中医药研究常用分子生物学技术.ppt

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1、第二章 遗传物质及遗传信息的传递n除了少数的RNA病毒之外，DNA几乎是所有生物遗传信息的携带者。DNA遗传信息的传递中心法则n遗传信息从DNA到RNA转录n遗传信息从mRNA到蛋白质翻译nDNA模板与模板与mRNA分子及多肽链之间分子及多肽链之间存在共线性关系。存在共线性关系。第一节第一节 DNADNA的变性、复性和的变性、复性和DNADNA杂交杂交n一、变性一、变性(denaturation)(denaturation)n在化学或物理因素的影响下，维系核酸二级结构在化学或物理因素的影响下，维系核酸二级结构的氢键和碱基堆积力受到破坏，的氢键和碱基堆积力受到破坏，DNA双螺旋解旋双螺旋解旋成为

2、单链的过程称为变性。成为单链的过程称为变性。n变性可发生在整个变性可发生在整个DNA分子中，也可发生在局部分子中，也可发生在局部的双螺旋阶段上的双螺旋阶段上。nDNA变性不涉及核苷酸中磷酸二酯键的断裂。变性不涉及核苷酸中磷酸二酯键的断裂。n引引起起DNADNA变变性性的的因因素素有有：酸酸、碱碱（）、热热、某某些些变变性性剂剂（如如尿尿素素、胍胍）和和某某些些有有机机溶溶剂剂（如如乙乙醇醇、丙酮）等。丙酮）等。二、复性（二、复性（renaturationrenaturation）n变性的变性的DNA两条互补单链，在适当条件下重两条互补单链，在适当条件下重新缔合成双链的过程称为新缔合成双链的过程

3、称为DNA复性或退火。复性或退火。n复性可分为两个阶段：首先是复性可分为两个阶段：首先是成核成核（nucleation），然后是），然后是拉链式拉链式(zippering)(zippering)。n复性开始时复性开始时,两条两条DNADNA单链随机碰撞形成局部单链随机碰撞形成局部双链，双链，如果是正确的互补区形成的碱基对，如果是正确的互补区形成的碱基对，就就成核（成核（101020bp20bp）。）。如果不是正确的互补如果不是正确的互补区，就解开，继续碰撞。区，就解开，继续碰撞。n成核后，两条单链的其余部分碱基就像成核后，两条单链的其余部分碱基就像“拉拉链链”哪样完成整个复性过程。哪样完成整个

4、复性过程。DNA复性速度受多种因素影响：复性速度受多种因素影响：DNA大小与信息的多少大小与信息的多少：DNA片段小的片段小的比大的容易复性，反之亦然。信息含量比大的容易复性，反之亦然。信息含量少的比多的容易复性。少的比多的容易复性。离子强度离子强度：通常增加盐浓度，可加速两通常增加盐浓度，可加速两条互补链重新结合的速度。所以，要保条互补链重新结合的速度。所以，要保持单链持单链DNADNA，盐浓度低于，盐浓度低于。DNADNA浓度：浓度：DNADNA浓度越大两条互补链彼此浓度越大两条互补链彼此相遇的可能性越大，复性的速度也就越相遇的可能性越大，复性的速度也就越快。快。三、杂交三、杂交n上述复性

5、上述复性DNA中，如果两条链来源不同，中，如果两条链来源不同，这就叫做杂交分子。这就叫做杂交分子。n杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基序列完全互补，只要有一定同源序性（不序列完全互补，只要有一定同源序性（不同来源）的单链彼此间有一定程度的互补同来源）的单链彼此间有一定程度的互补序列就可以形成杂交链。序列就可以形成杂交链。n杂杂交交分分子子可可以以在在DNADNA和和DNADNA、DNADNA和和RNARNA、RNARNA和和RNARNA以以及及人人工工合合成成的的寡寡核核苷苷酸酸单单链链与与RNARNA或或DNADNA单链单链之间进行。之间进行。第二节第二

6、节 DNADNA的合成的合成n一、半保留复制一、半保留复制nDNADNA复制时，两条链间的氢键破裂并使双链复制时，两条链间的氢键破裂并使双链解旋和分开，然后以每条链为模板、按碱解旋和分开，然后以每条链为模板、按碱基配对原则进行互补合成基配对原则进行互补合成DNADNA，新形成的每，新形成的每个子代个子代DNA的一条链来自亲代的一条链来自亲代DNA，另一，另一条链则是新合成的，这种复制方式称为半条链则是新合成的，这种复制方式称为半保留复制保留复制(semiconservationreplication)。1、复制起点和复制子、复制起点和复制子nDNA复制在生物细胞中要从复制在生物细胞中要从DNA

7、分子上特分子上特定位置开始，这个特定的位置就称为定位置开始，这个特定的位置就称为复制复制起点起点(Originofreplication)，用，用ori表示。表示。nDNA复制从起点开始双向进行直到终点为复制从起点开始双向进行直到终点为止，每一个这样的止，每一个这样的DNA单位称为单位称为复制子复制子或或复制单元复制单元(replicon)。n复制起点在复制起点在DNA内部内部n原核生物只有一个复制子原核生物只有一个复制子n真核生物有多个复制子，真核生物有多个复制子，每个复制子长约每个复制子长约50-200kb。2、DNA复制的特点复制的特点nDNA复制的最主要特点复制的最主要特点（1 1）半

