《蛋白质与蛋白组学》PPT课件.ppt

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1、第三章第三章Protein，proteomeandproteomics蛋白质、蛋白质组与蛋白质组学蛋白质、蛋白质组与蛋白质组学ProteinProtein是执行生命功能的大分子是执行生命功能的大分子 结构蛋白、运输蛋白、信号蛋白、调节蛋白、马达蛋白结构蛋白、运输蛋白、信号蛋白、调节蛋白、马达蛋白结构蛋白、运输蛋白、信号蛋白、调节蛋白、马达蛋白结构蛋白、运输蛋白、信号蛋白、调节蛋白、马达蛋白一、蛋白质的化学组成一、蛋白质的化学组成二、二、蛋白质分子结构蛋白质分子结构三、蛋白质结构与功能的关系三、蛋白质结构与功能的关系四、蛋白质的分离纯化四、蛋白质的分离纯化五、蛋白质的理化性质五、蛋白质的理化性质

2、六、蛋白质分子序列及空间结构分析六、蛋白质分子序列及空间结构分析第一节第一节 蛋白质的结构与功能蛋白质的结构与功能一、蛋白质分子的化学组成蛋白质分子的化学组成 C C、H H、O O、N N、S S等普遍存在，部分蛋白质等普遍存在，部分蛋白质含有含有P P、SeSe或其他金属元素。或其他金属元素。蛋白质的蛋白质的N N元素含量较为稳定，平均含氮元素含量较为稳定，平均含氮量约为量约为1616 N N N N克数克数克数克数/每克样品每克样品每克样品每克样品6.25100=6.25100=6.25100=6.25100=蛋白质含量（蛋白质含量（蛋白质含量（蛋白质含量（g%g%g%g%）(一一)组成

3、蛋白质的氨基酸种类组成蛋白质的氨基酸种类n n体内体内PrPr由由2020种种-氨基酸氨基酸（aminoacidAA）构成。构成。n n除除GlyGly外，均为外，均为L-AAAA侧链侧链COO-HCNH3+R根据根据 R 不同不同将将20种种AA分为四类分为四类：非极性疏水性氨基酸非极性疏水性氨基酸极性中性氨基酸极性中性氨基酸酸性氨基酸酸性氨基酸碱性氨基酸碱性氨基酸 非极性疏水性非极性疏水性AAAAAA的的R R侧链侧链是是脂肪烃脂肪烃或或芳香烃芳香烃-疏水基团。疏水基团。烃链越长疏水性越大。烃链越长疏水性越大。存在部位：常因相互疏水作用而处于存在部位：常因相互疏水作用而处于球状蛋球状蛋 白

4、内部白内部或生物膜的或生物膜的跨膜双脂层中跨膜双脂层中。极性、中性极性、中性AA（不解离极性不解离极性AAAA）AAAA的的R R侧链侧链是带有是带有极性的烃基极性的烃基、巯基巯基和和酰胺基团酰胺基团，故有，故有 亲水性，但不解离亲水性，但不解离.酸性酸性AA特点：特点：R R侧链侧链含有含有羧基羧基，可解离而带负电荷可解离而带负电荷 -C-C上有一个羧基（上有一个羧基（COOCOO-)外，外，R R基上还基上还 含有一个含有一个羧基羧基.碱性碱性AA特点：特点：AAAA的的R R基基都含有碱性基团都含有碱性基团-有有氨基氨基、胍基胍基和和 咪唑基咪唑基，可解离而带正电荷。，可解离而带正电荷。

5、酸性酸性AAAA和碱性和碱性AA-AA-解离的极性解离的极性AAAA 5 5种种在蛋白质分子内在蛋白质分子内带正电荷的碱性带正电荷的碱性AAAA残基残基常与常与带负电荷的带负电荷的酸性酸性AAAA的残基的残基形成形成盐键盐键。存在部位：在蛋白质分子的表面，与环境中水分子形成存在部位：在蛋白质分子的表面，与环境中水分子形成 氢键。氢键。(二二)氨基酸的理化性质氨基酸的理化性质+H+-H+-H+H+1.氨基酸是两性电解质氨基酸是两性电解质AAAA等电点等电点（isoelectric pH,pI）当溶液的当溶液的pHpH值达到某一特定值时，值达到某一特定值时，AAAA所所带带正负电荷相等正负电荷相等

6、，AAAA分子分子净电荷为零净电荷为零，对外不显电，对外不显电性时溶液的性时溶液的pHpH值称之。值称之。分子的水溶性分子的水溶性 AA由于侧链极性不同而导致在亲水环境中溶解度由于侧链极性不同而导致在亲水环境中溶解度不同，据此将不同，据此将AA分为：分为：亲水类：亲水类：Arg/Asp/Asn/Glu/Gln/Cys/Gly/His/Lys/Thr/Ser 疏水类：疏水类：Ala/Ile/Leu/Met/Phe/Pro/Trp/Tyr/ValAA的侧链可以直接影响Pr或者多肽链的空间折叠方式。胞质蛋白中富含疏水氨基酸的构成肽段大多折叠于蛋白质分子的内部，而亲水氨基酸构成肽段则排列于蛋白质表面。

