《蛋白质的化学》PPT课件.ppt

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1、肌红蛋白肌红蛋白血红蛋白血红蛋白蛋白质折叠的自由能漏斗蛋白质折叠的自由能漏斗第一章第一章 蛋白质化学蛋白质化学蛋蛋白白质质(protein)是是由由许许多多不不同同的的-氨氨基基酸酸按按一一定定的的序序列列通通过过酰酰胺胺键键（蛋蛋白白质质化化学学中中专专称称为为肽肽键键）缩缩合合而而成成的的，具具有有较较稳稳定定的的构构象象并具有一定并具有一定生物功能生物功能的生物大分子的生物大分子 蛋白质存在于所有蛋白质存在于所有的生物细胞中，是的生物细胞中，是构成生物体最基本构成生物体最基本的结构物质和功能的结构物质和功能物质。物质。蛋白质是生命活动蛋白质是生命活动的物质基础，它参的物质基础，它参与了几

2、乎所有的生与了几乎所有的生命活动过程。命活动过程。第一节第一节 蛋白质的生物学意义蛋白质的生物学意义 1.催化催化 最重要的功能是作为生物体新陈代谢的最重要的功能是作为生物体新陈代谢的 催化剂酶催化剂酶萤火虫的荧光素酶消耗萤火虫的荧光素酶消耗ATP催化底物发光催化底物发光2.转运转运 血红蛋白、血清清蛋白通过血流转血红蛋白、血清清蛋白通过血流转 运物质运物质;葡萄糖转运蛋白、氨基酸转运葡萄糖转运蛋白、氨基酸转运 蛋白膜转运蛋白蛋白膜转运蛋白 红细胞含有大量携氧的血红蛋白红细胞含有大量携氧的血红蛋白3.运动运动 染色体的运动、鞭毛运动、肌肉的收缩染色体的运动、鞭毛运动、肌肉的收缩5.防御和进攻防

3、御和进攻 主动参与细胞防御、保护和开发方主动参与细胞防御、保护和开发方 面的作用（也称保护蛋白），如免疫球蛋面的作用（也称保护蛋白），如免疫球蛋 白（抗体），血液凝固蛋白，凝血酶，血白（抗体），血液凝固蛋白，凝血酶，血 纤蛋白原，抗冻蛋白，动物或植物毒蛋白纤蛋白原，抗冻蛋白，动物或植物毒蛋白,干扰素干扰素6.贮存贮存 为生物体提供充足的为生物体提供充足的N素，以及素，以及C、H、O、S，还有，还有Fe。如卵清蛋白，酪蛋白，种如卵清蛋白，酪蛋白，种 子贮存蛋白子贮存蛋白，铁蛋白铁蛋白 4.调节调节 调节其他蛋白质执行其生理功能调节其他蛋白质执行其生理功能,如胰岛如胰岛 素素;参与基因表达的调控参

4、与基因表达的调控,如转录调控因如转录调控因子子7.结构成分结构成分 构建和维持生物体的结构结构构建和维持生物体的结构结构 蛋白，给细胞和组织提供强度和保护。如蛋白，给细胞和组织提供强度和保护。如 -角蛋白，胶原蛋白角蛋白，胶原蛋白角蛋白，在所有的脊椎动物中都有合成，是角蛋白，在所有的脊椎动物中都有合成，是毛发、鳞片、角、趾甲和羽毛的主要成分。毛发、鳞片、角、趾甲和羽毛的主要成分。8.支架作用支架作用 支架蛋白或接头蛋白支架蛋白或接头蛋白(adapter protein)，在应答激素和生长因子的复杂，在应答激素和生长因子的复杂 途径中起作用。常含有多个不同的组件途径中起作用。常含有多个不同的组件

5、,将多种不同蛋白质装配成一个多蛋白复合将多种不同蛋白质装配成一个多蛋白复合 体体9.异常功能异常功能 如应乐果甜蛋白（蔗糖甜度的如应乐果甜蛋白（蔗糖甜度的200 倍）、节肢弹性蛋白（昆虫翅铰合部）、倍）、节肢弹性蛋白（昆虫翅铰合部）、胶质蛋白（海洋贝类分泌）胶质蛋白（海洋贝类分泌）蛋白质工程蛋白质工程l在重组在重组DNA技术基础上发展起来的蛋白质工程技术基础上发展起来的蛋白质工程（protein engineering）l定义：定义：利用基因工程的手段，包括基因的定点突利用基因工程的手段，包括基因的定点突变和基因表达，来改造蛋白质分子，使之具有变和基因表达，来改造蛋白质分子，使之具有更完善的、

