为离心转子的半径距离，以cm为单位；为单位；g为地球重力加速度（为地球重力加速度（980cm/sec2）；）；N为转为转子每分钟的转数（子每分钟的转数（rpm）。）。三三 沉降速度沉降速度 即在离心力作用下，物质粒子于单位时间即在离心力作用下，物质粒子于单位时间内沿离心力方向移动的距离。内沿离心力方向移动的距离。四四沉降系数沉降系数 在在单单位位离离心心力力场场中中，颗颗粒粒的的沉沉降降速速度度谓谓之之“沉降系数沉降系数”五

5、五 沉降时间沉降时间 六六 转子常数转子常数 七 分子量计算八、离心机（一）离心机的分类（一）离心机的分类1 1按转速高低及是否有冷冻来分按转速高低及是否有冷冻来分（1 1）普通离心机，小于）普通离心机，小于60006000rpmrpm（2 2）高速离心机，）高速离心机，80008000-25000rpm-25000rpm（3 3）超速离心机，）超速离心机，2500025000-80000rpm-80000rpm2 2按结构分类按结构分类（1 1）台式离心机（）台式离心机（2 2）立式离心机）立式离心机（3 3）沉沉降降式式离离心心机机（4 4）转转头头式式离离心心机机（5 5）电电动动式式离

6、离心机心机3 3按工作性质分类按工作性质分类（1 1）制备型离心机）制备型离心机（2 2）实验室用离心机，）实验室用离心机，4 4按操作方式分类按操作方式分类（1 1）连续离心机）连续离心机 。（2）人工卸料（出渣）离心机；）人工卸料（出渣）离心机；（3 3）自动卸料离心机（如螺旋式离心机）自动卸料离心机（如螺旋式离心机）（二）常用离心机（二）常用离心机1 普通离心机普通离心机2管式高速离心机管式高速离心机原理：原理：应用：液固，液液，发酵工程酶工程中分离菌应用：液固，液液，发酵工程酶工程中分离菌体体v3 蝶片式离心机v4 离心过滤机离心过滤机v5 卧式螺旋卸料沉降离心机卧式螺旋卸料沉降离心机

7、6 冷冻高速、超速离心机第二节第二节 制备型超离心技术制备型超离心技术一、离心设备一、离心设备（一）（一）转子转子1 角度转子角度转子2 水平转子水平转子3 区带转子区带转子4 垂直管转子垂直管转子5 连续离心转子连续离心转子 6 细胞洗脱转子细胞洗脱转子（二）离心管（二）离心管 由管体和盖组件两部分组成由管体和盖组件两部分组成 二、离心方法二、离心方法 差分离心（离心沉降）、密度离心法（离心分离）差分离心（离心沉降）、密度离心法（离心分离）（一）（一）差分离心差分离心概念：概念：差差分分离离心心法法亦亦称称为为“差差速速离离心心法法”，是是依依据据不不同同大大小小和和密密度度的的颗颗粒粒在在

8、离离心心力力场场中中沉沉降降速速度度的的不不同同进进行离心分离的一项技术。行离心分离的一项技术。过过程程是是将将样样品品溶溶液液在在一一定定离离心心力力场场中中离离心心一一定定时时间间使使颗颗粒粒大大组组分分沉沉降降于于管管底底，上上层层液液再再用用加加大大的的离离心心力力场场离离心心一一定定时时间间，又又可可获获得得中中等等大大小小的的组组分分。如如此此依依次次提提高高离离心心力力，逐逐级级分分离离出出所所需需组组分分，故故称称其为差分离心法。其为差分离心法。用途：用途：差差速速离离心心的的分分辨辨率率不不高高，沉沉降降系系数数在在同同一一个个数数量量级级内内的的各各种种粒粒子子不不容容易易

9、分分开开，常常用用于于颗颗粒粒或或密密度度差差别别较较大大的的组组分分的的分分离离，或或其其他他分分离离手手段段之之前前的粗制品提取。的粗制品提取。（二）（二）速度区带离心法速度区带离心法概念：概念：又称速率区带离心法或分级区带离心法。离心操又称速率区带离心法或分级区带离心法。离心操作时将样品液置于连续或不连续，线性或非线性密度作时将样品液置于连续或不连续，线性或非线性密度梯度液上梯度液上（如蔗糖、甘油、（如蔗糖、甘油、KBr、CsCl等）等），控制，控制离心时间，离心时间，使具有不同沉降速度的粒子处于不同的密使具有不同沉降速度的粒子处于不同的密度梯度层内分成一系列区带，从而达到彼此分离的目度