7、3.部分部分AA有紫外吸收峰有紫外吸收峰 色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸都有芳香环侧链，其中的共轭双都有芳香环侧链，其中的共轭双键可以在键可以在280nm的紫外线形成吸的紫外线形成吸收峰收峰，可作为分析样品中，可作为分析样品中Pr含量含量的方法。的方法。4.茚三酮反应茚三酮反应 茚三酮和茚三酮和-AA共热，共热，AA脱去其脱去其氨基和氨基和羧基，茚羧基，茚三酮被还原，产物可以和脱下的氨基再结合一分子茚三三酮被还原，产物可以和脱下的氨基再结合一分子茚三酮形成蓝紫色化合物，在酮形成蓝紫色化合物，在570nm具吸收峰，由于吸光度具吸收峰，由于吸光度与与AA脱氨量有关，可据此测定脱氨

8、量有关，可据此测定AA含量含量.5.成肽反应成肽反应 AA之间可以通过之间可以通过氨基氨基和和羧基羧基脱水缩合形成酰胺结构，脱水缩合形成酰胺结构，连接的化学键叫做连接的化学键叫做肽键肽键（peptidebond）二、蛋白质分子的结构二、蛋白质分子的结构 蛋白质或多肽是蛋白质或多肽是AA的聚合体，氨基酸通过肽键的聚合体，氨基酸通过肽键连接形成肽连接形成肽（peptide）。）。肽平面肽平面:肽中肽中AA之间肽键的六个原子在同一平面，连接羧之间肽键的六个原子在同一平面，连接羧基的基的1碳原子和连接氨基的碳原子和连接氨基的2碳原子在对角位置碳原子在对角位置。Motif模体结构域Pr的二级结构（的二级

9、结构（secondary structure）：）：Pr分子中某一段肽链的局部空间结构，即该段肽链的主链骨架分子中某一段肽链的局部空间结构，即该段肽链的主链骨架原子的相对空间位置，不涉及原子的相对空间位置，不涉及AA侧链的构象侧链的构象化学键：化学键：H H 键键螺旋（helix）、折叠（sheet）、转角（turn）、无规卷曲（random coil）蛋白质的一级结构（蛋白质的一级结构（primary structure）：肽链中肽链中AA残基（残基（residue）的排列次序。）的排列次序。化学键：化学键：肽键、二硫键肽键、二硫键空间结构的折叠需要分子伴侣的参与空间结构的折叠需要分子伴侣的

10、参与螺旋结构折叠转角转角1与3氨基酸残基之间形成氢键。17蛋白质的超二级结构和结构域蛋白质的超二级结构和结构域超二级结构超二级结构(supersecondary structure(supersecondary structure）*：由相邻的几个二级结构相互作用形成有规则的组合体。由相邻的几个二级结构相互作用形成有规则的组合体。是特殊的序列或结构的基本组成单元，又称是特殊的序列或结构的基本组成单元，又称基序基序或或模序模序（motif)*.motif)*.可进一步组建成可进一步组建成结构域。结构域。超二级结构超二级结构包括：包括：、组合。组合。钙结合蛋白中结合钙离子钙结合蛋白中结合钙离子的模

11、序的模序锌指结构蛋白质的三级结构tertiarystructure一条完整多肽链全部氨基酸的相对空间位置 化学键：氢键、疏水作用、离子键、范德华力化学键：氢键、疏水作用、离子键、范德华力结构域结构域(domain)：在超二级结构的基础上进一步组合折叠形成在超二级结构的基础上进一步组合折叠形成半独立较紧密的球状结构，半独立较紧密的球状结构，具有简单的生物学功能。具有简单的生物学功能。结构域是多肽链的一个结构域是多肽链的一个部分部分,它们可用限制性蛋白它们可用限制性蛋白酶从多肽链上切割下来而酶从多肽链上切割下来而不改变其性质。不改变其性质。结构域的组合就形成结构域的组合就形成了了Pr的完整三级结构

12、。的完整三级结构。催化结构域NADNAD+结合结构域结合结构域19 结构域有两个重要的功能结构域有两个重要的功能*：第一，像亚基那样，能作为一个第一，像亚基那样，能作为一个模式结构模式结构模式结构模式结构来有效地参与来有效地参与 蛋白质分子的装配。蛋白质分子的装配。独立结构域的存在可以把蛋白质肽链的折叠、盘独立结构域的存在可以把蛋白质肽链的折叠、盘 曲过程简化为个别的简单步骤。曲过程简化为个别的简单步骤。这对于分子量很大的蛋白质来说更显得特别重要。这对于分子量很大的蛋白质来说更显得特别重要。第二，结构域能够活动。对底物的结合、变构控制以及第二，结构域能够活动。对底物的结合、变构控制以及 巨大结