8、保留复制半保留复制n（2 2）半不连续复制半不连续复制(Semi-ondisctinuousreplication)。n在复制起点两条链解开形成复制泡在复制起点两条链解开形成复制泡(replicationbubbles)，DNA向两侧复制向两侧复制形成两个复制叉形成两个复制叉(replicationforks)。n以复制叉移动的方向为基准以复制叉移动的方向为基准，一条链连续，一条链连续复制，为先导链复制，为先导链(leadingstrand)；另一条；另一条链不连续复制，形成链不连续复制，形成冈崎冈崎片段片段(Okaxakifragments)，是后随链，是后随链(laggingstrand)

9、。二、参与二、参与DNA复制的有关物质复制的有关物质n模板模板DNA，三磷酸核苷酸，三磷酸核苷酸(dATP,dGTP，dCTP，dTTP)是是DNADNA合成的原料。合成的原料。n还需要一些酶参与还需要一些酶参与DNA合成合成n(一一)螺旋酶螺旋酶(Helicase)n又称为解旋酶，是一类特殊的蛋白质可以又称为解旋酶，是一类特殊的蛋白质可以促使促使DNA在复制叉处打开双链。在复制叉处打开双链。n螺旋酶可以和单链螺旋酶可以和单链DNA结合，并且与结合，并且与ATP结合，利用结合，利用ATP分解成分解成ADP时产生的能量时产生的能量沿沿DNA链向前运动促使链向前运动促使DNA双链打开。双链打开。(

10、二二)单链单链DNA结合蛋白结合蛋白(SSBP)n单链单链DNA结合蛋白结合蛋白(singlestrandDNAbindingproteinSSBP)能很快地和单链能很快地和单链DNA结合，防止其重新配对形成双链结合，防止其重新配对形成双链DNA或被核酸酶降解。或被核酸酶降解。(三三)DNA拓扑异构酶拓扑异构酶(DNATopisomerase)nDNA拓扑酶催化同一拓扑酶催化同一DNA分子不同超螺旋分子不同超螺旋状态之间的转变。状态之间的转变。nDNA拓扑异构酶有两类拓扑异构酶有两类：拓扑异构酶拓扑异构酶，如，如大肠杆菌的大肠杆菌的蛋白蛋白(MW-110000)；n拓扑异构酶拓扑异构酶，如，如

11、大大肠杆菌中的肠杆菌中的DNA旋转旋转酶酶(DNAgyrase)螺旋与超螺旋螺旋与超螺旋由于强行分开双螺旋末端而由于强行分开双螺旋末端而引发产生的超螺旋结构引发产生的超螺旋结构(四四)引发酶引发酶(Primase)和和RNA聚合酶聚合酶(RNAPolymerase)n引发酶催化引物引发酶催化引物RNA分子的合成分子的合成。nRNA聚合酶也是催化聚合酶也是催化RNA分子的合成。分子的合成。n人们认为后随链前体片段的引物是由引发人们认为后随链前体片段的引物是由引发酶合成的，而先导链的引物是由酶合成的，而先导链的引物是由RNA聚合聚合酶合成的。酶合成的。n可能在大多数情况下，两种类型的引物都可能在大

12、多数情况下，两种类型的引物都是由引发酶合成的，而是由引发酶合成的，而RNA聚合酶的主要聚合酶的主要作用就是通过转录过程而解开局部的作用就是通过转录过程而解开局部的DNA双螺旋。这种作用就称为双螺旋。这种作用就称为转录激活转录激活(transcriptionalactivation)。（五）（五）DNA聚合酶聚合酶(DNAPolymerase)n这类酶的共同性质是这类酶的共同性质是:n1以脱氧核苷酸三磷酸以脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)为前体催化为前体催化合成合成DNA;n2需要模板和引物的存在需要模板和引物的存在;n3不能起始合成新的不能起始合成新的DNA链链;n4催化催化dNTP加到生长中的加

13、到生长中的DNA链的链的3-OH末端末端;n5催化催化DNA合成的方向是合成的方向是53。1、大肠杆菌、大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶n大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶(DNApolymerase，DNApol)n这是这是1956年由年由ArthurKornberg首先发现的首先发现的DNA聚合酶，又称聚合酶，又称Kornber酶。酶。n由一条多肽链组成，约含由一条多肽链组成，约含1000个氨基酸残基，个氨基酸残基，MW为为109KD。n经过枯草杆菌蛋白酶处理后，酶分子分裂成经过枯草杆菌蛋白酶处理后，酶分子分裂成两个片段，大片段分子量为两个片段，大片段分子量为76KD，通常称，通常称为为Klen

