蛋白质的分离纯化和表征.ppt

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1、蛋白质的分离纯化和表征 一、蛋白质的酸碱性质一、蛋白质的酸碱性质 二、蛋白质分子的大小和空间结构二、蛋白质分子的大小和空间结构 三、蛋白质的胶体三、蛋白质的胶体 性质与蛋白质的沉淀性质与蛋白质的沉淀 四、蛋白质分离纯化的一般原则四、蛋白质分离纯化的一般原则 五、蛋白质的分离纯化方法五、蛋白质的分离纯化方法 六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定一、蛋白质的酸碱性质一、蛋白质的酸碱性质二、蛋白质分子的大小和空间结构二、蛋白质分子的大小和空间结构蛋白质分子量很大，相对分子量变化范围在蛋白质分子量很大，相对分子量变化范围在6000-10000006000-1000000或更大一

2、些。或更大一些。测定蛋白质分子量的方法：测定蛋白质分子量的方法：1.1.根据蛋白质化学组成测定最低相对分子量根据蛋白质化学组成测定最低相对分子量2.2.渗透压法测定相对分子量渗透压法测定相对分子量3.3.蛋白质的扩散和扩散系数蛋白质的扩散和扩散系数4.4.沉降分析法测定蛋白质相对分子量沉降分析法测定蛋白质相对分子量5.5.凝胶过滤法测定相对分子量凝胶过滤法测定相对分子量聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子量聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子量蛋白质有四级结构蛋白质有四级结构 肽链中各种氨基酸相互联接的顺序是蛋白质的初级结构，肽链中各种氨基酸相互联接的顺序是蛋白质的初级结构，也叫一级结构。也叫一级结构

3、。多肽链主链骨架中的若干肽段，通过氢键，形成有规则多肽链主链骨架中的若干肽段，通过氢键，形成有规则的构象，这称为二级结构。的构象，这称为二级结构。-螺旋螺旋 -折叠折叠 无规线团无规线团 在二级结构的基础上，多肽链间通过氨基酸残基侧链的在二级结构的基础上，多肽链间通过氨基酸残基侧链的相互作用而进行盘旋和折叠，因而产生的特定的三维空间结相互作用而进行盘旋和折叠，因而产生的特定的三维空间结构，这称为三级结构，也称为蛋白质的亚基。构，这称为三级结构，也称为蛋白质的亚基。各个亚基在低聚蛋白中的空间排布及相互作用，称为蛋各个亚基在低聚蛋白中的空间排布及相互作用，称为蛋白质的四级结构。白质的四级结构。蛋白

4、质的生理活性是由二级、三级、四级结构来决定的蛋白质的生理活性是由二级、三级、四级结构来决定的。三、蛋白质的胶体性质与三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀蛋白质的沉淀（1）蛋白质的胶体性质（2）蛋白质的沉淀 分散相质点在胶体系统中保持稳定，需要具备分散相质点在胶体系统中保持稳定，需要具备3 3个条件：第一，分散相的质个条件：第一，分散相的质点大小在点大小在1 1100nm100nm范围内，这样大小的质点在动力学上是稳定的，介质分子范围内，这样大小的质点在动力学上是稳定的，介质分子对这种质点碰撞的合力不等于零，使它能在介质中作不断的布朗运动对这种质点碰撞的合力不等于零，使它能在介质中作不断的布朗运动

5、(Brown(Brown movement)movement)；第二，分散相的质点带有同种净电荷，互相排斥，不易聚集成大；第二，分散相的质点带有同种净电荷，互相排斥，不易聚集成大颗而沉淀；第三，分散相的质点能与溶剂形成溶剂化层，例如与水形成水化颗而沉淀；第三，分散相的质点能与溶剂形成溶剂化层，例如与水形成水化层层(hydration mantle)(hydration mantle)，质点有了水化层，相互间不易靠拢而聚集。，质点有了水化层，相互间不易靠拢而聚集。（1）蛋白质的胶体性质 蛋白质的分子大小属于胶体质点的范围。蛋白质的分子大小属于胶体质点的范围。蛋白质溶液是一种亲水胶体，蛋白质分子表

6、面的亲水基团，如一蛋白质溶液是一种亲水胶体，蛋白质分子表面的亲水基团，如一NHNH2 2，-COOH,-OHCOOH,-OH以及以及 CO-NH-CO-NH-等，在水溶液中能与水分子起水化作用，使蛋白等，在水溶液中能与水分子起水化作用，使蛋白质分子表面形成一个水化层，每克蛋白质分子能结合克水。质分子表面形成一个水化层，每克蛋白质分子能结合克水。蛋白质分子表面上的可解离基团，在适当的蛋白质分子表面上的可解离基团，在适当的pHpH条下都带有相同的条下都带有相同的净电荷，与其周围的反离子构成稳定的双电层。净电荷，与其周围的反离子构成稳定的双电层。蛋白质溶液由于具有水化层蛋白质溶液由于具有水化层 双电