6、甚至是新的性质和功能。更完善的、甚至是新的性质和功能。蛋白质工程蛋白质工程与基因工程的关系与基因工程的关系l基因工程基因工程(genetic engineering):基因体外重组、体内基因体外重组、体内 表达表达l蛋白质工程：蛋白质工程：基因体外重组、诱变，体内表达出不同基因体外重组、诱变，体内表达出不同 于原蛋白质的蛋白质于原蛋白质的蛋白质l蛋白质工程也称第二代基因工程蛋白质工程也称第二代基因工程 l蛋白质工程所采用的生物技术也是基因重组技术。蛋白质工程所采用的生物技术也是基因重组技术。蛋白质工程要对天然蛋白质基因进行改造，从而蛋白质工程要对天然蛋白质基因进行改造，从而 制造出与天然蛋白有

7、所不同的、符合人们需要的制造出与天然蛋白有所不同的、符合人们需要的 非天然蛋白质。非天然蛋白质。l蛋白质组：蛋白质组：细胞、组织和个体的全部蛋白质谱统称为细胞、组织和个体的全部蛋白质谱统称为 蛋白质组蛋白质组 第第二节二节 蛋白质的元素组成蛋白质的元素组成 一般含一般含:C 50 55%H 6 8 O 20 23 N 15%18%S 0%4%有些还含微量的有些还含微量的P,Fe,Zn,Cu,Mo,I 等元素等元素.N含量在各种蛋白质中比较接近含量在各种蛋白质中比较接近,平均为平均为16%1g 氮相当于氮相当于 6.25g 的蛋白质的蛋白质 常称为常称为蛋白质系数蛋白质系数)蛋白质平均含蛋白质平

8、均含N N量为量为1616,这是凯氏定氮法测这是凯氏定氮法测定蛋白质含量的理论依据：定蛋白质含量的理论依据：蛋白质含量蛋白质含量 蛋白质含蛋白质含N量量 第三节第三节 蛋白质的氨基酸组成蛋白质的氨基酸组成 一、蛋白质的水解一、蛋白质的水解 完全水解得到各种氨基酸的混合物，部分水解通常得完全水解得到各种氨基酸的混合物，部分水解通常得到多肽片段。到多肽片段。1.酸水解酸水解方法：方法：常用常用6 mol/L HCl或或4 mol/L H2SO4，回，回 流煮沸约流煮沸约 20 h。优点：优点：不引起消旋作用，得到的是不引起消旋作用，得到的是L-氨基酸。氨基酸。缺点：缺点：色氨酸被沸酸完全破坏；含有

9、羟基的氨色氨酸被沸酸完全破坏；含有羟基的氨 基酸（丝氨酸、苏氨酸）有一小部分基酸（丝氨酸、苏氨酸）有一小部分 被分解；天冬酰胺和谷氨酰胺的酰胺基被分解；天冬酰胺和谷氨酰胺的酰胺基 被水解成羧基。被水解成羧基。2.2.碱水解碱水解 方法：方法：一般用一般用5 mol/L NaOH 煮沸煮沸10 20 h。优点：优点：色氨酸在水解中不受破坏。色氨酸在水解中不受破坏。缺点：缺点：多数氨基酸受到不同程度的破坏，产生多数氨基酸受到不同程度的破坏，产生 消旋现象，得到的是消旋现象，得到的是D-和和L-氨基酸的混氨基酸的混 合物。此外，引起精氨酸脱氨（生成鸟合物。此外，引起精氨酸脱氨（生成鸟 氨酸和尿素）。

10、氨酸和尿素）。3.酶水解酶水解方法：方法：用于蛋白质肽链断裂的蛋白水解酶（或称用于蛋白质肽链断裂的蛋白水解酶（或称 蛋白酶蛋白酶,proteinase）已有十多种，常用）已有十多种，常用 的有胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶（或称糜的有胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶（或称糜 蛋白酶）及胃蛋白酶等。蛋白酶）及胃蛋白酶等。优点：优点：不产生消旋作用，也不破坏氨基酸。不产生消旋作用，也不破坏氨基酸。缺点：缺点：使用一种酶往往水解不彻底，需几种酶协使用一种酶往往水解不彻底，需几种酶协 同作用才能使蛋白质完全水解。该法主要同作用才能使蛋白质完全水解。该法主要 用于部分水解。用于部分水解。二、氨基酸二、氨基酸(amino

11、acid)的结构通式的结构通式 除除脯脯氨氨酸酸（亚亚氨氨基基酸酸）外外，其其他他1919种种均均具具有有如下结构通式：如下结构通式：不变部分不变部分侧链，可变部分侧链，可变部分蛋白质是由蛋白质是由蛋白质是由蛋白质是由2020种基本氨基酸组成的种基本氨基酸组成的种基本氨基酸组成的种基本氨基酸组成的除除脯氨酸脯氨酸外，均为外，均为-氨基酸氨基酸除除甘氨酸甘氨酸外，均为手性氨基酸外，均为手性氨基酸 1.氨基酸的旋光性氨基酸的旋光性除甘氨酸外，氨基酸均含有一个手性除甘氨酸外，氨基酸均含有一个手性-碳原子，碳原子，都具有旋光性都具有旋光性。比旋光度是氨基酸的重要物理常数之一，是鉴别比旋光度是氨基酸的重