14、ow片段片段，小片段的分子量为，小片段的分子量为34KD。DNApol I的功能的功能n1聚合作用聚合作用:在引物在引物RNA-OH末端，以末端，以dNTP为为底物，按模板底物，按模板DNA上的指令由上的指令由DNApol逐个将核逐个将核苷酸加上去，就是苷酸加上去，就是DNApol的聚合作用。的聚合作用。n235外切酶活性外切酶活性校对作用校对作用：从从35 35 方向识别和切除不配对的方向识别和切除不配对的DNADNA生长链末生长链末端的核苷酸。端的核苷酸。n353外切酶活性外切酶活性切除修复作用切除修复作用：从从5 3 5 3 方向水解方向水解DNADNA生长链前方的生长链前方的DNADN

15、A链，链，主要产生主要产生5-5-脱氧核苷酸。脱氧核苷酸。大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶(DNApol)n1970年发现了年发现了DNApol。此酶。此酶MW为为120KD，每个细胞内约有，每个细胞内约有100个酶分子，个酶分子，但活性只有但活性只有DNApol的的5%。该酶的催。该酶的催化特性如下：化特性如下：n(1)聚合作用聚合作用n(2)该酶也具有该酶也具有35外切酶活性，但无外切酶活性，但无53外切酶活性。外切酶活性。n(3)该酶对作用底物的选择性较强该酶对作用底物的选择性较强n(4)该酶不是复制的主要聚合酶该酶不是复制的主要聚合酶大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶(DNApol)

16、nDNApol全酶由多种亚基组成全酶由多种亚基组成n大肠杆菌每个细胞中只有大肠杆菌每个细胞中只有10-20个酶分子个酶分子，尽管该酶在细胞内存在的数量较少，但尽管该酶在细胞内存在的数量较少，但催化脱氧核苷酸掺入催化脱氧核苷酸掺入DNA链的速率分别是链的速率分别是DNA聚合酶聚合酶I I、的的15倍和倍和30倍。倍。nDNA聚合酶聚合酶是细胞内是细胞内DNA复制所必需的复制所必需的酶酶n有聚合作用：有聚合作用：从从53方向合成方向合成DNAnDNApol也有也有35和和53外切酶外切酶活性活性。DNA pol 酶的组成酶的组成亚基分子量(103)其它名称 生物功能140dnaE蛋白，polC蛋白

17、聚合功能和5 3 外切酶活性 253 5 外切酶活性 10 83保证 亚基 52dnaZ蛋白作用的发挥 32dnaX蛋白 40dnaN蛋白，copol 2 2、真核生物的、真核生物的DNA聚合酶聚合酶n真核生物中也具有几种真核生物中也具有几种DNA聚合酶，但这些聚合聚合酶，但这些聚合酶都没有酶都没有35或或53外切酶活性。外切酶活性。n主要的酶主要的酶(占总量的占总量的80-90%)是是DNA聚合酶聚合酶，分子量为分子量为300KD，含有，含有4个或个或5个亚基，主要负责个亚基，主要负责染色体染色体DNA的复制。的复制。nDNA聚合酶聚合酶，分子量为，分子量为45KD，仅含有一条链，仅含有一条

18、链，主要作用是修复核内主要作用是修复核内DNA。nDNADNA聚合酶聚合酶，分子量为，分子量为140KD，存在于线粒体，存在于线粒体内，负责催化线粒体内，负责催化线粒体DNA的复制。的复制。nDNA聚合酶聚合酶，具有具有35核酸外切酶活性核酸外切酶活性。分子量分子量300KD45KD140KD？个数细个数细胞胞20006000/cell聚合作用聚合作用核内核内DNA复制复制修复核内修复核内DNA线粒体线粒体DNA复制复制与与协同协同作用作用35外切酶活外切酶活性性无无无无无无有有真核生物真核生物DNADNA聚合酶种类及作用聚合酶种类及作用（六）（六）DNA连接酶连接酶(DNAligase)nD

19、NA连接酶是连接酶是1967年在三个实验室同时发现的。年在三个实验室同时发现的。n它是一种封闭它是一种封闭DNA链上缺口酶，借助链上缺口酶，借助ATP或或NAD水解提供的能量催化水解提供的能量催化DNA链的链的5-PO4与另一与另一DNA链的链的3-OH生成磷酸二酯键。生成磷酸二酯键。nDNA连接酶连接酶在在DNA复制、修复和重组中起着重要复制、修复和重组中起着重要的作用的作用。n真核生物细胞中的真核生物细胞中的DNA连接酶有两型连接酶有两型 ：DNA连接连接酶酶分子量约为分子量约为200KD，主要存在于生长旺盛细，主要存在于生长旺盛细胞中，胞中，nDNA连接酶连接酶分子量约分子量约85KD，