7、层两方面的稳定因素，所以作为双电层两方面的稳定因素，所以作为胶体系统是相当稳定的，如无外界因素的影响，就不致互相凝集而沉淀。胶体系统是相当稳定的，如无外界因素的影响，就不致互相凝集而沉淀。蛋白质溶液也和一般的胶体系统一样具有丁达尔效应、布朗运动以及蛋白质溶液也和一般的胶体系统一样具有丁达尔效应、布朗运动以及不能通过半透膜。不能通过半透膜。（2）蛋白质的沉淀 蛋白质在溶液中的稳定性是有条件的、相对的。如果条件发生改变，蛋白质在溶液中的稳定性是有条件的、相对的。如果条件发生改变，破坏了蛋白质溶液的稳定性，蛋白质就会从溶液中沉淀出来。蛋白质溶液破坏了蛋白质溶液的稳定性，蛋白质就会从溶液中沉淀出来。蛋

8、白质溶液的稳定性既然与质点大小、电荷和水化作用有关，那么很自然，任何影响的稳定性既然与质点大小、电荷和水化作用有关，那么很自然，任何影响这些条件的因素都会影响蛋白质溶液的稳定性。这些条件的因素都会影响蛋白质溶液的稳定性。盐析法盐析法 有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法 重金属盐沉淀法重金属盐沉淀法 生物碱试剂和某些酸类沉淀法生物碱试剂和某些酸类沉淀法 加热变性沉淀法加热变性沉淀法 盐析法盐析法 盐析法向蛋白质溶液中加入大量的中性盐（硫盐析法向蛋白质溶液中加入大量的中性盐（硫酸胺、硫酸钠或氯化钠等），使蛋白质脱去水化酸胺、硫酸钠或氯化钠等），使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀。盐析沉淀一般不引起蛋白质变性。

9、层而聚集沉淀。盐析沉淀一般不引起蛋白质变性。当除去盐后，复可溶解。当除去盐后，复可溶解。有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法 向蛋白质溶液中加入一定量的极性有机溶剂向蛋白质溶液中加入一定量的极性有机溶剂（甲醇、乙醇或丙酮等），因引起蛋白质脱去水（甲醇、乙醇或丙酮等），因引起蛋白质脱去水化层以及降低介电常数而增加带电质点间的相互化层以及降低介电常数而增加带电质点间的相互作用，致使蛋白质颗粒容易凝集而沉淀。有机溶作用，致使蛋白质颗粒容易凝集而沉淀。有机溶剂沉淀法，如果控制在低温下操作并且尽量缩短剂沉淀法，如果控制在低温下操作并且尽量缩短处理的时间则可使变性速度减慢。处理的时间则可使变性速度减慢。重金属盐沉

10、淀法重金属盐沉淀法 当溶液当溶液pHpH大于等电点时，蛋白质颗粒带负电荷，大于等电点时，蛋白质颗粒带负电荷，这样它就容易与重金属离子结合成不溶性盐而沉这样它就容易与重金属离子结合成不溶性盐而沉淀。误服重金属盐的病人可口服大量牛乳或豆浆淀。误服重金属盐的病人可口服大量牛乳或豆浆等蛋白质进行解救就是因为它能和重金属离子形等蛋白质进行解救就是因为它能和重金属离子形成不溶性盐，然后再服用催吐剂排出体外。重金成不溶性盐，然后再服用催吐剂排出体外。重金属盐常能使蛋白质变性，这可能是因为重金属盐属盐常能使蛋白质变性，这可能是因为重金属盐水解生成酸或碱的缘故。水解生成酸或碱的缘故。生物碱试剂和某些酸类沉淀法生

11、物碱试剂和某些酸类沉淀法 生物碱试剂是指能引起生物碱沉淀的一类试剂，如骤酸生物碱试剂是指能引起生物碱沉淀的一类试剂，如骤酸也称单宁酸苦味酸即也称单宁酸苦味酸即2 2，4 4，6-6-三硝基酚，钨酸和碘化钾等。三硝基酚，钨酸和碘化钾等。某些酸类指的是三氯醋酸，磺基水杨酸和硝酸等。当溶某些酸类指的是三氯醋酸，磺基水杨酸和硝酸等。当溶液液pHpH小于等电点时，蛋白质颗粒带正电荷，容易与生物碱小于等电点时，蛋白质颗粒带正电荷，容易与生物碱试剂和酸类的酸根负离子发生反应生成不溶性盐而沉淀。试剂和酸类的酸根负离子发生反应生成不溶性盐而沉淀。这类沉淀反应经常被临床检验部门用来除去体液中干扰测这类沉淀反应经常

12、被临床检验部门用来除去体液中干扰测定的蛋白质。定的蛋白质。加热变性沉淀法加热变性沉淀法 几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固。少量盐类促进几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固。少量盐类促进蛋白质加热凝固。当蛋白质处于等电点时，加热凝固最完蛋白质加热凝固。当蛋白质处于等电点时，加热凝固最完全和最迅速。加热变性引起蛋白质凝固沉淀的原因可能是全和最迅速。加热变性引起蛋白质凝固沉淀的原因可能是由于热变性是蛋白质天然结构解体，疏水基外露，因而破由于热变性是蛋白质天然结构解体，疏水基外露，因而破坏了水化层，同时由于蛋白质处于等电点也破坏了带电状坏了水化层，同时由于蛋白质处于等电点也破坏了带电状态。我国很早就创