10、梯度层内分成一系列区带，从而达到彼此分离的目的。这种离心方法称速度区带离心法。的。这种离心方法称速度区带离心法。特点：特点：（1 1）样品加于梯度介质的顶部、离心时间须严格控制。）样品加于梯度介质的顶部、离心时间须严格控制。（2 2）介介质质的的密密度度亦亦须须严严格格掌掌握握：梯梯度度最最大大值值组组分分最最小密度。小密度。（3 3）样品的密度梯度密度最小值。）样品的密度梯度密度最小值。（4 4）分离依据是各组分之沉降系数差。）分离依据是各组分之沉降系数差。（5 5）分分辨辨率率受受组组分分沉沉降降系系数数，离离心心时时间间，颗颗粒粒扩扩散散系系数，介质粘度及梯度范围和形状的影响。数，介质粘

11、度及梯度范围和形状的影响。用途：用途：本本法法适适于于分分离离颗颗粒粒大大小小不不同同而而密密度度相相近近或或相相同同的的组组分分，如如DNADNA与与RNARNA混混合合物物、核核蛋蛋白白体体亚亚单单位位及及线线粒粒体体、溶溶酶酶体及过氧化物酶体等。体及过氧化物酶体等。Ficoll密度梯度离心法分离外周血单核细胞密度梯度离心法分离外周血单核细胞 (一一)原理原理:红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞离心后漂浮于分层液的液面上，吸取分层液液面的细核细胞离心后漂浮于分层液的液面上，吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单核

12、细胞。胞，就可从外周血中分离到单核细胞。(二二)方法方法:1.1.在短管中加入适量细胞分离液。在短管中加入适量细胞分离液。2.2.取肝素抗凝静脉血，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液取肝素抗凝静脉血，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面。离心面上，注意保持清楚的界面。离心2000rpm202000rpm20分钟。分钟。3.3.离心后管内分为三层，上层为血浆，下层主要为红细离心后管内分为三层，上层为血浆，下层主要为红细胞和粒细胞。中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有胞和粒细胞。中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单核细胞为主的白色云雾层狭窄带，单个核细胞包括淋一以单核细胞为

13、主的白色云雾层狭窄带，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。巴细胞和单核细胞。4.4.用毛细血管插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另一用毛细血管插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另一短中管中，加入倍以上体积的短中管中，加入倍以上体积的HanksHanks液或液或RPMI1640RPMI1640，1500rpm101500rpm10分钟，洗涤细胞两次分钟，洗涤细胞两次。（三）（三）等密度离心法等密度离心法概念：概念：离离心心力力作作用用下下，不不同同密密度度的的多多组组分分颗颗粒粒在在梯梯度度介介质质中中“向向上上”或或“向向下下”移移动动，当当移移动动至至其其密密度度与与介介质质密密度度相相等等的的位

14、位置置便便不不再再移移动动，形形成成静静止止区区带带，即即达达到到离离心心平平衡衡，各各组组分分按按密密度度不不同同处处于于区区带带的的不不同同位位置置。该该离离心心方方法法称称等等密密度度离心法。离心法。特点：特点：（1 1）加样位置不拘。）加样位置不拘。（2 2）离离心心平平衡衡后后，区区带带的的位位置置、形形状状、不不受受离离心心时时间间影响。影响。（3 3）梯梯度度的的密密度度范范围围应应包包括括样样品品中中所所有有组组分分颗颗粒粒之之密密度。度。（4 4）分分离离依依据据是是颗颗粒粒组组分分间间密密度度的的差差异异，与与颗颗粒粒大大小小，形状无关。形状无关。（5 5）离离心心力力大大