12、要物理常数之一，是鉴别各种氨基酸的重要依据。各种氨基酸的重要依据。2.氨基酸的构型氨基酸的构型都有都有 D-型和型和 L-型型 2 种立体异构体种立体异构体L-丙氨酸丙氨酸D-丙氨酸丙氨酸L-()甘油醛甘油醛D-()甘油醛甘油醛L-丙氨酸丙氨酸D-丙氨酸丙氨酸L-丙氨酸丙氨酸D-丙氨酸丙氨酸 蛋白质中发现的氨基酸都是蛋白质中发现的氨基酸都是L-型的（故习惯型的（故习惯上书写氨基酸都不注明构型和旋光方向）。上书写氨基酸都不注明构型和旋光方向）。三、氨基酸的分类三、氨基酸的分类（一）按（一）按R基的化学结构分类基的化学结构分类 可分为三类：脂肪族、芳香族和杂环族可分为三类：脂肪族、芳香族和杂环族

13、1、脂肪族氨基酸、脂肪族氨基酸 含一氨基一羧基的中性氨基酸含一氨基一羧基的中性氨基酸甘氨酸甘氨酸 Gly,G丙氨酸丙氨酸 Ala,A缬氨酸缬氨酸 Val,V亮氨酸亮氨酸 Lue,L异亮氨异亮氨酸酸 Ile,I丝氨酸丝氨酸 (Ser,S)苏氨酸苏氨酸 (Thr,T)半胱氨酸半胱氨酸 (Cys,C)甲硫氨酸甲硫氨酸 (Met,M)含羟基或硫氨基酸含羟基或硫氨基酸(一氨基一羧基一氨基一羧基)酸性氨基酸酸性氨基酸(一氨基二羧基一氨基二羧基)及其酰胺及其酰胺天冬氨酸天冬氨酸 (Asp,D)谷氨酸谷氨酸 (Glu,E)天冬酰胺天冬酰胺 (Asn,N)谷氨酰胺谷氨酰胺 (Gln,Q)碱性氨基酸碱性氨基酸(二

14、氨基一羧基二氨基一羧基二氨基一羧基二氨基一羧基)赖氨酸赖氨酸 (Lys,K)精氨酸精氨酸 (Arg,R)组氨酸组氨酸 (His,H)杂环杂环2、芳香族氨基酸芳香族氨基酸苯丙氨酸苯丙氨酸 （Phe,F）酪氨酸酪氨酸 （Tyr,Y）色氨酸色氨酸 （Trp,W）3、杂环氨基酸、杂环氨基酸组氨酸组氨酸 （His,H）脯氨酸脯氨酸 （Pro,P）说明：说明：关于关于杂环氨基酸和杂环亚氨基酸杂环氨基酸和杂环亚氨基酸色氨酸色氨酸 （Trg,W）组氨酸组氨酸 （His,H）脯氨酸脯氨酸 （Pro,P）芳香族氨基酸芳香族氨基酸杂环亚氨基酸杂环亚氨基酸杂环氨基酸杂环氨基酸（二）按（二）按R基的极性性质分类基的极性

15、性质分类 20种基本氨基酸可分成以下种基本氨基酸可分成以下4组：组：1、非极性氨基酸（、非极性氨基酸（8种种）Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Met、Pro、Trp2、极性不带电荷的氨基酸（极性不带电荷的氨基酸（7种）种）Ser、Thr、Tyr 含羟基；含羟基；Asn、Gln 含酰胺基含酰胺基；Cys 含巯基（含巯基（-SH）；）；Gly（因（因-C上的上的H受易解离的受易解离的-氨基和氨基和-羧基的影响，体现不出极性，故有的书羧基的影响，体现不出极性，故有的书 中将其列为非极性类）中将其列为非极性类）3、极性带正电荷的氨基酸极性带正电荷的氨基酸 3种碱性氨基酸：种碱性氨基酸：Lys、

16、Arg、His 在在 pH7 时带正电荷时带正电荷 在在 pH6.0 时，时，His 的的 R 基基 50%以上质子以上质子 化，但化，但 pH7.0 时，质子化的分子不到时，质子化的分子不到10%。His 是唯一的是唯一的R 基的基的pKa值在值在7附近的氨基酸附近的氨基酸 4、极性带负电荷的氨基酸极性带负电荷的氨基酸 2种酸性氨基酸：种酸性氨基酸：Asp、Glu3个有个性的氨基酸个有个性的氨基酸 1）脯氨酸（）脯氨酸（Pro）因为是一个环因为是一个环状的亚氨基酸状的亚氨基酸,它的氨基和其它它的氨基和其它氨基酸的羧基形成的肽键有明显氨基酸的羧基形成的肽键有明显的特点的特点,较易变成顺式肽键较