13、构的装配具有决定作用。巨大结构的装配具有决定作用。蛋白质的四级结构蛋白质的四级结构 蛋白质四级结构（蛋白质四级结构（quaternary structurequaternary structure）指的）指的具有几条肽链的蛋白质各条肽链的空间布局具有几条肽链的蛋白质各条肽链的空间布局 化学键：化学键：各亚基之间主要靠各亚基之间主要靠疏水作用疏水作用相互结合，相互结合，氢键氢键、离子键和范得华力离子键和范得华力也参与四级结构的维持。也参与四级结构的维持。亚基（亚基（subunitsubunit）：）：蛋白质四级结构中蛋白质四级结构中独立结构的肽链独立结构的肽链 四级结构的蛋白质，单四级结构的蛋白

14、质，单独的亚基没有生物活性独的亚基没有生物活性三、蛋白质分子结构和功能的关系三、蛋白质分子结构和功能的关系蛋白质一级结构是空间结构的基础蛋白质一级结构是空间结构的基础 特定的空间构象主要是由蛋白质分子中肽链和特定的空间构象主要是由蛋白质分子中肽链和侧链侧链R R基团形成的次级键来维持基团形成的次级键来维持一级结构相似的蛋白质，其构象及功能也相似一级结构相似的蛋白质，其构象及功能也相似 促肾上腺皮质激素促肾上腺皮质激素(ACTH)(ACTH)和促黑激素和促黑激素(MSH)(MSH)均均 为垂体分泌的多肽激素。为垂体分泌的多肽激素。ACTH 4ACTH 41010位的氨基酸结构与位的氨基酸结构与M

15、SHMSH的的11111717位一样，故位一样，故ACTHACTH有较弱的有较弱的MSHMSH的生理作用的生理作用Pr一级结构中参与功能活性的残基一级结构中参与功能活性的残基(关键部位关键部位)，发生异常，发生异常改变其功能。改变其功能。镰状镰状RBCRBC贫血贫血(GluGluVal)Val)22镰刀型红细胞性贫血：镰刀型红细胞性贫血：*仅发生在一级结构中：仅发生在一级结构中：6Glu换成换成6Val由此引起：由此引起：三级结构多一疏水键，三级结构多一疏水键，四级结构发生线性缔合四级结构发生线性缔合结果：导致红细胞发生溶血结果：导致红细胞发生溶血 蛋白质的功能与其空间构象密切相关蛋白质的功能

16、与其空间构象密切相关 构象发生变化，其功能活性也随之改变：构象发生变化，其功能活性也随之改变：在生物体内，当某种物质特异地与蛋白质分子的在生物体内，当某种物质特异地与蛋白质分子的某个部位结合，触发该蛋白质的构象发生一定变化，某个部位结合，触发该蛋白质的构象发生一定变化，从而导致其功能活性的变化，这种现象称为从而导致其功能活性的变化，这种现象称为蛋白质的蛋白质的别构效应别构效应(allostericallosteric effect)effect)。如：寡聚蛋白质的一个亚基和配体结合后改变了构象，这种构如：寡聚蛋白质的一个亚基和配体结合后改变了构象，这种构象的变化传递可影响其他的亚基构象，进而改

17、变了分子的生物学象的变化传递可影响其他的亚基构象，进而改变了分子的生物学活性。活性。协同作用协同作用-各亚基之间的相互作用各亚基之间的相互作用 是通过亚基间构象改变的传递作用产生的。是通过亚基间构象改变的传递作用产生的。正协同效应：正协同效应：如果如果1 1个亚基和配体结合，使另个亚基和配体结合，使另1 1个亚个亚 基与配体的结合更容易了基与配体的结合更容易了 负协同效应负协同效应：若亚基结合的配体相同，为同种协同：若亚基结合的配体相同，为同种协同 效应，如配体不同则为异种协同效应效应，如配体不同则为异种协同效应蛋白质的结构与功能之间的关系主要表现在两方面：蛋白质的结构与功能之间的关系主要表现

18、在两方面：1.1.蛋白质的高级结构是由一级结构氨基酸顺序决定的。蛋白质的高级结构是由一级结构氨基酸顺序决定的。2.2.蛋白质的高级结构是蛋白质分子发挥其生物功能的重蛋白质的高级结构是蛋白质分子发挥其生物功能的重 要保证。要保证。四、蛋白质的理化性质四、蛋白质的理化性质(一一)蛋白质的两性解离蛋白质的两性解离 蛋白质除了蛋白质除了N N端的氨基和端的氨基和C C端的羧基可以解端的羧基可以解离外，侧链中的某些基团在一定离外，侧链中的某些基团在一定pHpH环境下也可环境下也可以解离以解离 蛋白质分子所带电荷状况决定于特定蛋白质分子所带电荷状况决定于特定pHpH环环境下所有氨基酸残基可解离集团的的荷电

19、情况境下所有氨基酸残基可解离集团的的荷电情况。蛋白质的等电点蛋白质的等电点（pI）：）：当蛋白质分子在某一当蛋白质分子在某一pH值的溶液中解离成值的溶液中解离成正、负离子的趋势相等，成为兼性离子，净电正、负离子的趋势相等，成为兼性离子，净电荷为零时溶液的荷为零时溶液的pH值值(二二)蛋白质的胶体性质蛋白质的胶体性质 蛋白质分子具有胶粒蛋白质分子具有胶粒m)m)的特性。的特性。其溶液稳定原因：其溶液稳定原因：1.1.表面常是亲水表面常是亲水AAAA，可以结合水分子在蛋白，可以结合水分子在蛋白 质表面形成一层质表面形成一层水化膜水化膜，从而阻断蛋白质分，从而阻断蛋白质分 子相互靠近聚集，防止蛋白质