20、主要存在于生长于，主要存在于生长于不活跃的细胞中不活跃的细胞中(restingcell)。三、三、DNA复制的过程复制的过程nDNA复制过程大致可以分为复制的复制过程大致可以分为复制的引发引发，DNA链的链的延伸延伸和和DNA复制的复制的终止终止三个阶段。三个阶段。n（一）（一）DNADNA复制的引发复制的引发n1 1、前引发过程、前引发过程n（1 1）解开双链：两种方法：）解开双链：两种方法：n螺旋酶在螺旋酶在OriOri处解开双链处解开双链n通过转录激活解开双链通过转录激活解开双链转录激活：转录激活：nRNA聚合酶在聚合酶在Ori处转录一段处转录一段RNA，将双链分开，将双链分开，便于引发

21、体与便于引发体与DNA结合，在先导链模板链上合成结合，在先导链模板链上合成引物引物RNA，这一过程称为转录激活。，这一过程称为转录激活。（2）引发前体（）引发前体（preprimosome)形成形成n单链结合蛋白结合在被解开的双链上。由单链结合蛋白结合在被解开的双链上。由复制因复制因子子X（n蛋白）、蛋白）、Y（n蛋白）、蛋白）、n蛋白蛋白、i i蛋白蛋白、dnaBdnaB蛋白蛋白和和dnaCdnaC蛋白六种蛋白质形成引发前体蛋白六种蛋白质形成引发前体,并并与单链与单链DNADNA结合，这一过程叫前引发过程。结合，这一过程叫前引发过程。2、引发体（、引发体（primosome)形成形成n引发前

22、体与引发前体与引发酶引发酶(primase)组装成引发组装成引发体。引发体可在体。引发体可在DNA上移动，在上移动，在dnaB亚亚基的作用下，识别基的作用下，识别DNA复制起点位置。复制起点位置。n首先在先导链上合成一段首先在先导链上合成一段RNA引物，然后引物，然后引发体沿引发体沿53方向不断移动，在一段方向不断移动，在一段距离上反复合成引物（距离上反复合成引物（primer)primer)。（二）（二）DNA链的延伸链的延伸nDNA新生链的合成由新生链的合成由DNA聚合酶聚合酶所催化所催化。nDNA聚合酶聚合酶在引物在引物3 3-OH-OH端连上核苷酸，以端连上核苷酸，以使使DNADNA新

23、链得以延长。新链得以延长。n由由螺旋酶螺旋酶在复制叉处边移动边解开双链。在复制叉处边移动边解开双链。nDNADNA拓扑异构酶拓扑异构酶要以打开一条链，使正超螺旋要以打开一条链，使正超螺旋状态转变成松弛状态；而状态转变成松弛状态；而DNADNA拓扑异构酶拓扑异构酶(旋旋转酶转酶)可以在可以在DNADNA解链前方不停地继续将负超螺解链前方不停地继续将负超螺旋引入双链旋引入双链DNADNA。n在在DNA复制叉处由两套复制叉处由两套DNA聚合酶聚合酶在同一时在同一时间分别进行复制间分别进行复制DNA前导链和滞后链。前导链和滞后链。引物的切除：引物的切除：nDNA聚合酶聚合酶I发挥发挥53外切酶活性，外

24、切酶活性，切去引物切去引物RNA并填补空缺（缺刻平移），并填补空缺（缺刻平移），留下的缺刻由留下的缺刻由DNA连接酶连接酶连上。连上。(三三)DNA复制的终止复制的终止nDNA复制在复制终止位点处终止复制在复制终止位点处终止。n1、环形、环形DNA分子的终止分子的终止n在单向复制的环形在单向复制的环形DNA分子中，复制终止分子中，复制终止也即它的复制起点。在双向复制的环形也即它的复制起点。在双向复制的环形DNA分子中，有的有固定的终点，而大多分子中，有的有固定的终点，而大多数没有固定的终点。数没有固定的终点。2、线性、线性DNA复制的终止复制的终止n由于引物由于引物RNA的水解，两个子代分子中

25、，各有的水解，两个子代分子中，各有一个一个5端缺少一段核苷酸，而没有一个端缺少一段核苷酸，而没有一个DNA聚聚合酶能填补。合酶能填补。n（1）T7DNA：形成连环分子（：形成连环分子（concatemer)nT7DNA两端各有一段重复的数百个核苷酸，这两端各有一段重复的数百个核苷酸，这叫末端冗余（叫末端冗余（terminalredundancy)。n所以，两个子代所以，两个子代DNA分子中的单链末端可以互分子中的单链末端可以互补，多余的单链部分被补，多余的单链部分被DNAase除去，然后再由除去，然后再由DNA连接酶连接起来形成连环分子。连接酶连接起来形成连环分子。2、线性、线性DNA复制的终

26、止复制的终止n（2）DNA的环化法的环化法nDNA进入宿主细胞内采用环化法，将线性分进入宿主细胞内采用环化法，将线性分子连成环形。子连成环形。n（3）真核细胞）真核细胞DNA末端复制依赖于末端复制依赖于端粒端粒和能够和能够识别或结合端粒的识别或结合端粒的端粒酶端粒酶。n首先在四膜虫中发现。四膜虫端粒中存在一种端首先在四膜虫中发现。四膜虫端粒中存在一种端粒酶（粒酶（telomerase)telomerase)，这种酶能将端粒结构中单，这种酶能将端粒结构中单链尾巴链尾巴5 5 TTGGGG 3 TTGGGG 3延长，延长部分仍是延长，延长部分仍是 5 5 TTGGGG 3TTGGGG 3 。n各种