17、易变成顺式肽键.2）甘氨酸（）甘氨酸（Gly）是唯一的在是唯一的在-碳碳原子上只有原子上只有2个氢原子个氢原子,没有侧链没有侧链的氨基酸的氨基酸.为此它既不能和其它残为此它既不能和其它残基的侧链相互作用，也不产生任何基的侧链相互作用，也不产生任何位阻现象位阻现象,进而在蛋白质的立体结进而在蛋白质的立体结构形成中有其特定的作用构形成中有其特定的作用.3）半胱氨酸）半胱氨酸(Cys)它的个性不仅表现在其侧链它的个性不仅表现在其侧链有一定的大小和具有高度的化学反应活性，还有一定的大小和具有高度的化学反应活性，还在于两个在于两个 Cys 能形成稳定的带有二硫（桥）键能形成稳定的带有二硫（桥）键的胱氨酸

18、。二硫键不仅可以在肽链内，也可以的胱氨酸。二硫键不仅可以在肽链内，也可以在肽链间存在。更有甚者，同样的一对二硫键在肽链间存在。更有甚者，同样的一对二硫键能具有不同的空间取向。能具有不同的空间取向。二十种常见蛋白质氨基酸的分类、结构及三字符号二十种常见蛋白质氨基酸的分类、结构及三字符号据营养据营养学分类学分类 必需必需非必需非必需据据R基团化基团化学结构分类学结构分类 脂肪族脂肪族A A芳香族芳香族A(PheA(Phe、TyrTyr、Trp)Trp)杂环杂环(His(His、ProPro、Trp)Trp)据据R基团基团极性分类极性分类极性极性R基团基团AA非极性非极性R基团基团AA（种）（种）不

19、带电荷不带电荷（种）（种）带电荷带电荷带正电荷带正电荷（种）（种）带负电荷带负电荷（种）（种）据氨基、羧据氨基、羧基数分类基数分类一氨基一羧基一氨基一羧基一氨基二羧基一氨基二羧基(Glu(Glu、Asp)Asp)二氨基一羧基二氨基一羧基(Lys(Lys、HisHis、Arg)Arg)人体必需氨基酸人体必需氨基酸 Lys LysTrpTrpPhePhe Val ValMetMetLeuLeu Ile IleThrThr（三）不常见的蛋白质氨基酸（三）不常见的蛋白质氨基酸 存在于少数蛋白质中特殊的氨基酸，是在蛋白存在于少数蛋白质中特殊的氨基酸，是在蛋白质生物合成后质生物合成后由相应的基本氨基酸衍生

20、而来由相应的基本氨基酸衍生而来。N-甲基赖氨酸存在于肌球蛋白中。甲基赖氨酸存在于肌球蛋白中。-羧基谷氨酸存在于凝血酶原中羧基谷氨酸存在于凝血酶原中;羟脯氨酸存在于胶原蛋白中羟脯氨酸存在于胶原蛋白中;（四）非蛋白质氨基酸（四）非蛋白质氨基酸 大多是蛋白质中存在的大多是蛋白质中存在的L型型-氨基酸的衍生氨基酸的衍生物。但有一些是物。但有一些是、或或-氨基酸，且有些是氨基酸，且有些是D-型氨基酸。型氨基酸。细菌细胞壁组成中的细菌细胞壁组成中的肽聚糖肽聚糖中的中的D-氨基酸：氨基酸：D-谷氨酸、谷氨酸、D-丙氨酸丙氨酸一种抗生素一种抗生素短杆菌肽短杆菌肽S中含有中含有D-苯丙氨酸苯丙氨酸。-丙氨酸是遍

21、多酸丙氨酸是遍多酸(泛酸泛酸,一种维生素一种维生素)的前体成分的前体成分 氨基丁酸是传递神经冲动的化学介质氨基丁酸是传递神经冲动的化学介质 L-鸟氨酸、鸟氨酸、L-瓜氨酸是尿素循环的中间体瓜氨酸是尿素循环的中间体鸟氨酸鸟氨酸胍氨酸胍氨酸第四节第四节 氨基酸的重要理化性质和功能氨基酸的重要理化性质和功能一、氨基酸的性质一、氨基酸的性质（一）一般物理性质（一）一般物理性质 -氨基酸为氨基酸为无色晶体，熔点极高无色晶体，熔点极高(一般在一般在200以上以上)。有的无味、有的味甜、有的味苦、。有的无味、有的味甜、有的味苦、谷氨酸的单钠盐有谷氨酸的单钠盐有鲜味鲜味(味精的主要成分味精的主要成分)。氨基酸