20、析出。子相互靠近聚集，防止蛋白质析出。2.2.由于蛋白质带有电荷，由于蛋白质带有电荷，同种电荷相互排斥同种电荷相互排斥 使得蛋白质不能聚集。使得蛋白质不能聚集。(三三)蛋白质的变性、沉淀和凝固蛋白质的变性、沉淀和凝固 变性：变性：在某些理化因素作用下，在某些理化因素作用下，PrPr空间构象被破坏从而空间构象被破坏从而导致其理化性质的改变和生物活性的丧失导致其理化性质的改变和生物活性的丧失-蛋白质的蛋白质的变性（变性（denaturationdenaturation）。）。主要破坏二硫键和次级键，不涉及肽键。主要破坏二硫键和次级键，不涉及肽键。加热、乙醇等有机溶剂、强酸强碱、重金属等可以加热、乙

21、醇等有机溶剂、强酸强碱、重金属等可以使蛋白质发生变性。使蛋白质发生变性。复性：复性：蛋白质变性如果程度较轻，在去除变性因素后蛋白质变性如果程度较轻，在去除变性因素后恢复或者部分恢复其原有的构象和功能恢复或者部分恢复其原有的构象和功能-复性复性 （renaturationrenaturation）蛋白质经强酸强碱变性后仍可以溶解于强酸强碱溶液中，将pH值调至等电点时，变性蛋白质立即变成絮状物，此絮状物仍可以溶解于强酸强碱溶液中，再加热时絮状物变为坚固的凝块，此凝块不再溶于强酸强碱，称为蛋白质的凝固（coagulation）蛋白质的沉淀、凝固蛋白质的沉淀、凝固 变性的蛋白质肽链之间相互缠绕聚集从溶

22、变性的蛋白质肽链之间相互缠绕聚集从溶液中析出的现象液中析出的现象-蛋白质的沉淀蛋白质的沉淀。(四)蛋白质的紫外吸收蛋白质含有芳香族氨基酸，在280nm处有吸收峰。在一定范围内,蛋白质溶液浓度与A280nm成正比。(五)蛋白质的呈色反应Pr水解产生AA也可发生茚三酮显色反应 Pr在稀碱溶液中和硫酸铜共热时可以呈现紫色或 者红色，称为双缩脲反应。(一一)透析透析(dialysis)及超滤及超滤原理原理：利用利用Pr不能透过半透膜而将不能透过半透膜而将Pr与小分子物质分开与小分子物质分开截留分子量的超滤膜（正压或离心）半透膜半透膜五、蛋白质的分离纯化五、蛋白质的分离纯化（二二）常用沉淀方法常用沉淀方

23、法1.盐析盐析(salt precipitation)原理原理-将（将（NH）2SO4、Na2SO4、NaCl等加入蛋白质溶液，破等加入蛋白质溶液，破 坏蛋白质在水溶液中的稳定性因素而沉淀。坏蛋白质在水溶液中的稳定性因素而沉淀。2、丙酮、乙醇等有机溶剂沉淀、丙酮、乙醇等有机溶剂沉淀（1）原理：极性较大有机溶剂破坏）原理：极性较大有机溶剂破坏pr水化层导致水化层导致Pr沉淀析出；沉淀析出；（2）04，丙酮，丙酮10倍于倍于Pr溶液体积，尽快操作，防止变性。溶液体积，尽快操作，防止变性。3.免疫沉淀免疫沉淀 Pr具有抗原性，用特异抗体形成免疫复合物，沉淀分离具有抗原性，用特异抗体形成免疫复合物，沉

24、淀分离（三三)电泳（电泳（electrophoresis)：蛋白质在高于或低于蛋白质在高于或低于其其pIpI的溶液中是带电的，的溶液中是带电的，在电场中能向电场的正极在电场中能向电场的正极或负极移动。或负极移动。电泳：电泳：通过蛋白质在电场通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋中泳动而达到分离各种蛋白质的技术。白质的技术。分类：分类：纸电泳纸电泳凝胶电泳凝胶电泳等等（四）应用相分配或亲和原理（四）应用相分配或亲和原理-层析层析分离分离(chromatography)层析也叫色谱是分离蛋白质常用的方法：当蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，待分离蛋白质颗粒大小、电荷多少、亲和力差异

25、等不断将蛋白质在固定相中重新分配，并且以不同速度流经固定相。层析法分离、纯化层析法分离、纯化：Pr、多肽和多肽和AA蛋白质溶液流经固定相的阴离子交换树脂时带负蛋白质溶液流经固定相的阴离子交换树脂时带负电荷的蛋白质成分就与固定相结合，而带正电荷的成电荷的蛋白质成分就与固定相结合，而带正电荷的成分则完全通过固定相，进一步用带负电荷的溶液（如分则完全通过固定相，进一步用带负电荷的溶液（如ClCl-）洗脱固定相就可以得到蛋白质。）洗脱固定相就可以得到蛋白质。离子交换层析离子交换层析-阳离子交换层析阳离子交换层析（阴离子交换层析）（阴离子交换层析）依据：依据：PrPr和和AAAA一样，是两性电解质，在某