27、端粒这种富含各种端粒这种富含G G的序列总是突出的序列总是突出12121616个核个核苷酸。苷酸。端粒酶：端粒酶：n端粒酶是一种核蛋白，由端粒酶是一种核蛋白，由RNA和蛋白质构成。和蛋白质构成。n1990年，年，Blackburn等人证明了端粒酶中的等人证明了端粒酶中的RNA是富含是富含G序列的模板。序列的模板。n例如：游仆虫的端粒酶例如：游仆虫的端粒酶RNA含有含有n5CAAAACCCCAAAACC3n端粒酶实际上是一种逆转录酶，模板存在于酶分端粒酶实际上是一种逆转录酶，模板存在于酶分子中。子中。n端粒酶中的端粒酶中的RNA可能还有别的作用。可能还有别的作用。n由端粒酶连上的富含由端粒酶连上

28、的富含G的尾巴弯起来，作为引物的尾巴弯起来，作为引物复制以填补复制以填补5空缺。空缺。四、不需要四、不需要RNA引物的引物的DNA复制复制n有些病毒的基因组是线性有些病毒的基因组是线性DNA，在原核细胞和真，在原核细胞和真核细胞中复制时不需要核细胞中复制时不需要RNA引物引物。n如：腺病毒如：腺病毒DNA和枯草菌噬菌体和枯草菌噬菌体29DNAn复制从复制从DNA的一端开始，而且对两端无选择性，的一端开始，而且对两端无选择性，各占各占50%的机率。的机率。n这些这些DNA复制时，从一端开始，只能利用一条复制时，从一端开始，只能利用一条DNA链作为模板，即以链作为模板，即以35链为模板。这样，链为

29、模板。这样，新合成的新合成的DNA链便将原来的亲代链便将原来的亲代DNA链取代。链取代。n原来的亲代原来的亲代DNA链链(从合成起始端看是从合成起始端看是53链链)作作为单链从双螺旋中释放出来。这条链自身的为单链从双螺旋中释放出来。这条链自身的5和和3可以互补配对，然后在可以互补配对，然后在3端开始以此链为模板端开始以此链为模板重新合成另一条子链。重新合成另一条子链。第三节第三节RNA的合成的合成n一、一、RNA合成的基本特征：合成的基本特征：n1、RNA的前体是四种核糖核苷三磷酸：的前体是四种核糖核苷三磷酸：ATP、GTP、CTP、UTP。2、RNA链的生长方向是链的生长方向是53，核苷三，

30、核苷三磷酸加在新生链的磷酸加在新生链的3端，同时除去一分子端，同时除去一分子焦磷酸而生成磷酸二酯键，焦磷酸又分解焦磷酸而生成磷酸二酯键，焦磷酸又分解为无机磷酸，从而推动反应向聚合方向转为无机磷酸，从而推动反应向聚合方向转移。移。一、一、RNA合成的基本特征：合成的基本特征：n3、转录必须以一条转录必须以一条DNA链为模板，按照碱链为模板，按照碱基配对原则进行转录，因此基配对原则进行转录，因此DNA中的中的A、G、C、T将分别转录成将分别转录成U、C、G、A。在一个转录区。在一个转录区内，一般只有一条内，一般只有一条DNA链可以转录。链可以转录。n4、RNA聚合酶能起始一条新链的合成，起聚合酶能

31、起始一条新链的合成，起始的核苷酸一般是嘌始的核苷酸一般是嘌呤呤核苷三磷酸，而且将在核苷三磷酸，而且将在RNA链的链的5末端保持这一三磷酸基团。末端保持这一三磷酸基团。二、二、RNA聚合酶聚合酶n（一）原核生物（一）原核生物RNA聚合酶聚合酶n原核生物原核生物RNA聚合酶聚合酶全酶为全酶为2n全酶可结合约全酶可结合约60个核苷酸，提示其形状应个核苷酸，提示其形状应为椭圆球形。为椭圆球形。n亚基和其他肽链的结合不很牢固。当亚基和其他肽链的结合不很牢固。当亚基脱离全酶后，剩下的亚基脱离全酶后，剩下的2称为称为核心酶。核心酶。核心酶本身就能催化核苷酸间磷核心酶本身就能催化核苷酸间磷酸二酯键的形成酸二酯

32、键的形成。n亚基的功能可能是识别其相应的启动子。亚基的功能可能是识别其相应的启动子。基因名称基因名称基因图基因图位置位置多肽链多肽链分子量分子量全酶中全酶中的数目的数目功能功能RNA聚聚合合酶的亚基酶的亚基rpoC89.51550001与与DNA结合结合rpoB89.51510001聚合作用的催化位点聚合作用的催化位点rpoD66.5700001识识别别启启动动子子，起起始始转录转录rpoA72365002?110001?转录因子转录因子rho84.5460006转录终止转录终止nusAnusA65690001转录延长，终止转录延长，终止E.coli RNA聚聚合酶的合酶的亚基和亚基和转录因转