22、在水中的氨基酸在水中的溶解度溶解度差别很大差别很大,除除胱氨胱氨酸、半胱氨酸和酪氨酸酸、半胱氨酸和酪氨酸外外,一般都能溶于水一般都能溶于水,并并能溶解于稀酸或稀碱中能溶解于稀酸或稀碱中,但不能溶解于有机溶剂但不能溶解于有机溶剂(通常酒精能把氨基酸从其溶液中沉淀析出通常酒精能把氨基酸从其溶液中沉淀析出)。脯氨酸和羟脯氨酸能溶于乙醇或乙醚中脯氨酸和羟脯氨酸能溶于乙醇或乙醚中,且二者极易溶于水而潮解且二者极易溶于水而潮解。（二）氨基酸的手性（二）氨基酸的手性 20种标准氨基酸中，除种标准氨基酸中，除Gly以外的以外的19种氨基酸种氨基酸都有手性。都有手性。（三）氨基酸的光吸收性质（三）氨基酸的光吸收

23、性质 20 20种标准氨基酸在可见光区都无光吸收，但种标准氨基酸在可见光区都无光吸收，但在红外区和远紫外区在红外区和远紫外区(220nm)(220nm)均有光吸收。均有光吸收。在近紫外区在近紫外区(220(220300nm)300nm)只有酪氨酸、苯丙只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力，因为它们含有苯氨酸和色氨酸有吸收光的能力，因为它们含有苯环共轭环共轭键系统。键系统。Phe：max=257nm，257 102 mol-1Lcm-1 Tyr：max=275nm，275 103 mol-1Lcm-1 Trp：max=280nm，280 103 mol-1Lcm-1 蛋白质蛋白质因含有因含

24、有Tyr、Phe、Trp,也有紫外吸收也有紫外吸收能力能力,一般最大吸收在一般最大吸收在280nm波长处波长处。分光光度计定量分析依据分光光度计定量分析依据lLambert-Beer定律：定律：A=Log 1/T=Log Io/I=C L入射光入射光强度强度 Io透射光透射光强度强度 I样品池样品池 (溶液浓度溶液浓度mol/L)检测器检测器单色器单色器光源光源1、两性解离和等电点、两性解离和等电点 两性离子两性离子是指在同一个氨基酸分子上带有能是指在同一个氨基酸分子上带有能放出质子的放出质子的-NH3+正离子和能接受质子的正离子和能接受质子的-COO-负离子。负离子。氨基酸是两性电解质。氨基

25、酸是两性电解质。（四）（四）氨基酸的化学性质氨基酸的化学性质 pH=pI 净电荷净电荷=0 pH pI净电荷为负净电荷为负CHRCOOHNH3+CHRCOONH2CHRCOONH3+H+OH-+H+OH-(pK1)(pK2)在在一一定定pH条条件件下下,氨氨基基酸酸分分子子中中所所带带的的正正电电荷荷数数和和负负电电荷荷数数相相等等,即即净净电电荷荷为为零零,在在电电场场中中既既不不向向阳阳极极也也不不向向阴阴极极移移动动,此此时时溶溶液液的的pH值值称称为为该该种种氨氨基基酸酸的的等等电电点点(isoelectric point，pI)。氨基酸的等电点是它呈现电中性时所处环境的氨基酸的等电点

26、是它呈现电中性时所处环境的pH值值.（1）等电点的概念）等电点的概念A.等电点时，氨基酸的溶解度最小，易沉淀。等电点时，氨基酸的溶解度最小，易沉淀。利用利用该性质可分离制备某些氨基酸。例如谷氨该性质可分离制备某些氨基酸。例如谷氨酸的生产，即将微生物发酵液的酸的生产，即将微生物发酵液的pH值调至（谷值调至（谷氨酸的等电点）而使谷氨酸沉淀析出。氨酸的等电点）而使谷氨酸沉淀析出。B.利用各种氨基酸的等电点不同，可通过利用各种氨基酸的等电点不同，可通过电泳法、电泳法、离子交换法离子交换法等在实验室或工业生产上进行混合等在实验室或工业生产上进行混合氨基酸的分离或制备。氨基酸的分离或制备。氨基酸的等电点可

27、由其分子上解离基团的氨基酸的等电点可由其分子上解离基团的解解离常数离常数来确定。来确定。（2）等电点理论的应用）等电点理论的应用（3）氨基酸等电点的计算）氨基酸等电点的计算 可可见见，氨氨基基酸酸的的pI值值等等于于该该氨氨基基酸酸的的两两性性离子两侧的基团离子两侧的基团pK值之和的二分之一。值之和的二分之一。pI=2pK1+pK2一氨基一羧基一氨基一羧基AA的等电点计算：的等电点计算：pI=2pK2+pK3二氨基一羧基二氨基一羧基AA的等电点计算：的等电点计算：pI=2pK1+pK2一氨基二羧基一氨基二羧基AA的等电点计算：的等电点计算：一氨基一羧基一氨基一羧基AA的等电点计算，的等电点计算