13、造了将大豆蛋白质的浓溶液加热并点入态。我国很早就创造了将大豆蛋白质的浓溶液加热并点入少量盐卤（含少量盐卤（含MgClMgCl2 2)的制豆腐的方法，这是成功的应用的制豆腐的方法，这是成功的应用加热变性沉淀蛋白质的一个例子。加热变性沉淀蛋白质的一个例子。四、蛋白质分离纯化的一般原则四、蛋白质分离纯化的一般原则 1.1.前处理前处理 2.2.粗分级分离粗分级分离 3.3.细分级分离细分级分离 动物材料应先剔除结缔组织动物材料应先剔除结缔组织和脂肪组织；和脂肪组织；种子材料应先去壳甚至去种种子材料应先去壳甚至去种皮以免受单宁等物质的污染，皮以免受单宁等物质的污染，油料种子最好先用低沸点的油料种子最好

14、先用低沸点的有机溶剂如乙醚等脱脂。有机溶剂如乙醚等脱脂。然后根据不同的情况，选择然后根据不同的情况，选择适当的方法，将组织和细胞适当的方法，将组织和细胞破碎。动物组织和细胞可用破碎。动物组织和细胞可用电动捣碎机电动捣碎机 或匀浆器破碎或匀浆器破碎或用超声波处理破碎。或用超声波处理破碎。1.1.前处理前处理 植物组织和细胞，由于具有由纤维素、半纤维素和果胶等物质组成植物组织和细胞，由于具有由纤维素、半纤维素和果胶等物质组成的细胞壁，一般需要用与石英砂或玻璃粉和适当的提取液一起研磨的的细胞壁，一般需要用与石英砂或玻璃粉和适当的提取液一起研磨的方法破碎或用纤维素酶处理也能达到目的。方法破碎或用纤维素

15、酶处理也能达到目的。细菌整个细菌细胞壁的骨架实际上是一个借共价键连接而成的肽肽细菌整个细菌细胞壁的骨架实际上是一个借共价键连接而成的肽肽聚糖囊状大分子，非常坚韧。破碎细菌细胞壁的常用方法有超声波震聚糖囊状大分子，非常坚韧。破碎细菌细胞壁的常用方法有超声波震荡，与砂研磨、高压挤压或溶菌酶处理（以分解肽聚糖）等。组织和荡，与砂研磨、高压挤压或溶菌酶处理（以分解肽聚糖）等。组织和细胞破碎以后，选择适当的缓冲液把所要的蛋白质提取出来。细胞碎细胞破碎以后，选择适当的缓冲液把所要的蛋白质提取出来。细胞碎片等不溶物用离心或过滤等方法除去。片等不溶物用离心或过滤等方法除去。如果所要的蛋白质主要集中在某一细胞组

16、分，如细胞核、染色体、如果所要的蛋白质主要集中在某一细胞组分，如细胞核、染色体、核糖体或可溶性的细胞质等，则可利用差速离心方法将它们分开，收核糖体或可溶性的细胞质等，则可利用差速离心方法将它们分开，收集该细胞组分作为下步纯化的材料。集该细胞组分作为下步纯化的材料。2.2.粗分级分离粗分级分离 当蛋白质提取液（有时还杂有核酸、多糖之类）获得后，当蛋白质提取液（有时还杂有核酸、多糖之类）获得后，选用一套适当的方法，将所要的蛋白质与其他杂蛋白分离选用一套适当的方法，将所要的蛋白质与其他杂蛋白分离开来。一般这一步的分级分离用盐析、等电点沉淀和有机开来。一般这一步的分级分离用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分

17、级分离等方法。这些方法的特点是简便、处理量大溶剂分级分离等方法。这些方法的特点是简便、处理量大既能除去大量杂质（包括脱盐），又能浓缩蛋白质溶液。既能除去大量杂质（包括脱盐），又能浓缩蛋白质溶液。有些蛋白质提取液体积较大，又不适于用沉淀或盐析法浓有些蛋白质提取液体积较大，又不适于用沉淀或盐析法浓缩，则可采用超过滤、凝胶过滤、冷冻真空干燥或其他方缩，则可采用超过滤、凝胶过滤、冷冻真空干燥或其他方法（如聚乙二醇浓缩法）进行浓缩。法（如聚乙二醇浓缩法）进行浓缩。3.3.细分级分离细分级分离 结晶是蛋白质分离纯化的最后步骤。尽管结晶并不能保证蛋白质一定结晶是蛋白质分离纯化的最后步骤。尽管结晶并不能保证蛋

18、白质一定是均一的，但只有某种蛋白质在溶液中数量上占优势时才能形成结晶。是均一的，但只有某种蛋白质在溶液中数量上占优势时才能形成结晶。结晶过程本身也伴随着一定程度的纯化，而重结晶又可除去少量夹杂的结晶过程本身也伴随着一定程度的纯化，而重结晶又可除去少量夹杂的蛋白质。由于结晶中从未发现过变性蛋白质，因此蛋白质的结晶不仅是蛋白质。由于结晶中从未发现过变性蛋白质，因此蛋白质的结晶不仅是纯度的一个标志，也是断定制品处于天然状态的有力指标。纯度的一个标志，也是断定制品处于天然状态的有力指标。一般使用层析法包括凝胶过滤，离子交换层析，吸附层析一般使用层析法包括凝胶过滤，离子交换层析，吸附层析以及亲和层析等。