26、一一样，是两性电解质，在某一 特定特定pHpH时，各蛋白质的电荷量及性质不同。时，各蛋白质的电荷量及性质不同。35固定相：固定相：1.1.纤维素纤维素-DEAE DEAE纤维素、纤维素、CMCM纤维素纤维素凝胶过滤凝胶过滤(gel filtration)(gel filtration)（分子筛）（分子筛）原理原理：层析柱中填满带有小孔的颗层析柱中填满带有小孔的颗粒（一般由葡聚糖制成）。粒（一般由葡聚糖制成）。PrPr溶溶液加于柱的顶部，任其往下渗漏，液加于柱的顶部，任其往下渗漏，小分子蛋白质进入孔内，因而在小分子蛋白质进入孔内，因而在柱中滞留时间较长，大分子柱中滞留时间较长，大分子PrPr不不

27、能进入孔内而径直流出，因而不能进入孔内而径直流出，因而不同大小的同大小的PrPr得以分离。得以分离。373839亲和层析法亲和层析法1.1.原理原理：利用生物高分子具有能和某些相对应的专一：利用生物高分子具有能和某些相对应的专一 分子可逆结合的特性。分子可逆结合的特性。如，如，酶的活性部位能和底物酶的活性部位能和底物 抑制剂抑制剂 辅助因子专辅助因子专 一性地结合一性地结合,改变条件又能使这种结合解除改变条件又能使这种结合解除.酶的变构中心与变构因子（或称效应物）之酶的变构中心与变构因子（或称效应物）之 间、抗体与抗原之间、激素与受体之间，结间、抗体与抗原之间、激素与受体之间，结 合蛋白与结合

28、物之间合蛋白与结合物之间。这些被作用的对象物质称之为这些被作用的对象物质称之为配基（配基（ligand)ligand)。40固定相固定相-配基配基固定在固定在固相载体固相载体上上41(五五)利用蛋白质颗粒沉降行为利用蛋白质颗粒沉降行为-超速离心超速离心（ultracentrifugation)原理原理：PrPr在高速离心时，在溶液中逐渐下降，直至在高速离心时，在溶液中逐渐下降，直至其浮力与离心所产生的力相等，此时沉降停止。其浮力与离心所产生的力相等，此时沉降停止。不同不同PrPr其密度与形态不同，沉降停止的位置就其密度与形态不同，沉降停止的位置就不同，从而达到分离不同，从而达到分离PrPr的目

29、的。的目的。密度梯度离心六、蛋白质分子序列及空间结构分析六、蛋白质分子序列及空间结构分析蛋白质序列测定蛋白质序列测定：Sanger逐级降解、末端分析、再结合Edman降解法测定肽段的AA序列 基因着手-先找到编码特定蛋白质的DNA序列及 mRNA序列，推出AA序列。空间结构测定：空间结构测定：物理方法X衍射，核磁共振等，计算机辅助生物信息学第二节蛋白质组与蛋白质组学1994年9月在意大利Marc Wilkins正式提出了蛋白质组（proteome）的概念。用于指用于指代代(在在)特定时间一个基因组或者一种特定时间一个基因组或者一种组织产生并利用的所有蛋白质。组织产生并利用的所有蛋白质。差异蛋白

30、质组学的研究方法和应用差异蛋白质组学的研究方法和应用(一一)差异蛋白质组学的研究内容差异蛋白质组学的研究内容 比较蛋白质组学比较蛋白质组学 寻找不同生理或者病理状态下组织或细胞的蛋白质组变化，寻找不同生理或者病理状态下组织或细胞的蛋白质组变化，鉴定并研究这些差异蛋白在生命过程中的作用。鉴定并研究这些差异蛋白在生命过程中的作用。1.蛋白质鉴定蛋白质鉴定 用电泳结果分析差异蛋白分子量、用电泳结果分析差异蛋白分子量、pI等等,结合蛋白杂交、结合蛋白杂交、免疫学检测初步鉴定蛋白质种类。免疫学检测初步鉴定蛋白质种类。2.蛋白质的修饰蛋白质的修饰 确定蛋白质的化学修饰类型确定蛋白质的化学修饰类型 3.蛋白

31、质功能确定蛋白质功能确定 酵母杂交技术、噬菌体展示技术、酵母杂交技术、噬菌体展示技术、RNA干扰技术干扰技术(二二)差异差异蛋白质组学研究方法及技术路线蛋白质组学研究方法及技术路线 1.研究方法研究方法 激光俘获显微切割技术（激光俘获显微切割技术（laser capturelaser capture microdissection microdissection，LCMLCM）新型原位技术新型原位技术 特异的从组织中分离出某一种细胞，可以高通量、高特异的从组织中分离出某一种细胞，可以高通量、高 精度、迅速的得到组织来源的某一种细胞。精度、迅速的得到组织来源的某一种细胞。酵母杂交技术（酵母杂交技