33、录因子子 RNA聚合酶可能的结构：（二）真核生物（二）真核生物RNA聚合酶聚合酶n有三类：有三类：nRNA聚合酶聚合酶，存在于核仁，合成，存在于核仁，合成5.8S 5.8S rRNArRNA、18S rRNA18S rRNA、28S rRNA28S rRNA。n聚合酶聚合酶，存在于核质，合成，存在于核质，合成hnRNAhnRNA（mRNAmRNA的前体）和的前体）和snRNAsnRNA。n聚合酶聚合酶，存在于核质，合成，存在于核质，合成tRNA和和5SrRNA以及转录以及转录Alu顺序。顺序。三、启动子三、启动子n（一）原核生物的启动子（一）原核生物的启动子n对对100个启动子在转录上游个启动

34、子在转录上游10和和35处处有两个共同顺序。有两个共同顺序。nPribnow框：框：TATAAT六核苷酸序列称之。六核苷酸序列称之。位于位于10区，是区，是RNA聚合酶牢固结合位点，聚合酶牢固结合位点，简称结合位点。简称结合位点。nSextama框：框：TTGACA六核苷酸序列称之。六核苷酸序列称之。位于位于35区，是区，是RNA聚合酶初始结合位点，聚合酶初始结合位点，RNA聚合酶依靠聚合酶依靠亚基识别该位点，又叫亚基识别该位点，又叫RNARNA聚合酶识别位点聚合酶识别位点Lac CCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGfdG2 CTTTT

35、TGATGCAATTCGCTTTGCTTCTGACTATAATAGACAGGGTAA PL GGCGGGTGTTGACATAAATACCACTTGGCGGTGATACTGAGCACATCA PR GTGCGTGTTGACTATTTTACCTCTGGCGGTGATAATGGTTGCATGTAtRNATyr CGTAACACTTTACAGCGGCGCGTCATTTGATATGATGCGCCCCGCTTSextama框框pribnow+1T82T84G78A65C54A45T80A95T45A60A50T9617bp（二）真核生物的启动子（二）真核生物的启动子n比较了比较了100个启动子，发现真核生

36、物启动子是多个启动子，发现真核生物启动子是多部位结构（部位结构（multipatide)主要有四个部位。主要有四个部位。n1、帽子位点（、帽子位点（capsite)：即转录起始位点。其：即转录起始位点。其碱基大多数是碱基大多数是A（非模板链）两侧各有若干个嘧（非模板链）两侧各有若干个嘧啶核苷酸。啶核苷酸。A为转录起点。为转录起点。n2、TATA框：又称为框：又称为Hogness框。位于框。位于25区附区附近其一致序列为：近其一致序列为：T82A97T93A85A63A83A50，基本基本上都是由上都是由A-T组成。组成。n在在TATA框两侧有富含框两侧有富含G-C碱基对的序列，这是碱基对的序列

37、，这是TATA框发挥重要作用的因素之一。框发挥重要作用的因素之一。（二）真核生物的启动子（二）真核生物的启动子n3、CAAT框：一般位于框：一般位于75区附近。一区附近。一致序列为：致序列为：GGCCAATCT，其头两个，其头两个G的重要性并不亚于的重要性并不亚于CAAT部分。部分。n作用作用：CAAT框控制着转录的频率。框控制着转录的频率。n4、增强子：一般在、增强子：一般在100区以上。单位区以上。单位置较灵活，也可以位于下游或基因内部。置较灵活，也可以位于下游或基因内部。n作用作用：对转录有增强效用：对转录有增强效用四、转录过程四、转录过程n转录的基本过程转录的基本过程无论是原核还是真核

38、细胞，转录的基本过程都包括：无论是原核还是真核细胞，转录的基本过程都包括：模板识别模板识别转录起始转录起始通过启动子通过启动子转录的延伸和终止。转录的延伸和终止。四、转录过程四、转录过程n（一）（一）RNA合成的合成的起始和延伸起始和延伸1、二元复合物的形成、二元复合物的形成（只有全酶和只有全酶和DNA）n（1）封闭的启动子）封闭的启动子复合物复合物n（2）开放性启动子）开放性启动子复合物复合物2、三元复合物的形成、三元复合物的形成（全酶（全酶DNARNA）RNA合成起始合成起始大肠杆菌大肠杆菌RNA聚合酶全酶所识别的启动子区聚合酶全酶所识别的启动子区RNA合成的延伸合成的延伸由于基因转录所引