19、必要时还可选择电泳法，包括区带电泳、以及亲和层析等。必要时还可选择电泳法，包括区带电泳、等电聚焦等作为最后的纯化步骤。用于细分级分离的方法一等电聚焦等作为最后的纯化步骤。用于细分级分离的方法一般规模较小，但分辨率很高。般规模较小，但分辨率很高。五、蛋白质的分离纯化方法五、蛋白质的分离纯化方法（一）根据分子大小不同的纯化方法（二）利用溶解度差别的纯化方法（三）根据电荷不同的纯化方法（四）利用选择性吸附的纯化方法（五）利用配体的特异性亲和力的纯化方法（一）根据分子大小不同的纯化方法 1.1.透析和超滤透析和超滤 2.2.密度梯度离心密度梯度离心 3.3.凝胶过滤凝胶过滤1.1.透析和超滤透析和超滤

20、半透膜袋半透膜袋蛋白质溶液蛋白质溶液透析液透析液磁棒磁棒 磁力搅拌器磁力搅拌器 透析是利用蛋白质等大分子不透析是利用蛋白质等大分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质能通过半透膜的性质，使蛋白质和其它小分子物质如无机盐单糖和其它小分子物质如无机盐单糖等分开。常用的半透膜：等分开。常用的半透膜：玻璃纸（赛璐玢纸，玻璃纸（赛璐玢纸，cellophane paper）火绵纸（赛璐玎纸火绵纸（赛璐玎纸,celloidin paper）其他改型纤维素材料其他改型纤维素材料超过滤超过滤（ultrafiltration）利用压力、抽滤（利用压力、抽滤（A）或离）或离心力（心力（B）等多种形式，强行使）等多种形式，

21、强行使水和其它小分子溶质通过半透水和其它小分子溶质通过半透膜，而蛋白质被截留在膜上，膜，而蛋白质被截留在膜上，以达到浓缩和脱盐目的。滤膜以达到浓缩和脱盐目的。滤膜有多种规格，可选择性的截留有多种规格，可选择性的截留相对分子量不同的蛋白质。相对分子量不同的蛋白质。为了避免被膜截留的蛋白质为了避免被膜截留的蛋白质在膜表面上堆积，现常用在膜表面上堆积，现常用截向截向流过滤流过滤的方法，即液体在泵驱的方法，即液体在泵驱动下沿着与膜表面相切方向流动下沿着与膜表面相切方向流动，在膜上形成压力，使部分动，在膜上形成压力，使部分液体透过膜，而另一部分液体液体透过膜，而另一部分液体切向地流过表面将被膜截留的切向

22、地流过表面将被膜截留的蛋白质分子冲走。蛋白质分子冲走。滤膜滤膜抽气抽气滤膜滤膜离心离心AB2.密度梯度离心法（密度梯度离心法（density gradient）生物大分子及颗粒的沉降不仅生物大分子及颗粒的沉降不仅决定于它的大小，而且也取决于决定于它的大小，而且也取决于它的密度。颗粒在具有密度梯度它的密度。颗粒在具有密度梯度的介质中离心时，质量和密度大的介质中离心时，质量和密度大的颗粒沉降的快，并且每种蛋白的颗粒沉降的快，并且每种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的质颗粒沉降到与自身密度相等的介质密度梯度时，即停止不前，介质密度梯度时，即停止不前，最后各自在离心管中被分离成独最后各自在离心管中被分离

23、成独立的区带。分成区带的样品可以立的区带。分成区带的样品可以在管底刺一个小孔逐滴放出，分在管底刺一个小孔逐滴放出，分步收集。常用的介质有步收集。常用的介质有蔗糖蔗糖、氯氯化铯等。化铯等。滴加样品滴加样品离离心心管管蔗糖密度梯度蔗糖密度梯度蔗糖浓度蔗糖浓度3.3.凝胶过滤凝胶过滤 原原理理：凝凝胶胶层层析析也也称称为为排排阻阻凝凝胶胶层层析析、凝凝胶胶过过滤滤和和分分子子筛筛层层析析。它它是是60 年年代代发发展展起起来来的的，利利用用凝凝胶胶把把物物质质按按分分子子大大小小不不同同进进行行分分离离的的一一种种方方法法。由由于于被被分分离离物物质质的的分分子子大大小小（直直径径）和和形形状状不不

24、同同，洗洗脱脱时时，大大分分子子物物质质由由于于直直径径大大于于凝凝胶胶网网孔孔不不能能进进入入凝凝胶胶内内部部，只只能能沿沿着着凝凝胶胶颗颗粒粒间间的的孔孔隙隙，随随溶溶剂剂向向下下移移动动，因因此此流流程程短短，首首先先流流出出层层析析柱柱，而而小小分分子子物物质质，由由于于直直径径小小于于凝凝胶胶网网孔孔，能能自自由由进进出出胶胶粒粒网网孔孔，使使之之洗脱时流程增长，移动速度慢而后流出层析柱。洗脱时流程增长，移动速度慢而后流出层析柱。应用应用 测定分子量测定分子量分子筛层析分子筛层析原理示意图原理示意图分分子子筛筛层层析析与与洗洗脱脱曲曲线线凝胶颗粒凝胶颗粒收收集集蛋蛋白白质质管管蛋白质