15、小小，组组分分颗颗粒粒的的大大小小和和形形状状，介介质质密密度度梯度的斜率和形状，粘度影响离心时间和分辨率。梯度的斜率和形状，粘度影响离心时间和分辨率。Percoll 非连续等密度梯度离心法纯化牛肾上腺嗜铬细胞非连续等密度梯度离心法纯化牛肾上腺嗜铬细胞v疼痛和帕金森病，体外无增殖能力，只能依赖于肾上腺髓质疼痛和帕金森病，体外无增殖能力，只能依赖于肾上腺髓质的分离来获取。的分离来获取。v实验动物年龄在实验动物年龄在1 岁左右的健康小公牛，体重约岁左右的健康小公牛，体重约200 400 kg,v取小公牛肾上腺，取小公牛肾上腺，D-Hanks 溶液冲洗后，肾上腺充分消化溶液冲洗后，肾上腺充分消化后剥

16、除皮质，将髓质剪碎成后剥除皮质，将髓质剪碎成1 mm左右的小块，滴加少量左右的小块，滴加少量DHanks液以保持髓质的营养，将滤过的细胞悬液在液以保持髓质的营养，将滤过的细胞悬液在100 g 下离心下离心8min，将细胞悬液离心后与密度为将细胞悬液离心后与密度为1.090 g/ml 的的Percoll 溶液混溶液混合，加入离心管底部，在其上分别缓慢加入密度为合，加入离心管底部，在其上分别缓慢加入密度为1.064 g/ml、1.034 g/ml、1.019 g/ml 的的Percoll 溶液，室温下离溶液，室温下离心，心，200 g，20min。收集介于密度为。收集介于密度为1.064 g/ml

17、 与与1.034 g/ml 的两层的两层Percoll溶液界面之间的细胞，加入溶液界面之间的细胞，加入D-Hanks 液混悬后，在液混悬后，在100 g 下离心洗涤下离心洗涤2 次，每次次，每次8 min。得细胞。得细胞。五、密度梯度技术五、密度梯度技术（一）（一）密度梯度的作用密度梯度的作用:1.增加分离层次，提高分辨率。增加分离层次，提高分辨率。2.防止温差及振动造成的影响。防止温差及振动造成的影响。（二）（二）对密度梯度的基本要求对密度梯度的基本要求 1 1 梯度介质应自身密度大，且溶解度足够大，以便制作出密梯度介质应自身密度大，且溶解度足够大，以便制作出密度范围大的密度梯度。度范围大的

18、密度梯度。2 2 理理化化性性质质稳稳定定，生生物物惰惰性性；离离子子强强度度低低，渗渗透透压压小小，粘粘度度小。小。3 3 具具某某种种可可测测性性（如如折折射射率率）以以测测其其浓浓度度（密密度度），但但不不干干扰分离组分的测定。扰分离组分的测定。4 便于除去或回收。此外还有纯度，价格等因素。便于除去或回收。此外还有纯度，价格等因素。(三三)密度梯度的设计密度梯度的设计1梯度介质的选用梯度介质的选用:(1)盐梯度介质盐梯度介质(2)小分子有机物如蔗糖小分子有机物如蔗糖(3)三碘化苯衍生物三碘化苯衍生物(4)有机高聚物有机高聚物(5)胶态二氧化硅胶态二氧化硅六六:常见的密度梯度材料及应用常见

19、的密度梯度材料及应用 蔗糖：水溶性大，性质稳定，渗透压较高，蔗糖：水溶性大，性质稳定，渗透压较高，其最高密度可达，且由于价格低容易制备，是其最高密度可达，且由于价格低容易制备，是现在实验室里常用于细胞器、病毒、现在实验室里常用于细胞器、病毒、RNA分离分离的梯度材料，但由于有较大的渗透压，不宜用的梯度材料，但由于有较大的渗透压，不宜用于细胞的分离。于细胞的分离。聚蔗糖：商品名聚蔗糖：商品名Ficoll，常采用，常采用Ficoll-400也也就是相对分子重量为就是相对分子重量为400000，Ficoll渗透压低，渗透压低，但它的粘度却特别高，为此常与泛影葡胺混合但它的粘度却特别高，为此常与泛影葡