32、术（yeast hybridizationyeast hybridization）适用于研究生物大分子之间的相互作用适用于研究生物大分子之间的相互作用 噬菌体表面展示技术噬菌体表面展示技术(phage surface display)(phage surface display)用于研究蛋白质相互作用的技术。用于研究蛋白质相互作用的技术。2.技术路线技术路线 细胞分离和蛋白质的提取细胞分离和蛋白质的提取 双向电泳双向电泳:第一相等电聚焦第一相等电聚焦;第二相第二相SDS-PAGE,染色染色(考马斯亮蓝考马斯亮蓝/银染银染/荧光染色荧光染色)扫描图像经过计算机处理发现差异点扫描图像经过计算机处理

33、发现差异点 手工或者自动切取蛋白斑点(差异点差异点)脱盐等处理以后可以进行质谱分析初步测定蛋白质的一级结构。或对蛋白质进行酶解以后采用高效液相色谱分析蛋白质的氨基酸序列。此外可对蛋白质的化学修饰进行分析。(三)差异蛋白质组学的应用进展1.筛选诊断标志物2.研究发病机制3.研究药物作用机制4.监测疾病进展和疗效观察研究方法处于发展阶段，许多问题亟待解决三、蛋白质组学的前景第三节蛋白质的生物合成及其干扰 蛋白质生物合成称为翻译蛋白质生物合成称为翻译（Translation），），即把即把mRNA分子中碱基排列顺序转变为蛋白质分子中碱基排列顺序转变为蛋白质或多肽链中的氨基酸排列顺序过程。或多肽链中的

34、氨基酸排列顺序过程。参与蛋白质生物合成的成份至少有参与蛋白质生物合成的成份至少有200种，种，主要由主要由mRNA、tRNA、核糖核蛋白体以及有、核糖核蛋白体以及有关的酶和蛋白质因子共同组成关的酶和蛋白质因子共同组成 一、参与蛋白质生物合成的物质一、参与蛋白质生物合成的物质（二）氨基酸的（二）氨基酸的“搬运工具搬运工具”tRNA（三）肽链合成的（三）肽链合成的“装配机装配机”核糖体核糖体（一）（一）mRNA合成多肽链模板合成多肽链模板二、蛋白质的生物合成过程二、蛋白质的生物合成过程（一）氨基酸的活化（一）氨基酸的活化 在进行合成多肽链之前在进行合成多肽链之前,氨基酸必须与其特氨基酸必须与其特异

35、的异的tRNA结合（氨基酰结合（氨基酰tRNA合成酶催化）合成酶催化）（二）多肽链合成的起始（二）多肽链合成的起始 大肠杆菌细胞翻译起始复合物形成的过程1.核糖体30S小亚基附着于mRNA起始信号处2.30S前起始复合物的形成3.70S起始复合物的形成真核细胞蛋白质合成的起始起始复合物的形成需要更多的起始因子（eIF）1.需要特异的起始tRNA，即tRNAfmet，并且不需要N端甲酰化。2.起始复合物形成在mRNA5端AUG上游的帽子结构；3.真核细胞起始复合物的形成过程是：a.eIF-3结合在40S小亚基上促进60S大亚基解离；b.eIF-2与Met-tRNAfmet及GTP结合，先与40S

36、小亚基结合；使“Met-tRNAfmetGTPmRNA-小亚基”与60S大亚基结合，形成80S复合物(eIF-5水解GTP供能)。d.经eIF-4D激活而成为具有活性的80S起始复合物。（三）多肽链的延长（三）多肽链的延长沿mRNA53方向 在多肽链上每增加一个在多肽链上每增加一个AA都需经进位都需经进位/转肽和移位三个步骤。转肽和移位三个步骤。进位进位:密码子所特定的密码子所特定的AA-tRNA结合到核蛋白体的结合到核蛋白体的A位位;需三种延长因子需三种延长因子-EF（EF-Tu）,EF(EF-Ts)和依赖和依赖GTP转位因子参与；转位因子参与；转肽：肽键的形成转肽：肽键的形成 P位和位和A

37、位上两个位上两个AA之间在转肽酶作用下，之间在转肽酶作用下，P位位-AA提供提供-COOH基，与基，与A位位AA-NH2形成肽键，使形成肽键，使P位位AA连接到连接到A位位AA的氨基上的氨基上;移位移位:形成的肽位于形成的肽位于A位，位，P位上游离位上游离tRNA脱落，核蛋白体沿着脱落，核蛋白体沿着mRNA向向3端端方向移动一组密码子，使得原来结合二肽酰方向移动一组密码子，使得原来结合二肽酰tRNA的的A位转变成了位转变成了P位，而位，而A位空出，可以接受下一个新的氨基酰位空出，可以接受下一个新的氨基酰tRNA进入，移位过程需要进入，移位过程需要EF-2，GTP和和Mg2+的参加的参加（四）翻