25、混合物蛋白质混合物大分子大分子从柱上面加缓冲溶液从柱上面加缓冲溶液小分子小分子洗脱体积（洗脱体积（Ve）凝胶柱凝胶柱大分子大分子小分子小分子Ve1Ve2V0蛋白质蛋白质Mr=49,000洗出洗出液中液中的蛋的蛋白质白质浓度浓度洗脱体积（洗脱体积（mL）未知未知logMr洗脱体积与相对分子质量的关系洗脱体积与相对分子质量的关系Andrews的经验公式：的经验公式：logMr=K1-K2(Ve/Vo)球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白MrMrMrMr“选择性曲线选择性曲线选择性曲线选择性曲线”G-200G-100logMrKav（二）利用溶解度差别的纯化方法 1.等电沉淀和PH控制 2.蛋白质的盐溶和盐析

26、3.有机溶剂分级分离 4.温度对蛋白质溶解度的影响1.等电沉淀和PH控制蛋白质处于等电点时，其净电荷为零，由于相邻蛋白质分子之间没有静电蛋白质处于等电点时，其净电荷为零，由于相邻蛋白质分子之间没有静电斥力而趋于聚集沉淀。因此在其他条件相同时，它的溶解度达到最低点。斥力而趋于聚集沉淀。因此在其他条件相同时，它的溶解度达到最低点。在等电点以上或以下的在等电点以上或以下的pHpH时，蛋白质分子携带同种符号的净电荷而相互排时，蛋白质分子携带同种符号的净电荷而相互排斥，阻止了单个分子聚集成沉淀，因此溶解度较大。在其等电点斥，阻止了单个分子聚集成沉淀，因此溶解度较大。在其等电点(pH 5.2-(pH 5.

27、2-5.3)5.3)时达到最低值，在等电点两侧的时达到最低值，在等电点两侧的pHpH下，其溶解度迅速上升；不同的蛋下，其溶解度迅速上升；不同的蛋白质具有不同的等电点，利用蛋白质在等电点时溶解度最低的原理，可以白质具有不同的等电点，利用蛋白质在等电点时溶解度最低的原理，可以把蛋白质混合物分开。把蛋白质混合物分开。当当pHpH被调至蛋白质混合物中某种成分的等电点被调至蛋白质混合物中某种成分的等电点pHpH时，这种蛋白质的大部分时，这种蛋白质的大部分或全部将沉淀下来，那些等电点高于或低于该或全部将沉淀下来，那些等电点高于或低于该pHpH的蛋白质则仍留在溶液中的蛋白质则仍留在溶液中这样沉淀出来的蛋白质

28、保持着天然构象，能重新溶解于适当的这样沉淀出来的蛋白质保持着天然构象，能重新溶解于适当的pHpH和一定浓和一定浓度的盐溶液中。度的盐溶液中。2.蛋白质的盐溶和盐析低浓度的中性盐可以增加蛋白质的溶解度，这种现象称为低浓度的中性盐可以增加蛋白质的溶解度，这种现象称为盐溶盐溶(salting in),(salting in),盐溶作用主要是由于蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带盐溶作用主要是由于蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质分子与水分子间的电层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质分子与水分子间的相互作用却加强，因而溶解度增高。球蛋白溶液在透析过相互作用却加强，因而溶解度增

29、高。球蛋白溶液在透析过程中往往沉淀析出，这就是因为透析除去了盐类离子，使程中往往沉淀析出，这就是因为透析除去了盐类离子，使蛋白质分子间的相互吸引增加，引起蛋白质分子的凝集并蛋白质分子间的相互吸引增加，引起蛋白质分子的凝集并沉淀。表明中性盐对球状蛋白质的溶解度有显著的影响。沉淀。表明中性盐对球状蛋白质的溶解度有显著的影响。3.有机溶剂分级分离（1 1）有机溶剂可以使蛋白质沉淀）有机溶剂可以使蛋白质沉淀 主要有乙醇、丙酮、主要有乙醇、丙酮、乙酸乙酯等。乙酸乙酯等。（2 2）有机溶剂可以破坏水化膜、造成一个低介电区。）有机溶剂可以破坏水化膜、造成一个低介电区。（3 3）有分级分离现象）有分级分离现象

30、（4 4）要求对有机溶剂低温预冷。）要求对有机溶剂低温预冷。4.温度对蛋白质溶解度的影响在一定温度范围内，约在一定温度范围内，约0-400-40之间，大部分球状之间，大部分球状蛋白质的溶解度随温度升高而增加，但也有例外，蛋白质的溶解度随温度升高而增加，但也有例外，例如人的血红蛋白从例如人的血红蛋白从0 0到到2525，溶解度随温度上升，溶解度随温度上升而降低。在而降低。在40-5040-50以上开始变性，一般在中性以上开始变性，一般在中性pHpH介质中即失去溶解力。大多数蛋白质在低温下比介质中即失去溶解力。大多数蛋白质在低温下比较稳定，因此蛋白质的分级分离操作一般都在较稳定，因此蛋白质的分级分

31、离操作一般都在0 0 或更低的温度下进行。或更低的温度下进行。（三）根据电荷不同的纯化方法 1.1.电泳电泳 2.2.聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 3.3.毛细管电泳毛细管电泳 4.4.等电聚焦等电聚焦 5.5.层析聚焦层析聚焦 6.6.离子交换层析离子交换层析1.1.电泳电泳 电泳分离蛋白质是根据蛋白质在电场中的迁移的差别达到分电泳分离蛋白质是根据蛋白质在电场中的迁移的差别达到分离目的的。蛋白质样品加到一块预先制好的凝胶介质上，只要离目的的。蛋白质样品加到一块预先制好的凝胶介质上，只要在凝胶的两端加上电场，就可以达到分离蛋白质的目的，这样在凝胶的两端加上电场，就可以达到分离蛋白质的目