39、起的由于基因转录所引起的DNA超螺旋结构变化超螺旋结构变化（二）（二）RNA合成的终止合成的终止n转录终止信号存在于已转录的序列中。这转录终止信号存在于已转录的序列中。这种提供终止信号的序列称为终止子种提供终止信号的序列称为终止子（terminator)。n终止子有两类：终止子有两类：n（1）依赖于蛋白质辅助因子才能实现终止）依赖于蛋白质辅助因子才能实现终止作用，这种蛋白子因子称为释放因子，通作用，这种蛋白子因子称为释放因子，通常又称为常又称为因子。因子。n（2）不依赖蛋白质辅助因子就能实现终止）不依赖蛋白质辅助因子就能实现终止作用。作用。1、不依赖、不依赖因子的终止子的特点：因子的终止子的特

40、点：（1）在终止点前有）在终止点前有一段反向重复序一段反向重复序列列（2）方向重复序列）方向重复序列中富含中富含G-C碱基碱基对对（3）在反向重复序）在反向重复序列下游有列下游有68个个A-T对对2、依赖、依赖的终止子的特点：的终止子的特点：（1）在终止点前有）在终止点前有一段反向重复序一段反向重复序列列（2）方向重复序列）方向重复序列中中G-C含量较少含量较少（3）方向重复序列）方向重复序列下游的序列没有下游的序列没有固定特征，其固定特征，其A-T含量较前者低。含量较前者低。终止子终止转录的机制：终止子终止转录的机制：n1、不依赖、不依赖因子：（因子：（1）富含）富含G-C对之后对之后810

41、碱基处，转录会出现跌宕。碱基处，转录会出现跌宕。n（2）反向重复序列形成发夹结构之后，）反向重复序列形成发夹结构之后，阻碍了阻碍了RNA链从三元复合物中释放出来，链从三元复合物中释放出来，使延宕时间延长。使延宕时间延长。n（3）一连串）一连串A转录出一连串转录出一连串Un2、依赖、依赖因子：（因子：（1）G-C含量低，含量低，（2）发夹结构缺乏）发夹结构缺乏U，所以只有，所以只有因子因子可终止转录。可终止转录。五、转录后加工五、转录后加工n（一）转录产物的修饰（一）转录产物的修饰n1、帽子帽子n2、多聚（、多聚（A）尾巴）尾巴真核生物真核生物mRNA的帽子结构的帽子结构（二）转录产物的剪接（二

42、）转录产物的剪接n1、rRNA的剪接的剪接n（1）的三种）的三种rRNA：5SrRNA、16SrRNA、23SrRNA与与tRNA基因混杂，基因混杂，需要剪切。需要剪切。n（2）真核生物）真核生物rRNAn人人rRNA转录初产物为转录初产物为45S，经过剪切成，经过剪切成为为18SrRNA、28SrRNA、。、。n2、tRNA的剪接的剪接n（1）E.colitRNA转录单位是多基因的需转录单位是多基因的需要剪切要剪切n（2）真核生物酵母约）真核生物酵母约400个核个核tRNA基因，基因，有约有约40个基因中含有内含子，内含子长个基因中含有内含子，内含子长1446bp。需要切除内含子。需要切除内

43、含子。n3、hnRNA切除内含子切除内含子n内含子内含子53的拼接点序列为：的拼接点序列为：GUAG。snRNA参与了识别拼接点的参与了识别拼接点的作用。作用。真核生物真核生物hnRNA内含内含子剪切示意子剪切示意图图第四节第四节蛋白质的合成蛋白质的合成n蛋白质是生物信息通路上的终产物，一个蛋白质是生物信息通路上的终产物，一个活细胞在任何发育阶段都需要数千种不同活细胞在任何发育阶段都需要数千种不同的蛋白质。因此，活细胞内时刻进行着各的蛋白质。因此，活细胞内时刻进行着各种蛋白质的合成、修饰、运转和降解反应。种蛋白质的合成、修饰、运转和降解反应。n遗传密码遗传密码三联子三联子n所谓所谓翻译翻译是指

44、将是指将mRNA链上的核苷酸从一个特定链上的核苷酸从一个特定的起始位点开始，按每的起始位点开始，按每3个核苷酸代表一个氨基酸个核苷酸代表一个氨基酸的原则，依次合成一条多肽链的过程。这的原则，依次合成一条多肽链的过程。这3个核苷个核苷酸就是一个酸就是一个密码子密码子。n翻译从起始密码子翻译从起始密码子AUG开始，沿开始，沿mRNA53方方向连续阅读密码子，直至终止密码子为止，生成向连续阅读密码子，直至终止密码子为止，生成一条具有特定序列的多肽链一条具有特定序列的多肽链蛋白质。蛋白质。Crick关于关于tRNA分子破译分子破译mRNA遗传密码三联遗传密码三联子的原始构想子的原始构想n三联子密码及其

45、破译三联子密码及其破译n因为因为mRNA中只有中只有4种核苷酸，而蛋白质中有种核苷酸，而蛋白质中有20种氨基酸，以一种核苷酸代表一种氨基酸是不可种氨基酸，以一种核苷酸代表一种氨基酸是不可能的。若以两种核苷酸作为一个氨基酸的密码能的。若以两种核苷酸作为一个氨基酸的密码（二联子），它们能代表的氨基酸也只有（二联子），它们能代表的氨基酸也只有42=16种。若以种。若以3个核苷酸代表一个氨基酸，有个核苷酸代表一个氨基酸，有43=64种种密码子，满足了编码密码子，满足了编码20种氨基酸的需要。种氨基酸的需要。用核苷酸的插入或删除实验证明用核苷酸的插入或删除实验证明mRNA模板上每三个核模板上每三个核苷酸