38、译的终止及多肽链的释放终止密码子：UAG，UAA，UGA（原核、真核生物同）特殊的蛋白质因子促成终止作用-释放因子，原核生物：RF1、RF2T、RF3；真核生物：eRFRF作用于A位点，使转肽酶活性变为水解酶活性，将肽链从结合在核糖体上的tRNA的CCA末端水解下来，然后mRNA与核糖体分离，最后一个tRNA脱落，核糖体在IF-3作用下，解离出大、小亚基核糖体循环ribosomecycle：解离后的大小亚基又重新参加新的肽链的合成，循环往复，所以多肽链在核糖体上的合成过程又称。多核糖体循环：多核糖体循环：蛋白质开始合成时，第一蛋白质开始合成时，第一个核糖体在个核糖体在mRNA的起始部的起始部位

39、结合，当核糖体向位结合，当核糖体向mRNA的的3端移动一定距离后；端移动一定距离后；第二个核糖体又在第二个核糖体又在mRNA的起始部位结合，向的起始部位结合，向前移动一定的距离后，在起前移动一定的距离后，在起始部位又结合第三个核糖体，始部位又结合第三个核糖体，依次下去，直至终止。依次下去，直至终止。每个核糖体都独立完成一条多肽链的合成，所以这种多核糖体可以在一条mRNA链上同时合成多条相同的多肽链，这就大大提高了翻译的效率(六）阮病毒六）阮病毒（proteinaceousinfectiousagents,piron)v阮病毒阮病毒它只有它只有蛋白质蛋白质而无核酸，但却既有感染性，又而无核酸，但

40、却既有感染性，又有遗传性，并且具有和一切已知传统病原体不同的异常特有遗传性，并且具有和一切已知传统病原体不同的异常特性。它就是朊病毒性。它就是朊病毒。是人和哺乳动物的亚急性海绵样脑病等中枢神经退是人和哺乳动物的亚急性海绵样脑病等中枢神经退行性病变的感染因子。行性病变的感染因子。是一种是一种蛋白质感染颗粒，蛋白质感染颗粒，不含核酸不含核酸1997年，诺贝尔生理医学奖授予了美国生物化学家斯坦利年，诺贝尔生理医学奖授予了美国生物化学家斯坦利普鲁辛纳普鲁辛纳（Stanley B.P Prusiner），因为他发现了一种新型的生物），因为他发现了一种新型的生物朊病毒朊病毒。1.朊病毒性质与结构朊病毒性质

41、与结构其病毒大小3050nm，电镜下见不到病毒颗粒结构；可聚集。其对多种灭活作用表现出惊人的抗性生物学上：慢性感染不表现免疫原性；不受干扰素作用。Prion是一种与传统病原微生物完全不同的致病因子是一种与传统病原微生物完全不同的致病因子,其其化学本质化学本质是是细胞表面糖蛋白细胞表面糖蛋白朊蛋白朊蛋白(prion protein,prp)三维构象变构而成三维构象变构而成 迄今尚未发现其具有核酸成分迄今尚未发现其具有核酸成分,是一种具有致死性传染力是一种具有致死性传染力的蛋白颗粒。的蛋白颗粒。2 2.朊病毒的结构和朊病毒的结构和PrPPrP基因基因PrP可分正常型(对蛋白酶敏感)、疾病型(抗蛋白

42、酶水解)两种，PrP基因表达的正常产物为3335KD的蛋白质称PrPc。疾病型PrP是PrPc的异构体，27-30KD，称PrPsc,即朊病毒。一种特殊的蛋白质，是一种蛋白酶抗性蛋白一种特殊的蛋白质，是一种蛋白酶抗性蛋白 （protease-resistant protein,PrP)protease-resistant protein,PrP)，能抵抗蛋白酶能抵抗蛋白酶K K的消化作用，的消化作用，MWMW：（：（27-30)x1027-30)x103 3，故称为故称为PrP27-30PrP27-30。存在两种存在两种PrPPrP的异构体，分子量均为（的异构体，分子量均为（33-35)x10

43、33-35)x103 3，分别称为分别称为PrPc33-35,PrPsc33-35PrPc33-35,PrPsc33-35在正常动物脑组织中在正常动物脑组织中:仅有仅有PrPc33-35PrPc33-35在感染动物脑组织中在感染动物脑组织中:既有既有PrPc33-35PrPc33-35，也有，也有PrPsc33-35PrPsc33-35。3.分子机制：分子机制：朊病毒蛋白有两种构象：朊病毒蛋白有两种构象：细胞型（正常型细胞型（正常型PrPc,Prion Protein cellular ）搔痒型（致病型搔痒型（致病型PrPsc,sc stands for scrapie,the prion d

44、isease of sheep）两者的主要区别在于其空间构象上的差异：两者的主要区别在于其空间构象上的差异：PrPc二级结构中主要以二级结构中主要以-螺旋结构为主，约占螺旋结构为主，约占40%，仅存在少量仅存在少量-片层结构。溶解于非变性剂溶液，对蛋片层结构。溶解于非变性剂溶液，对蛋白酶白酶K敏感。敏感。PrPSc含有含有50%的的-片层结构，片层结构，20%的的-螺旋。不溶螺旋。不溶于非变于非变 性剂溶液，当用蛋白酶作限制性消化时，只是性剂溶液，当用蛋白酶作限制性消化时，只是在氨基端的序列被部分切割，形成对蛋白酶具有抗性在氨基端的序列被部分切割，形成对蛋白酶具有抗性的的PrPsc。人、哺乳动