32、的，这样的电泳称之凝胶电泳（的电泳称之凝胶电泳（gel electrophoresisgel electrophoresis）。凝胶可以是）。凝胶可以是淀粉凝胶（淀粉凝胶（starch gelstarch gel）、琼脂糖凝胶（）、琼脂糖凝胶（agarose gelagarose gel）和聚）和聚丙烯酰胺凝胶（丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gelpolyacrylamide gel）。一般凝胶介质中的）。一般凝胶介质中的pHpH被维持在碱性区，目的是使大多数蛋白质都带有负电荷，这样被维持在碱性区，目的是使大多数蛋白质都带有负电荷，这样它们可以向阳极迁移。蛋白质的迁移与蛋白质的质

33、量和带电荷它们可以向阳极迁移。蛋白质的迁移与蛋白质的质量和带电荷的多少有关。的多少有关。电电泳泳技技术术分分类类垂直板电泳垂直板电泳毛细管电泳毛细管电泳水平板电泳水平板电泳电电泳泳支支持持物物滤纸滤纸凝胶凝胶薄膜薄膜圆盘电泳圆盘电泳2.2.聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel polyacrylamide gel electrophoresis,electrophoresis,简称简称PAGE)PAGE)，也称圆盘凝胶电泳或圆盘，也称圆盘凝胶电泳或圆盘电泳电泳(disc gel electrophoresis)(di

34、sc gel electrophoresis)，它是在区带电泳的，它是在区带电泳的基础上发展起来的。它以聚丙烯基础上发展起来的。它以聚丙烯IftIft胺凝胶为支持物，一胺凝胶为支持物，一般制成凝胶柱或凝胶板，凝胶是由相连的二部分组成（小般制成凝胶柱或凝胶板，凝胶是由相连的二部分组成（小的部分是浓缩胶，大的部分是分离胶），这二部分凝胶的的部分是浓缩胶，大的部分是分离胶），这二部分凝胶的浓度（孔径大小）、缓冲液组分和离子强度浓度（孔径大小）、缓冲液组分和离子强度,pH,pH以及电场以及电场强度都是不同的，即不连续的。这样强度都是不同的，即不连续的。这样,电泳时样品首先在电泳时样品首先在不连续的两相

35、间积聚浓缩而成很薄的起始区带（厚度约为不连续的两相间积聚浓缩而成很薄的起始区带（厚度约为0.1 mm0.1 mm），然后再进行电泳分离。），然后再进行电泳分离。PAG PAG是用丙烯酰胺是用丙烯酰胺(acrylamide(acrylamide，Acr)Acr)和交联剂亚甲基和交联剂亚甲基双丙烯酰胺双丙烯酰胺(N(N，N N-methylen-methylen。bisacrylamidebisacrylamide，Bis)Bis)在在催化剂的作用下聚合而成，聚合反应的催化系统有两种。催化剂的作用下聚合而成，聚合反应的催化系统有两种。化学聚合化学聚合:催化剂过硫酸铵催化剂过硫酸铵(AP)(AP)，

36、加速剂，加速剂TEMEDTEMED 光聚合光聚合:催化剂核黄素，加速剂催化剂核黄素，加速剂TEMEDTEMED 不连续不连续PAGEPAGE三种效应：电荷效应、分子筛效应和浓缩三种效应：电荷效应、分子筛效应和浓缩效应效应3.3.毛细管电泳毛细管电泳 毛毛细细管管电电泳泳又又称称毛毛细细管管区区带带电电泳泳，它它是是在在毛毛细细管管（2-75m2-75m）中中装装入入缓缓冲冲液液，从从其其一一端端注注入入样样品品，在在毛毛细细管管两两端端加加高高压压直直流流电电实实现现对对样样品品的的分分离离，分分离离后后的的样样品品依依次次通通过过设设在在毛毛细细管管一一端端的的检检测测器器检检出出。该该法法

37、克克服服了了传传统区带电泳的热扩散和样品扩散的问题，实现了快速和高效分离。统区带电泳的热扩散和样品扩散的问题，实现了快速和高效分离。毛细管电泳是近年来发展起来的一项新技术，被认为是毛细管电泳是近年来发展起来的一项新技术，被认为是9090年代最有影响年代最有影响的分离手段之一。目前已广泛用于氨基酸分析、蛋白质高效分离、指纹图的分离手段之一。目前已广泛用于氨基酸分析、蛋白质高效分离、指纹图谱研究、分离合成的寡核苷酸、谱研究、分离合成的寡核苷酸、DNA DNA序列测定及序列测定及PCRPCR产物的分析鉴定等。产物的分析鉴定等。高效毛细管电泳仪高效毛细管电泳仪high performance capi

38、llary electrophoresis apparatus仪器二、仪器流程与主要部件 process and main assembly 电压：电压：0 030kV30kV；分离柱不涂敷任何固定液；分离柱不涂敷任何固定液；紫外或激光诱导荧光检测器；紫外或激光诱导荧光检测器；（可检测到：（可检测到：1010-19-191010-21-21 mol/L mol/L）1.高压电源（1 1）0 03030 kV kV 稳定、连续可调的直流电源；稳定、连续可调的直流电源；（2 2）具有恒压、恒流、恒功率输出；）具有恒压、恒流、恒功率输出；（3 3）电场强度程序控制系统；）电场强度程序控制系统；（4