28、，以丙氨酸为例以丙氨酸为例:一氨基二羧基氨基酸等电点的计算一氨基二羧基氨基酸等电点的计算,以以Asp为例为例:二氨基一羧氨基酸的等电点的计算二氨基一羧氨基酸的等电点的计算,以以Lys为例：为例：2、R基团的疏水性基团的疏水性 氨基酸的疏水性直接影响到蛋白质的折叠。在氨基酸的疏水性直接影响到蛋白质的折叠。在水溶液中，这是驱动蛋白质分子折叠的动力之一。水溶液中，这是驱动蛋白质分子折叠的动力之一。侧侧 链链疏疏 水水 度度侧侧 链链疏疏 水水 度度IleIleValValLeuLeuPhePheCysCysMetMetAlaAlaProGlyGlyThrThr4.54.54.24.23.83.82.

29、82.82.52.51.91.91.81.81.60.40.40.70.7Ser TrpTrpTyrTyrHisHisGluGluGlnGlnAspAspAsnAsnLysLysArgArg0.8 0.90.91.31.33.23.23.53.53.53.53.53.53.53.53.93.94.54.5表表 氨基酸侧链的疏水度氨基酸侧链的疏水度 氨氨基基酸酸是是离离子子化化合合物物，但但在在溶溶液液状状态态时时，存存在在 下列平衡：下列平衡：化学反应中可用左边的结构式表示氨基酸。化学反应中可用左边的结构式表示氨基酸。氨基酸分子的氨基酸分子的-氨基、氨基、-羧基均能参加反应，羧基均能参加反应，

30、有的侧链有的侧链R基团也能参加反应。基团也能参加反应。3、氨基酸氨基和羧基参与的化学反应、氨基酸氨基和羧基参与的化学反应 与亚硝酸的反应与亚硝酸的反应 在标准条件下测定生成的在标准条件下测定生成的N2体积，即可计算体积，即可计算出氨基酸的量。出氨基酸的量。用途用途：是是范斯莱克（范斯莱克（Van SlykeVan Slyke）法测定氨基氮的）法测定氨基氮的基础基础,可用于氨基酸定量和蛋白质水解程度的测定可用于氨基酸定量和蛋白质水解程度的测定室室 温温（1）-氨基参加的反应氨基参加的反应 与甲醛的反应与甲醛的反应 用用NaOH滴滴定定氨基酸甲醛滴定法氨基酸甲醛滴定法(概念概念)判断蛋白质水解或合

31、成的进度判断蛋白质水解或合成的进度 与与2,4-二硝基氟苯（二硝基氟苯（DNFB）的反应）的反应 烃基化反应烃基化反应 2，4-二硝基苯氨基酸，二硝基苯氨基酸，黄色黄色（DNP-氨基酸，可用乙酸乙酯或乙醚抽提氨基酸，可用乙酸乙酯或乙醚抽提）多肽或蛋白质多肽或蛋白质N端氨基酸的端氨基酸的-氨基也能与氨基也能与DNFB反应，生成反应，生成DNP-多肽或多肽或DNP-蛋白质。后蛋白质。后者用酸水解时，所有肽键被打开，可得到黄色的者用酸水解时，所有肽键被打开，可得到黄色的DNP-氨基酸。氨基酸。该反应由该反应由F.Sanger（英）首先发现，并用于（英）首先发现，并用于鉴定多肽或蛋白质的鉴定多肽或蛋白

32、质的N-端氨基酸，阐明了胰岛素端氨基酸，阐明了胰岛素的一级结构。的一级结构。（故（故DNFB亦称作亦称作Sanger试剂）试剂）蛋白质蛋白质N端氨基酸测定的方法之一端氨基酸测定的方法之一 5-二甲氨基萘磺酰氯二甲氨基萘磺酰氯(简称丹磺酰氯或简称丹磺酰氯或DNS-Cl)代替代替DNFB试剂试剂5-二甲氨基萘磺酰氨基酸有强烈的荧光，二甲氨基萘磺酰氨基酸有强烈的荧光，可用荧光光度计快速检出，灵敏度高。可用荧光光度计快速检出，灵敏度高。酰化试剂酰化试剂苯氨基硫甲苯氨基硫甲酰酰氨基酸氨基酸 (PTC-氨基酸，无色氨基酸，无色)苯硫乙内酰脲氨基酸苯硫乙内酰脲氨基酸(PTH-氨氨基酸基酸,无色无色,可用乙酸