45、物、禽类、果蝇和线虫等无脊椎动物、人、哺乳动物、禽类、果蝇和线虫等无脊椎动物、酵母基因组中都有酵母基因组中都有PrPPrP基因基因(PrnP)(PrnP)。PrPPrP基因：基因：单一基因单一基因 在进化过程中表现出了高度的保守性。在进化过程中表现出了高度的保守性。5 5端是非编码外显子，端是非编码外显子，3 3端是编码外显子，中间被端是编码外显子，中间被 内含子分隔开。内含子分隔开。编码序列仅限于一个外显子，这样就排除了转录编码序列仅限于一个外显子，这样就排除了转录 水平因拼接不同而造成水平因拼接不同而造成PrPPrP存在两种不同异构体的存在两种不同异构体的 可能。可能。启动子区域没有常规的

46、启动子区域没有常规的“TATATATA”盒，而含有盒，而含有 “GCCCCGCCC3GCCCCGCCC3个重复序列，与管家基因结构相似个重复序列，与管家基因结构相似 4 4.阮病毒的复制阮病毒的复制究竟这种具有异常构象的蛋白究竟这种具有异常构象的蛋白PrPPrPSCSC在进入机体后在进入机体后如何复制自身从而产生更多的如何复制自身从而产生更多的PrPPrPscsc，现在主要有，现在主要有两种学说：两种学说：模板依赖形式（模板依赖形式（template-directed modeltemplate-directed model）成核成核-聚合形式聚合形式 （nucleation-polymeri

47、zation formalismnucleation-polymerization formalism）具有复制能力具有复制能力转变为新生分子转变为新生分子5 5.阮病毒病阮病毒病-人和哺乳动物的人和哺乳动物的多种神经系统疾病多种神经系统疾病朊病毒病特点：朊病毒病特点：潜伏期特别长潜伏期特别长-一般为数月乃至数十年的时间一般为数月乃至数十年的时间病程进行缓慢病程进行缓慢朊病毒从一个物种传递到另一个物种往往伴随潜伏期朊病毒从一个物种传递到另一个物种往往伴随潜伏期 的延长，这种现象称为的延长，这种现象称为“物种屏障物种屏障”。病理学特点：病理学特点：大脑皮质的神经元细胞退化、空泡变性、死亡消失，大

48、脑皮质的神经元细胞退化、空泡变性、死亡消失，被星状细胞取代，神经胶质增生，细胞外淀粉样变性被星状细胞取代，神经胶质增生，细胞外淀粉样变性蛋白质沉积，大脑皮质变薄而白质相对增加，造成海蛋白质沉积，大脑皮质变薄而白质相对增加，造成海绵状态，故称为海绵脑病或白质脑病。绵状态，故称为海绵脑病或白质脑病。阮病毒病的共同特征：阮病毒病的共同特征：为致死性中枢神经系统的慢性退化性疾患为致死性中枢神经系统的慢性退化性疾患临床可出现痴呆、共济失调、震颤等症状。临床可出现痴呆、共济失调、震颤等症状。人类阮病毒病可分为传染型、遗传型和散发型人类阮病毒病可分为传染型、遗传型和散发型3 3种形式种形式传染型传染型-指朊

49、病毒在人群中水平传播而引起的一类朊病毒性疾病指朊病毒在人群中水平传播而引起的一类朊病毒性疾病遗传型遗传型-它们是生殖细胞突变形成的。它们是生殖细胞突变形成的。散发型散发型-可能与体细胞突变或朊病毒蛋白（可能与体细胞突变或朊病毒蛋白（prionprotein,PrP）的自发性构象改变有关。的自发性构象改变有关。朊病毒发现的意义朊病毒发现的意义：从理论上讲，从理论上讲，“中心法则中心法则”认为认为DNADNA复制是复制是“自自我复制我复制”，即，即DNADNADNADNA，而朊病毒蛋白是，而朊病毒蛋白是PrPPrPPrPPrP，是为，是为“自他复制自他复制”。这对遗传学理论有一定的补充作用。但也有

50、矛这对遗传学理论有一定的补充作用。但也有矛盾，即盾，即”DNA”DNA蛋白质蛋白质”与与“蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质”之间的矛盾。之间的矛盾。朊病毒致病机制朊病毒致病机制 朊病毒本身不能繁殖，它是通过胁迫正常蛋白畸变朊病毒本身不能繁殖，它是通过胁迫正常蛋白畸变而进行自我复制。而进行自我复制。其复制途径大致如下：其复制途径大致如下：一个一个PrPsc分子击中一个分子击中一个PrPc分子，分子，PrPc在在PrPsc的胁迫下结构发生变化，形成的胁迫下结构发生变化，形成PrPsc二聚体；接着二聚体；接着2个个PrPsc分子再分别击中分子再分别击中2个个PrPc产生产生4个个PrPsc分子。分子。如此循