39、4）电压稳定性：）电压稳定性：0.1%0.1%；（5 5）电源极性易转换；）电源极性易转换；2.2.毛细管柱毛细管柱（1 1）材料：石英：各项）材料：石英：各项性能好；玻璃：光学、机性能好；玻璃：光学、机械性能差；械性能差；（2 2）规格：内径）规格：内径20207575mm，外径，外径350350400m400m；长度；长度=1m=1m 毛细管结构 毛细管是毛细管是CE分离的心分离的心脏。理想的毛细管必须是电脏。理想的毛细管必须是电绝缘、紫外绝缘、紫外/可见光透明且可见光透明且富有弹性的，目前可以使用富有弹性的，目前可以使用的有玻璃、熔融石英或聚四的有玻璃、熔融石英或聚四氟乙烯塑料等。毛细管

40、内径氟乙烯塑料等。毛细管内径一般为一般为10100m，其截，其截面结构图标意图如左图所示。面结构图标意图如左图所示。紫外吸收 3.缓冲液池 化学惰性，机械稳定性好；4.4.检测器检测器 要求：具有极高灵敏度，可柱端检测；检测器、数据采集与计算机数据处理一体化；类型类型 检测限检测限/mol /mol 特点特点紫外-可见 10-1310-15 加二极管阵列，光谱信息荧光 10-1510-17 灵敏度高，样品需衍生激光诱导荧光 10-1810-20 灵敏度极高，样品需衍生电导 10-1810-19 离子灵敏，需专用的装置；4.4.等电聚焦等电聚焦（isoelectric focusing）原理原理

41、:在在一一定定抗抗对对流流介介质质（如如凝凝胶胶）中中加加入入两两性性电电解解质质载载体体(Ampholyte,是是一一种种多多氨氨基基多多羧羧基基的的混混合合物物，由由异异构构物物和和同同系系物物组组成成，其其pK和和pI值值各各自自相相异异却却又又相相近近），当当直直流流电电通通过过时时，便便形形成成一一个个由由阳阳极极到到阴阴极极pH值值逐逐步步上上升升的的梯梯度度。两两性性化化合合物物在在此此电电泳泳过过程程中中，就就被被浓浓集集在在与与其其pI相相等等的的pH区区域域，从从而使不同化合物能按其各自等电点得到分离。而使不同化合物能按其各自等电点得到分离。应用：应用：高效率分离纯化蛋白质

42、高效率分离纯化蛋白质 测定蛋白质分子量测定蛋白质分子量pH10pH3pI1=pH8pI2=pH7pI3=pH5-+线线性性梯梯度度5.5.聚焦层析（聚焦层析（ChromatofocusingChromatofocusing）该法是在等电点聚焦方法基础上发展起来的，其分离纯化蛋白质的依据是该法是在等电点聚焦方法基础上发展起来的，其分离纯化蛋白质的依据是等电点的差异和离子交换行为。蛋白质按其等电点在等电点的差异和离子交换行为。蛋白质按其等电点在pH梯度环境中进行排列的梯度环境中进行排列的过程叫做聚焦效应。过程叫做聚焦效应。pH梯度的形成梯度的形成(由多缓冲剂和多缓冲交换剂形成由多缓冲剂和多缓冲交换

43、剂形成)是聚焦是聚焦效应的先决条件，如果一种蛋白质加到已形成效应的先决条件，如果一种蛋白质加到已形成pH梯度的层析柱上时梯度的层析柱上时,由于洗脱由于洗脱液的连续流动，蛋白质将迅速地液的连续流动，蛋白质将迅速地 迁移到与它等电点相同的迁移到与它等电点相同的pH处。从此位置开处。从此位置开始，该蛋白质将以缓慢的速度进行吸附、解吸附，直到在等电点始，该蛋白质将以缓慢的速度进行吸附、解吸附，直到在等电点pH时被洗出。时被洗出。在聚焦层析过程中在聚焦层析过程中,一种样品分次加入时，只要先加入者尚未洗出一种样品分次加入时，只要先加入者尚未洗出,并且有一定并且有一定的时间进行聚焦的时间进行聚焦,剩余样品还

44、可以加到柱上剩余样品还可以加到柱上,其聚焦过程都能顺利完成。其聚焦过程都能顺利完成。pH梯度溶液的形成示意图梯度溶液的形成示意图蛋白质蛋白质1（pI=7）蛋白质蛋白质2（pI=8）流速流速移动速率移动速率层析时的聚焦效应示意图层析时的聚焦效应示意图6.离子交换层析离子交换层析（ion-change chromatographyion-change chromatography）原理原理基质基质 疏水型离子交换剂；亲水型离子交换剂疏水型离子交换剂；亲水型离子交换剂应用应用 制备纯化生物物质制备纯化生物物质 定量、定性测定混合物中各组分定量、定性测定混合物中各组分1.平衡阶段平衡阶段:离子交换剂离