33、乙酯抽提可用乙酸乙酯抽提)与异硫氰酸苯酯与异硫氰酸苯酯(PITC)的反应的反应烃基化反应烃基化反应 Edman（瑞典）首先使用该反应鉴定多肽（瑞典）首先使用该反应鉴定多肽或蛋白质的或蛋白质的N-端氨基酸。端氨基酸。蛋白质多肽链蛋白质多肽链N端氨基端氨基酸的酸的-氨基可与氨基可与PITC反应生成反应生成 PTC-蛋白质蛋白质,在在酸性溶液中，它释放出未端的酸性溶液中，它释放出未端的 PTH-氨基酸和比氨基酸和比原来少了一个氨基酸残基的多肽链称为原来少了一个氨基酸残基的多肽链称为Edman降解反应降解反应。（故。（故PITC亦称作亦称作Edman试试剂）。剂）。该反应在多肽和蛋白质的氨基酸序列分析

34、该反应在多肽和蛋白质的氨基酸序列分析方面占有重要地位方面占有重要地位多肽顺序自动分析仪多肽顺序自动分析仪，一次可连续测出一次可连续测出60个以上的氨基酸顺序。个以上的氨基酸顺序。（2）-羧基参加的反应羧基参加的反应 成盐和成酯反应成盐和成酯反应 该反应使氨基酸的氨基被活化该反应使氨基酸的氨基被活化氨基酸与碱作用即生成盐。氨基酸与碱作用即生成盐。氨基酸的羧基被醇酯化，形成相应的酯。氨基酸的羧基被醇酯化，形成相应的酯。脱羧基脱羧基反应反应 蛋白质合成的氨基酸活化蛋白质合成的氨基酸活化反应反应（3）-氨基和氨基和-羧基参加的反应羧基参加的反应 与茚三酮的反应与茚三酮的反应茚三酮茚三酮 水合茚三酮水合

35、茚三酮+3H20水合茚三酮水合茚三酮(无色无色)NH3CO2 RCHO+还原型茚三酮还原型茚三酮(弱酸弱酸)加热加热水合茚三酮水合茚三酮+NH3+还原型茚三酮还原型茚三酮 蓝紫色化合物蓝紫色化合物max=570nml脯氨酸和羟脯氨酸脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应产生与茚三酮反应产生黄色物质黄色物质，其余所有的其余所有的-氨基酸与茚三酮反应均产生蓝紫色氨基酸与茚三酮反应均产生蓝紫色物质物质。加热黄色黄色，max=440nm 成肽反应缩合反应成肽反应缩合反应这是多肽和蛋白质生物合成的基本反应这是多肽和蛋白质生物合成的基本反应（4）侧链侧链R基参加的主要反应基参加的主要反应 Cys巯基（巯基（-SH）

36、参加的反应）参加的反应性质很活泼性质很活泼A.很容易被氧化形成二硫键（很容易被氧化形成二硫键（SS）作用：作用：氧化还原反应可使蛋白质分子中二硫键形成或氧化还原反应可使蛋白质分子中二硫键形成或 断裂断裂。B.与过甲酸、碘代乙酸的反应与过甲酸、碘代乙酸的反应 Pauly反应反应可用于检测可用于检测Tyr Tyr的酚基可以与重氮化合物，如的酚基可以与重氮化合物，如重氮苯磺酸重氮苯磺酸，结合生成橘黄色化合物结合生成橘黄色化合物Pauly反应反应橘黄色橘黄色 His的咪唑基与重氮盐（的咪唑基与重氮盐（重氮苯磺酸重氮苯磺酸）的反应）的反应棕红色棕红色附附：咪唑基的性质：咪唑基的性质 组氨酸含有咪唑基，其

37、组氨酸含有咪唑基，其p pK K2 2值为值为6.06.0，在生理条件下具有缓冲，在生理条件下具有缓冲作用。作用。组组氨氨酸酸中中的的咪咪唑唑基基能能够够发发生生多多种种化化学学反反应应。可可以以与与ATPATP发发生生磷酰化反应，形成磷酸组氨酸，从而使酶活化。磷酰化反应，形成磷酸组氨酸，从而使酶活化。组组氨氨酸酸的的咪咪唑唑基基也也能能发发生生烷烷基基化化反反应应。生生成成烷烷基基咪咪唑唑衍衍生生物，并引起酶活性的降低或丧失。物，并引起酶活性的降低或丧失。羟基参加的反应羟基参加的反应作用：可用于修饰蛋白质（酶）。作用：可用于修饰蛋白质（酶）。二异丙基氟磷酸二异丙基氟磷酸 Ser 和和 Thr

38、 的羟基能够与酸作用形成酯。的羟基能够与酸作用形成酯。在蛋白质在蛋白质分子中，分子中，Ser 常与磷酸结合。常与磷酸结合。Ser 是大多数蛋白水解酶活性中心的主要组分，是大多数蛋白水解酶活性中心的主要组分，多多种酰基化试剂能与酶活性中心的种酰基化试剂能与酶活性中心的 Ser 羟基作用羟基作用，导致酶，导致酶的失活。的失活。Ser 甲硫基参加的反应甲硫基参加的反应Met 侧链上的甲硫基是一个强的亲核中心，侧链上的甲硫基是一个强的亲核中心，易与卤代烷等发生亲核取代反应形成烷基化产易与卤代烷等发生亲核取代反应形成烷基化产物。物。4、R基团对蛋白质功能的贡献基团对蛋白质功能的贡献（1）含羟基的侧链）含