20、胺混合使用以降低粘度。主要用于分离各种细胞包括使用以降低粘度。主要用于分离各种细胞包括血细胞、成纤维细胞、肿瘤细胞、鼠肝细胞等。血细胞、成纤维细胞、肿瘤细胞、鼠肝细胞等。氯化铯：是一种离子性介质、水溶性大，最氯化铯：是一种离子性介质、水溶性大，最高密度可达。由于它是重金属盐类，在离心时高密度可达。由于它是重金属盐类，在离心时形成的梯度有较好的分辨率，被广泛地用于形成的梯度有较好的分辨率，被广泛地用于DNA、质粒、病毒和脂蛋白的分离，但价格较、质粒、病毒和脂蛋白的分离，但价格较贵。贵。卤化盐类：卤化盐类：KBr和和NaCl可用于脂蛋白分离，可用于脂蛋白分离，KI和和NaI可用于可用于RNA分离其

21、高于铯盐。分离其高于铯盐。NaCl梯度也可用梯度也可用于分离脂蛋白，于分离脂蛋白，NaI梯度可分离天然或变性的梯度可分离天然或变性的DNA。Percoll：是商品名，它是一种：是商品名，它是一种SiO2胶体外面包胶体外面包了一层聚乙烯吡咯酮（了一层聚乙烯吡咯酮（PVP），渗透压低，它对生），渗透压低，它对生物材料的影响小，而且颗粒稳定，在冷却和冻融情物材料的影响小，而且颗粒稳定，在冷却和冻融情况下还是稳定的，其粘度高，且在酸性况下还是稳定的，其粘度高，且在酸性pH和高离子和高离子强度下不稳定。它可用于细胞、细胞器和病毒的分强度下不稳定。它可用于细胞、细胞器和病毒的分离。离。2梯度的密度范围梯度

22、的密度范围3梯度的形状梯度的形状4梯度的容量梯度的容量5线性梯度的斜率线性梯度的斜率(结合离子交换的条件研究结合离子交换的条件研究)（二）（二）梯度的制备梯度的制备1 手工制备法手工制备法 2 梯度混合仪制备法梯度混合仪制备法3 离心形成法离心形成法4 反复冻融法反复冻融法离心操作（一）加样和离心（一）加样和离心 样品准备样品准备:加样加样:离心离心:（二）（二）梯度的取出与收集梯度的取出与收集取代法、穿刺法、切割法、虹吸法。取代法、穿刺法、切割法、虹吸法。C:梯度分析梯度分析:测定梯度浓度意义测定梯度浓度意义梯度测定法梯度测定法样品测定样品测定E:离心制备的步骤离心制备的步骤:组织组织-匀浆

23、匀浆-过滤过滤-分级离心分级离心-梯度离心梯度离心F:制备超离心注意事项制备超离心注意事项:注意平衡注意平衡查阅目的物信息查阅目的物信息第三节第三节 分析型超速离心法分析型超速离心法与制备用机型的不同点：与制备用机型的不同点：1由由于于盛盛液液器器（离离心心池池）有有“光光学学窗窗口口”，故故受受材材料强度限制，允许转速略低，在料强度限制，允许转速略低，在80000以内使用。以内使用。2转转速速与与温温度度直直接接影影响响测测定定数数据据，必必须须控控制制很很严严：转速偏差转速偏差1.5，温差，温差 3附有动态光学检测，数据分析系统。附有动态光学检测，数据分析系统。分析超离心的方法分析超离心的

24、方法 分为沉降速度法和沉降平衡法分为沉降速度法和沉降平衡法.沉降速度法据颗粒在离心场中移动速度沉降速度法据颗粒在离心场中移动速度来测定其沉降系数、分子量或纯度等的方来测定其沉降系数、分子量或纯度等的方法称沉降速度法法称沉降速度法.沉降平衡法沉降平衡法 用沉降平衡过程测定生物大分子的沉降系数用沉降平衡过程测定生物大分子的沉降系数或分子量的方法称沉降平衡法。或分子量的方法称沉降平衡法。特点：低转速下的离心分析法，时间长（数小特点：低转速下的离心分析法，时间长（数小时至数日）时至数日）超速分析离心的应用超速分析离心的应用1 对生物大分子均一性估计对生物大分子均一性估计2 生物分子形状、大小、水合程度的估计生物分子形状、大小、水合程度的估计3 生物分子构象变化的检测生物分子构象变化的检测