45、子交换剂与反离子结合与反离子结合2.吸附阶段：样品与反离吸附阶段：样品与反离子进行交换子进行交换3、4.解吸附阶段：用解吸附阶段：用梯度缓冲溶液洗脱，先梯度缓冲溶液洗脱，先洗下弱吸附物质，后洗洗下弱吸附物质，后洗下强吸附物质下强吸附物质5.再生阶段：用原始平再生阶段：用原始平衡液进行充分洗涤，既衡液进行充分洗涤，既可重复使用可重复使用12345原始缓冲溶原始缓冲溶液的反离子液的反离子样品溶液样品溶液梯度浓度梯度浓度离离子子交交换换层层析析原原理理示示意意图图蛋蛋白白质质浓浓度度洗脱体积洗脱体积带正电荷带正电荷的蛋白质的蛋白质带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质收集样品的管收集样品的管收集样品的管收

46、集样品的管带负电荷带负电荷的蛋白质的蛋白质蛋白质混合物蛋白质混合物玻璃柱玻璃柱带正电荷带正电荷的蛋白质的蛋白质带负电荷带负电荷的蛋白质的蛋白质带正电荷带正电荷的蛋白质的蛋白质收集样品的管收集样品的管NaClNaCl梯度梯度梯梯度度混混合合器器凝胶颗粒凝胶颗粒蛋白质混合物蛋白质混合物大分子大分子小分子小分子储液瓶储液瓶混合瓶混合瓶层层析析柱柱磁力搅拌器磁力搅拌器洗脱剂体积（洗脱剂体积（mL）洗洗脱脱剂剂浓浓度度简单型梯度混合器简单型梯度混合器梯度洗脱曲线梯度洗脱曲线洗脱剂体积（洗脱剂体积（mL）洗洗脱脱剂剂浓浓度度储液瓶储液瓶混混合合瓶瓶复合型梯度混合器复合型梯度混合器梯度洗脱曲线梯度洗脱曲线凸

47、形凸形线形线形凹形凹形常用的阳离子交换剂常用的阳离子交换剂离子交换剂离子交换剂 可电离基团可电离基团 可电离基团结构可电离基团结构CM-纤维素（弱酸型）纤维素（弱酸型）羧甲基羧甲基P-纤维素（中强弱酸型）纤维素（中强弱酸型）磷酸基磷酸基SE-纤维素（强弱酸型）纤维素（强弱酸型）磺乙基磺乙基SP-纤维素（强弱酸型）纤维素（强弱酸型）磺丙基磺丙基常用的阴离子交换剂常用的阴离子交换剂AE-纤维素（弱减型）纤维素（弱减型）氨基乙基氨基乙基离子交换剂离子交换剂 可电离基团可电离基团 可电离基团结构可电离基团结构PAB-纤维素（弱减型）纤维素（弱减型）对氨基苯甲酸对氨基苯甲酸DEAE-纤维素纤维素 二乙基

48、氨基乙基二乙基氨基乙基DEAE-Sephadex 二乙基氨基乙基二乙基氨基乙基DEAE-纤维素（强减型）纤维素（强减型）二乙基氨基乙基二乙基氨基乙基QAE-纤维素（强减型）纤维素（强减型）二乙基（二乙基（2-羟丙羟丙基）基）-氨基乙基氨基乙基（中弱减型）（中弱减型）（中弱减型）（中弱减型）（四）利用选择性吸附的纯化方法 1.羟磷灰石层析 2.疏水作用层析 某些称为吸附剂的固体物质具有吸附能力，能够将其他种类的某些称为吸附剂的固体物质具有吸附能力，能够将其他种类的分子吸附在自己的表面，吸附力的强弱因被吸物质的性质而异。分子吸附在自己的表面，吸附力的强弱因被吸物质的性质而异。吸附过程涉及范德华相互

49、作用和氢键这些非离子吸引力。吸附吸附过程涉及范德华相互作用和氢键这些非离子吸引力。吸附层析就是利用待纯化的分子和杂质分子与吸附剂之间的吸附能层析就是利用待纯化的分子和杂质分子与吸附剂之间的吸附能力和解吸性质不同而达到分离目的的。典型的吸附剂有硅胶、力和解吸性质不同而达到分离目的的。典型的吸附剂有硅胶、氧化铝和活性炭等。氧化铝和活性炭等。1.羟磷灰石层析吸附剂羟磷灰石即结晶磷酸钙，它用于分离蛋白质或核酸。吸附剂羟磷灰石即结晶磷酸钙，它用于分离蛋白质或核酸。羟磷灰石的吸附机制尚不完全清楚，但认为与其表面上的钙羟磷灰石的吸附机制尚不完全清楚，但认为与其表面上的钙离子和磷酸根有关，涉及偶极离子和磷酸根

50、有关，涉及偶极-偶极相互作用，可能还有静电偶极相互作用，可能还有静电吸引。吸引。据推测，蛋白质中带负电基团与羟磷灰石晶体表面的钙离子据推测，蛋白质中带负电基团与羟磷灰石晶体表面的钙离子结合，而带正电基团与磷酸基相互作用。羟磷灰石层析最重结合，而带正电基团与磷酸基相互作用。羟磷灰石层析最重要的用途之一是把单链要的用途之一是把单链DNADNA和双链和双链DNADNA分开。羟磷灰石对双链分开。羟磷灰石对双链DNADNA亲和力很大，以致用羟磷灰石层析能从含亲和力很大，以致用羟磷灰石层析能从含RNARNA和蛋白质的和蛋白质的细胞提取液中选择性地除去细胞提取液中选择性地除去DNADNA羟磷灰石对蛋白质的吸