46、组成一个密码子苷酸组成一个密码子n遗传密码的性质遗传密码的性质n1.密码的简并性密码的简并性4种核苷酸可组成种核苷酸可组成64个密码子，现在已经知道其个密码子，现在已经知道其中中61个是编码氨基酸的密码子，另外个是编码氨基酸的密码子，另外3个即个即UAA、UGA和和UAG并不代表任何氨基酸，它们是终止密并不代表任何氨基酸，它们是终止密码子，不能与码子，不能与tRNA的反密码子配对，但能被终止的反密码子配对，但能被终止因子或释放因子识别，终止肽链的合成。因子或释放因子识别，终止肽链的合成。通用遗传密码及相应的氨基酸通用遗传密码及相应的氨基酸nC亮氨酸（亮氨酸（Leu，L）脯氨酸（）脯氨酸（Pro

47、，P）组）组氨酸（氨酸（His，H）精氨酸（）精氨酸（Arg，R）U亮氨亮氨酸（酸（Leu，L）脯氨酸（）脯氨酸（Pro，P）组氨酸）组氨酸（His，H）精氨酸（）精氨酸（Arg，R）C亮氨酸亮氨酸（Leu，L）脯氨酸（）脯氨酸（Pro，P）谷氨酰胺）谷氨酰胺（Gln，Q）精氨酸（）精氨酸（Arg，R）A亮氨酸亮氨酸（Leu，L）脯氨酸（）脯氨酸（Pro，P）谷氨酰胺）谷氨酰胺（Gln，Q）精氨酸（）精氨酸（Arg，R）GnA异亮氨酸（异亮氨酸（Ile，I）苏氨酸（）苏氨酸（Thr，T）天）天冬酰胺（冬酰胺（Asn，N）丝氨酸（）丝氨酸（Ser，S）U异异亮氨酸（亮氨酸（Ile，I）苏氨酸（）

48、苏氨酸（Thr，T）天冬酰）天冬酰胺（胺（Asn，N）丝氨酸（）丝氨酸（Ser，S）C异亮氨异亮氨酸（酸（Ile，I）苏氨酸（）苏氨酸（Thr，T）赖氨酸（）赖氨酸（Lys，K）精氨酸（）精氨酸（Arg，R）A甲硫氨酸（甲硫氨酸（Met，M）苏氨酸（）苏氨酸（Thr，T）赖氨酸（）赖氨酸（Lys，K）精氨酸（）精氨酸（Arg，R）GnG缬氨酸（缬氨酸（Val，V）丙氨酸（）丙氨酸（Ala，A）天冬）天冬氨酸（氨酸（Asn，N）甘氨酸（）甘氨酸（Gly，G）U缬氨缬氨酸（酸（Val，V）丙氨酸（）丙氨酸（Ala，A）天冬氨酸）天冬氨酸（Asn，N）甘氨酸（）甘氨酸（Gly，G）C缬氨酸缬氨酸（V

49、al，V）丙氨酸（）丙氨酸（Ala，A）谷氨酸（）谷氨酸（Glu，E）甘氨酸（）甘氨酸（Gly，G）A缬氨酸（缬氨酸（Val，V）丙氨酸（）丙氨酸（Ala，A）谷氨酸（）谷氨酸（Glu，E）甘）甘氨酸（氨酸（Gly，G）Gn除色氨酸（除色氨酸（UGG）只有一个密码子外，其他氨基）只有一个密码子外，其他氨基酸都有一个以上的密码子。酸都有一个以上的密码子。9种氨基酸有种氨基酸有2个密码个密码子，子，1种氨基酸有种氨基酸有3个密码子，个密码子，5种氨基酸有种氨基酸有4个密个密码子，码子，3种氨基酸有种氨基酸有6个密码子。个密码子。n由一种以上密码子编码同一个氨基酸的现象称为由一种以上密码子编码同一个

50、氨基酸的现象称为简并简并（degeneracy），对应于同一氨基酸的密码），对应于同一氨基酸的密码子称为子称为同义密码子同义密码子（synonymous codon）。）。nAUG和和GUG既是甲硫氨酸及缬氨酸的密码子又是既是甲硫氨酸及缬氨酸的密码子又是起始密码子起始密码子。密码子的兼并性密码子的兼并性n3.密码子与反密码子的相互作用密码子与反密码子的相互作用tRNA的反密码子的反密码子在核糖体内是通过碱基的反向配对与在核糖体内是通过碱基的反向配对与mRNA上的上的密码子相互作用的。密码子相互作用的。1966年，年，Crick提出提出摆动假摆动假说说（wobblehypothesis），），解