39、羟基的侧链 Ser、Thr、Tyr（2）含巯基的侧链）含巯基的侧链 Cys（3）含咪唑基的侧链）含咪唑基的侧链 His（4）Lys的的-氨基氨基二、氨基酸的功能二、氨基酸的功能 1、作为寡肽、多肽和蛋白质的组成单位；、作为寡肽、多肽和蛋白质的组成单位；2、作为多种生物活性物质的前体；、作为多种生物活性物质的前体；3、作为神经递质；、作为神经递质；4、氧化分解产生、氧化分解产生ATP；5、作为糖异生的前体。、作为糖异生的前体。第五节第五节 氨基酸的分离与纯化技术氨基酸的分离与纯化技术一、电泳一、电泳举例：举例：Glu、Leu、His、Lys 4种氨基酸的混合样品，在种氨基酸的混合样品，在时，泳动

40、方向及相对速度。时，泳动方向及相对速度。Glu Leu His Lys pI二、层析二、层析 层析即色层分析又称色谱层析即色层分析又称色谱(chromatograph)固定相固定相(stationary phase)流动相流动相(mobile phase)1891年年Nerst提出分配定律，即：当一种溶质提出分配定律，即：当一种溶质在两种互不相溶的溶剂中分配时，在一定温度下在两种互不相溶的溶剂中分配时，在一定温度下达到平衡后，溶质在两相中的浓度比为一常数称达到平衡后，溶质在两相中的浓度比为一常数称为为分配系数分配系数(Kd)。物质分配不仅在互不相溶的两液相间分配，物质分配不仅在互不相溶的两液相

41、间分配，也可以在固相也可以在固相-液相间或在气相液相间或在气相-液相间分配层析液相间分配层析系统中的静相可以是固相、液相或固系统中的静相可以是固相、液相或固-液相混合液相混合相（半液体）；流动相可以是液相或气相，它充相（半液体）；流动相可以是液相或气相，它充满于固定相的空隙中，并能流过固定相。满于固定相的空隙中，并能流过固定相。有效分配系数有效分配系数KeffKeff=某一物质在某一物质在流动相中流动相中的总量的总量某一物质在某一物质在固定相中固定相中的总量的总量根据层析的分离原理分类：根据层析的分离原理分类：吸附层析法吸附层析法 分配层析法分配层析法 离子交换层析法离子交换层析法 凝胶层析法

42、（排阻层析法）凝胶层析法（排阻层析法）亲和层析法亲和层析法 疏水层析法疏水层析法根据层析的操作方式分类：根据层析的操作方式分类：柱层析法柱层析法 薄层层析法薄层层析法 纸层析法纸层析法 薄膜层析法薄膜层析法 高效液相层析法（高效液相层析法（HPLC）1 1、柱层析、柱层析分配层析分配层析可以同检测器、记录仪、馏分收集器、输液泵构成层析系统。2、薄层层析、薄层层析吸附层析吸附层析 分辨率高、所需样品量微、层析速度快分辨率高、所需样品量微、层析速度快薄层层析介质薄层层析介质纤维素粉、硅胶和氧化铝粉纤维素粉、硅胶和氧化铝粉盖子盖子层析缸层析缸层析板层析板溶剂溶剂3 3、纸层析、纸层析分配层析分配层析

43、Rf主要与主要与R基的极基的极性有关，溶剂的性有关，溶剂的pH可影响可影响R基的基的极性，氨基酸与极性，氨基酸与滤纸的吸附作用滤纸的吸附作用也影响也影响Rf。纸层析中的纸层析中的Rf值值 Rf=XY溶剂前沿溶剂前沿氨基酸显色点氨基酸显色点滤纸滤纸原点原点4、离子交换层析一种用离子交换树脂作支持、离子交换层析一种用离子交换树脂作支持 剂的层析方法剂的层析方法氨基酸的离子交换分离原理氨基酸的离子交换分离原理若若pIpH pIpH，两性离子带净正电荷，若，两性离子带净正电荷，若pI pH pI pH，两性离子带，两性离子带净负电荷。差值越大，所带的净电荷越多。净负电荷。差值越大，所带的净电荷越多。用氨基酸自动分析仪分析氨基酸用氨基酸自动分析仪分析氨基酸混合物的洗脱曲线（阳离子交换混合物的洗脱曲线（阳离子交换剂）。剂）。洗脱的先后顺序取决于氨基酸的洗脱的先后顺序取决于氨基酸的所带电荷与离子交换树脂的所带电荷与离子交换树脂的静电静电吸引吸引和和疏水相互作用疏水相互作用两者的综合两者的综合作用的结果。作用的结果。